茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒釀造大曲及環(huán)境中可培養(yǎng)細菌多樣性及功能分析

任愛容,黃永光,*,涂華彬

(1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽 550025;2.貴州茅臺酒廠(集團)習(xí)酒有限責(zé)任公司,貴州 習(xí)水 564622)

中國白酒品種繁多,其風(fēng)格和香型也有所不同,醬香型白酒是中國傳統(tǒng)白酒的典型香型之一,以貴州茅臺酒為代表,深受消費者的歡迎[1-2]。醬香型白酒的生產(chǎn)屬于傳統(tǒng)釀造,是多菌種自然固態(tài)雙邊發(fā)酵過程,發(fā)酵產(chǎn)率、質(zhì)量與釀造過程的微生物密切相關(guān)。其釀造涉及的微生物主要包括細菌、霉菌、酵母和放線菌。其中,細菌是重要的功能微生物菌群,可代謝多種酶類并產(chǎn)生豐富的酒體香味物質(zhì)和其前體物質(zhì)[3],賦予酒體醬香突出、優(yōu)雅細膩、酒體醇厚、回味悠長、空杯留香持久的獨特風(fēng)格[1,4]。因此,對其細菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性的系統(tǒng)性研究及其功能分析,是充分認識其釀造微生物資源、解析醬香型白酒發(fā)酵機理、提升產(chǎn)品質(zhì)量的前提和基礎(chǔ)。

醬香型白酒釀造微生物主要來源于添加的大曲和釀造環(huán)境富集[5-6],其中,高溫大曲素有細菌曲之說,與產(chǎn)品風(fēng)味特征密切相關(guān),前人也對其中的可培養(yǎng)微生物開展了一系列的研究,如Wang Changlu等[7]通過表型及傳統(tǒng)可培養(yǎng)法對大曲生產(chǎn)發(fā)酵過程的微生物進行了分離鑒定,發(fā)現(xiàn)4 種細菌及5 種酵母,結(jié)果表明Bacillus spp.和Saccaromyces spp.是各自的優(yōu)勢種屬。吳徐建[1]通過可培養(yǎng)結(jié)合分子鑒定手段,追蹤研究醬香型白酒2～7輪次釀造大曲與酒醅中的細菌群落結(jié)構(gòu),并分析了不同細菌種屬對醬香風(fēng)味物質(zhì)形成的貢獻,及優(yōu)勢細菌解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的功能,結(jié)果表明細菌產(chǎn)生的豐富酶系能夠降解釀造原料中的大分子物質(zhì),為窖池發(fā)酵生香提供部分前體物質(zhì)。上述研究主要集中于單一酒廠或單一輪次的生產(chǎn)大曲,所獲得的菌株有限,同時也無法全面表征大曲中的細菌菌群結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律。醬香型白酒的特殊風(fēng)格還得益于其得天獨厚的釀造環(huán)境,如“離開茅臺,釀不出茅臺酒”。目前對于醬香型白酒釀造環(huán)境微生物的研究較少,尤其對茅臺鎮(zhèn)釀造環(huán)境微生物的研究。僅有,張亞麗[2]通過可培養(yǎng)手段對茅臺鎮(zhèn)空氣中的微生物菌種進行可培養(yǎng)分析鑒定,發(fā)現(xiàn)空氣中的優(yōu)勢細菌屬為芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、微球菌屬和鏈霉菌屬。王雪山[5]利用高通量測序技術(shù)對清香型白酒釀造環(huán)境微生物開展研究,發(fā)現(xiàn)環(huán)境微生物的改變會驅(qū)動白酒發(fā)酵過程微生物的演替。但高通量測序技術(shù)并不能充分認識和獲取其中的可培養(yǎng)微生物資源及其主要功能,特別是一些關(guān)鍵功能微生物。因此,可培養(yǎng)技術(shù)仍然是充分認識復(fù)雜微生物體系中的關(guān)鍵微生物的支撐[8]。

為系統(tǒng)性揭示茅臺鎮(zhèn)醬香白酒釀造體系的內(nèi)在生態(tài)資源及其核心機制,解析不同輪次醬香白酒釀造微生物菌群內(nèi)部可培養(yǎng)菌群結(jié)構(gòu)及其差異,研究環(huán)境和大曲中可培養(yǎng)細菌之間關(guān)聯(lián)性及其對釀造生產(chǎn)的潛在性調(diào)控機制。本研究主要對茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒釀造環(huán)境(7 個主要釀造區(qū)域)及其生產(chǎn)大曲(1～7輪次,2018—2019釀造年度)中的可培養(yǎng)細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及其功能進行解析,旨在揭示茅臺鎮(zhèn)釀酒區(qū)域性可培養(yǎng)細菌的多樣性特征及其功能,并建立微生物生態(tài)資源庫,為后續(xù)研究醬香型白酒微生物奠定基礎(chǔ),也為醬香型白酒生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

大曲樣品為茅臺鎮(zhèn)7 個主要釀造區(qū)域內(nèi)的17 個釀酒企業(yè)釀造車間生產(chǎn)用大曲粉,取各企業(yè)釀造現(xiàn)場用曲粉500 g(己混勻曲粉,2018—2019釀造年度1～7輪次釀造用大曲,取樣時間2018年1—9月),樣品取樣后用干凈自封袋包裝,運回實驗室備用,共計119 個大曲樣品。

環(huán)境樣品取樣點包括酒廠生產(chǎn)車間的晾堂地面、窗臺、墻面、墻角、窗戶玻璃、行車梯梯子及行車梯頂部、配電箱表面、消防箱表面、尾酒儲酒罐及其他一些平時不易被打掃的角落等地面、表面灰塵,一個企業(yè)收集取混合樣500 g,取樣后均勻混合為一個樣品(取樣時間同前述,共取1～7輪次釀造生產(chǎn)環(huán)境樣品119 個)。

取樣過程每個取樣點1～7輪次均固定為同一點(每個取樣點作固定標(biāo)記,以防被破壞),每輪次采集樣品時間為2 d,所采集樣品均用無菌自封袋包裝、專用箱轉(zhuǎn)運,樣品采集完立即運回實驗室分析,留存樣低溫保存。

1.1.2 試劑

營養(yǎng)瓊脂(nutrient agar,NA)培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基 上海博微生物科技有限公司;TAE(50×)北京索萊寶科技有限公司;瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)有限公司;核酸染料(GenGreen) 上海賽百盛有限公司;DL2000 Marker 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺 蘇州金凈科技有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫鼓風(fēng)干燥箱、臺式高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司;恒溫培養(yǎng)箱 上海瑯軒實驗設(shè)備有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;恒溫調(diào)速搖床 上海杜科自動化設(shè)備有限公司;電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;旋渦混合器海門市其林貝爾儀器制造有限公司;冰箱(-20 ℃)青島海爾股份有限公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國伯樂公司;DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠;JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化

在無菌條件下,稱取10 g樣品放入裝有90 mL生理鹽水及少許玻璃珠的三角瓶內(nèi),室溫下120 r/min振蕩混勻30 min后,依次稀釋為10-4、10-5、10-6和10-7梯度樣品懸液,各稀釋度取0.2 mL均勻涂布于NA培養(yǎng)基上,各稀釋度做3 個平行,最后將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。根據(jù)菌株生長狀況選擇合適的梯度,根據(jù)菌落的大小、形態(tài)、顏色等形態(tài)學(xué)特征挑取不同的單菌落,并劃線純化培養(yǎng)3 次。將純化培養(yǎng)的單細菌用1.5 mL的甘油管保藏(3 管),保存液為40%甘油和菌懸液以1∶1的比例混合均勻,-80 ℃保藏。

1.3.2 菌株DNA提取

將菌株接種于LB肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃、140 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h,用TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒提取菌株DNA,置于-20 ℃?zhèn)溆?。菌株DNA提取參考TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒的操作說明書。

1.3.3 16S rDNA PCR擴增及凝膠電泳

細菌PCR擴增引物:27F(5’-AGAGTTTGATCC TGGCTCA-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3’)。PCR體系:細菌DNA 2 μL,27F 1 μL,1492R 1 μL,Mastermix 12.5 μL,d d H2O 8.5 μ L,總計2 5 μ L反應(yīng)體系。P C R條件:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35 個循環(huán);72 ℃再延伸10 min。

凝膠電泳:1%瓊脂糖凝膠,1×TAE電泳緩沖液,核酸染料(GenGreen)10 μL,PCR產(chǎn)物進樣量5 μL,電壓50 V,電泳時間40 min。

1.3.4 DNA測序

將大小合適和條帶清晰的PCR擴增產(chǎn)物送檢生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析。

1.3.5 同源性分析

根據(jù)測序所得的產(chǎn)物序列,登陸NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast),提交到GenBank,用BLAST進行同源性比較分析。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

根據(jù)晉方佑等[9]方法,采用分離頻率(isolation frequency,IF)比較判斷可培養(yǎng)細菌的優(yōu)勢菌群。IF為分離到的某一指定類型微生物的菌株數(shù)占該樣品分離總的微生物菌株數(shù)的百分率。

采用Shannon-Wiener指數(shù)(H’)和Simpson指數(shù)(D)為物種豐富度指數(shù),分析獲得的可培養(yǎng)細菌群落生物多樣性,Pielou指數(shù)(J)分析群落物種分布的均勻程度。公式如下:

式中:Pi為菌種i的個體在全部個體中的比例;S為總物種數(shù)。

采用Sorenson相似性指數(shù)(CS)比較兩樣本間細菌種類組成的相似程度。如式(4)所示:

式中:j為兩類樣本的共有種數(shù)或?qū)贁?shù);a、b分別為待比較的環(huán)境樣本和大曲樣本各自含有的物種數(shù)。

根據(jù)IF在Origin 9.0中繪制柱狀圖和折線圖,在R語言中繪制氣泡圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)細菌多樣性分析

從不同釀造輪次環(huán)境及生產(chǎn)用大曲樣品中共分離獲得1 370 株細菌,其中大曲樣品657 株,環(huán)境樣品713 株。經(jīng)菌落形態(tài)相似性感官初篩,獲得302 株菌并將其16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物送外檢測序,測序結(jié)果經(jīng)NCBI序列比對,結(jié)果表明送檢細菌在分類水平上歸屬于5 個門的28 個屬下的59 個種。大曲樣品中有34 個種,環(huán)境樣品中有44 個種。其中,Bacillus solani、B.gottheilii、B.paralicheniformis、Brevibacillus agri、Pseudomonas xanthomarina、Lelliottia nimipressuralis、Aureimonassp.、Sphingobacterium daejeonense、Oceanobacillus indicireducens、Cronobacter sakazakii、Mixta gaviniae、Paraburkholderia fungorum、Viridibacillus arvi、Atlantibacter hermannii鮮見在醬香白酒釀造領(lǐng)域報道。

為進一步統(tǒng)計分析所分離細菌在大曲和環(huán)境樣本中的總體關(guān)聯(lián)度及其具體分布,計算大曲與環(huán)境樣品中可培養(yǎng)細菌的多樣性指數(shù)(表1),圖1為大曲與環(huán)境樣品中可培養(yǎng)細菌的菌群類別。

表1 大曲樣品與環(huán)境樣品中可培養(yǎng)細菌的多樣性指數(shù)Table 1 Diversity indexes of culturable bacteria in Daqu and environmental samples

從表1可知,大曲與環(huán)境樣品中的細菌種類組成相似程度(Sorenson指數(shù))略低(0.46),而大曲樣品的物種多樣性(Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù))低于環(huán)境樣品,但其物種分布均勻度(Pielou指數(shù))高于環(huán)境樣品。由此可知,環(huán)境樣品的細菌多樣性較大曲樣品豐富,這為大曲開放式制曲網(wǎng)絡(luò)微生物菌群提供了環(huán)境微生物來源基礎(chǔ)。

如圖1A、B所示,Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Bacillussp.、Lysinibacillus fusiformis、Micrococcussp.、B. subtilissubsp.subtilis、Virgibacillussp.、Bacillus velezensis、Bacillus megaterium、B. agri、M. gaviniae、Staphylococcussp.、C. sakazakii、Acinetobacter lwoffii、B. paralicheniformis在大曲中的IF在2.13%～13.70%之間,其總計IF達到86.00%,為大曲樣品中的優(yōu)勢細菌;高溫大曲在制曲發(fā)酵過程中其溫度可高達65 ℃左右,上述細菌在高溫條件下依然大量存活,證明這些優(yōu)勢細菌是經(jīng)過釀造過程長期馴化后穩(wěn)定留存下來的釀造資源。

同樣,如圖1A、C所示,Alcaligenes faecalis、Bacillussp.、B. amyloliquefaciens、B. licheniformis、Bacillus tequilensis、Micrococcussp.、bacterium strain、B. subtilis、B. subtilissubsp.subtilis、Staphylococcus saprophyticus、B. velezensis、uncultured bacterium在環(huán)境樣品中的IF在2.10%～13.18%之間,其總計IF達到81.07%,為環(huán)境樣品中的優(yōu)勢細菌。細菌是構(gòu)成茅臺鎮(zhèn)釀造環(huán)境微生物的重要來源,尤其是耐高溫芽孢桿菌,由于長期的釀酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展導(dǎo)致其低空發(fā)布生態(tài)微生物的富集和結(jié)構(gòu)優(yōu)化。張亞麗[2]通過對茅臺鎮(zhèn)空氣中細菌的篩選與鑒定,獲得了B. subtilissubsp.subtilis、B. amyloliquefaciens、B. megaterium等可培養(yǎng)細菌,而本研究的大曲與環(huán)境樣品也分離到了與此相同的可培養(yǎng)細菌?？梢?釀造環(huán)境的細菌不僅來自于茅臺鎮(zhèn)的空氣環(huán)境,還來自于酒廠的地面環(huán)境,這主要為長期釀造產(chǎn)生的曲粉等物料飛揚與空氣物質(zhì)的交互作用。

圖1 大曲與環(huán)境樣品可培養(yǎng)細菌菌群結(jié)構(gòu)Fig. 1 Culturable bacterial community structure of Daqu and environmental samples

通過圖1A可知,從大曲和環(huán)境樣品中檢出共有細菌19 個種,占檢出總細菌種數(shù)的32.20%,其中Bacillus sp.、B. licheniformis、B. subtilis、Micrococcus sp.、B. subtilis subsp. subtilis、B. velezensis為大曲與環(huán)境樣品中共有的優(yōu)勢細菌種類,而且相對穩(wěn)定,極可能為醬香白酒釀造可培養(yǎng)核心微生物,其功能需進一步研究分析、論證。

菌群多樣性作為群落穩(wěn)定性的一種指標(biāo)[10]。一般認為群落的結(jié)構(gòu)越復(fù)雜,多樣性越高,而上述結(jié)論也說明,大曲與環(huán)境樣品的細菌菌群結(jié)構(gòu)在組成上有所不同,但在主要優(yōu)勢類群上又保持一定的相似性和穩(wěn)定性,更進一步說明醬香型白酒在長期釀造過程中大曲與環(huán)境中的細菌菌群結(jié)構(gòu)存在相互遷移和交互富集現(xiàn)象。

2.2 不同釀造輪次可培養(yǎng)細菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性差異及其變化

為了進一步分析大曲和環(huán)境樣品中可培養(yǎng)細菌的多樣性差異,對所采集的不同釀造輪次樣品中可培養(yǎng)細菌的分離鑒定結(jié)果進行多樣性指數(shù)分析,分析其多樣性變化和差異,結(jié)果見圖2。

圖2 各輪次大曲與環(huán)境樣品中可培養(yǎng)細菌的多樣性指數(shù)變化Fig. 2 Changes in diversity indexes of culturable bacteria in Daqu and environmental samples from each round of fermentation

從圖2A、B可看出,大曲樣品中的細菌物種多樣性變化為:Shannon-Wiener指數(shù)在1～2輪次緩慢上升,Simpson指數(shù)趨于平穩(wěn);在2～7輪次中,Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)變化規(guī)律一致,2、3輪次為下降過程,3、4輪次穩(wěn)定上升,4～6輪次連續(xù)緩慢下降,6、7輪次緩慢回升。環(huán)境樣品中的細菌物種多樣性變化為:Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)在1～7輪次過程中變化規(guī)律呈現(xiàn)出一致性,1、2輪次呈緩慢上升,2、3輪次趨于穩(wěn)定,3、4輪次為下降過程,到4、5輪次穩(wěn)定上升,在5、6輪次保持最高值,7輪次呈大幅下降到1輪次的水平。由圖2C可知,4輪次環(huán)境樣品中的物種分布均勻度(Pielou指數(shù))最低?？梢?輪次可能為環(huán)境樣品細菌多樣性的轉(zhuǎn)折點,在此前后2輪次其多樣性都穩(wěn)定保持在較高水平。相反,在大曲樣品中,細菌多樣性在4輪次達到最高水平。大曲樣品中細菌多樣性除在4輪次與7輪次略高于環(huán)境樣品外,其他輪次均小于環(huán)境樣品。實踐生產(chǎn)中3～5輪次的出酒率高且酒質(zhì)好,但其物種多樣性卻并非保持一致,而是有高有低,波動極大,這可能與釀造物料形態(tài)、釀造參數(shù)變化及其整體微生物菌群結(jié)構(gòu)有關(guān),其具體機制正在開展進一步的研究。同時也表明物種多樣性反映的是微生態(tài)結(jié)果,產(chǎn)酒產(chǎn)質(zhì)量體現(xiàn)的是核心微生物結(jié)構(gòu)問題,即微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)雖然豐富但不一定協(xié)調(diào),同時也說明真正要豐產(chǎn)和高質(zhì)還得看釀酒核心微生物結(jié)構(gòu)及其豐度。

通過上述分析表明,優(yōu)勢度大的可培養(yǎng)細菌基本都歸于幾個屬,因此,為進一步尋找其可培養(yǎng)細菌中的核心菌群,本研究通過氣泡圖分析可培養(yǎng)細菌在各輪次樣品中的分布及菌群結(jié)構(gòu)演替規(guī)律。

圖3 屬水平上各輪次大曲及環(huán)境樣品中可培養(yǎng)細菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性Fig. 3 Structural diversity of culturable bacteria communities in of Daqu and environmental samples from each round of fermentation

如圖3所示,在屬水平上各輪次大曲和環(huán)境樣品中的細菌菌群優(yōu)勢度及多樣性分布特征明顯。在1～7輪次大曲樣品中一共檢出18 個屬,分別為8、11、8、11、10、5、8 個屬。從1～7輪次環(huán)境樣品中一共檢出24 個屬,各輪次分別為9、8、9、12、14、16、9 個屬。

將在樣本中分布頻率較大并普遍存在的微生物菌群作為核心微生群,是尋找復(fù)雜發(fā)酵體系中的核心微生物菌群的方法[11-13]。如圖3所示,在屬水平上各輪次大曲和環(huán)境樣品中的細菌菌群優(yōu)勢度及多樣性分布特征明顯,在大曲樣品中Bacillus、Lysinibacillus、Staphylococcus和Micrococcus穩(wěn)定分布于6 個輪次以上的樣品中,其分布頻率大且優(yōu)勢度高。結(jié)合圖1分析,大曲樣品中優(yōu)勢可培養(yǎng)細菌均包含在Bacillus、Lysinibacillus、Staphylococcus、Micrococcus、Alcaligenes這5 個屬中。Bacillus包括B. subtilis、B. licheniformis、Bacillussp.、B. subtilissubsp.subtilis、B. velezensis、B. megaterium和B. paralicheniformis,可知Bacillus屬內(nèi)的優(yōu)勢細菌不僅優(yōu)勢度大且種類多;Lysinibacillus下的L. fusiformis優(yōu)勢度大并分布在6 個輪次的大曲樣品中;而Staphylococcus下的Staphylococcussp.和Micrococcus下的Micrococcussp.也都分布在6 個輪次的大曲樣品中。由此表明,Bacillus、Lysinibacillus、Staphylococcus和Micrococcus為大曲樣品中可培養(yǎng)核心細菌屬;同理,將Bacillus、Staphylococcus、Micrococcus和Alcaligenes以及暫未鑒定明確的未知細菌屬列為環(huán)境樣品中可培養(yǎng)的核心細菌屬;Bacillus、Staphylococcus和Micrococcus列為大曲和環(huán)境樣品共有的可培養(yǎng)核心微生物屬。將其結(jié)果與其他地區(qū)白酒釀造過程中優(yōu)勢細菌屬及核心細菌屬比較,發(fā)現(xiàn)其主要細菌菌群結(jié)構(gòu)差異會伴隨地域性差異而發(fā)生,如,周瑞平等[14]對四川濃香型白酒廠內(nèi)可培養(yǎng)細菌多樣性的研究發(fā)現(xiàn),其優(yōu)勢細菌屬為Bacillus、Lysinibacillus、Staphylococcus、Rummeliibacillus、Brevibacillus和Brachybacterium;王鵬等[11]對江蘇某些酒廠的微生物進行研究發(fā)現(xiàn)其核心細菌屬為Bacillus、Lactobacillus和Lactococcus;以上結(jié)論表明,區(qū)域性核心微生物的結(jié)構(gòu)差異性是導(dǎo)致各區(qū)域釀酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展和釀造酒體征特風(fēng)味差異的重要原因之一。

另外,從圖3還可看出,Firmicutes和Proteobacteria為整個釀造過程中可培養(yǎng)細菌的優(yōu)勢菌門,且Firmicutes在大曲中的優(yōu)勢度比在環(huán)境樣品中的優(yōu)勢度高,而該門下的Bacillus與Staphylococcus在連續(xù)7 個輪次的大曲和環(huán)境樣品中都處于優(yōu)勢地位,其中Bacillus為絕對優(yōu)勢菌屬,該結(jié)論與其他文獻報道結(jié)果一致[2,6],同時也與本課題組對同批樣品微生物結(jié)構(gòu)的宏基因組學(xué)分析結(jié)果一致。Bacillus為傳統(tǒng)釀造過程中的優(yōu)勢菌群和功能菌群,是白酒發(fā)酵過程中風(fēng)味演替的主要動力[11]。上述結(jié)論表明,醬香白酒釀造過程各輪次大曲與環(huán)境的菌群結(jié)構(gòu)具有較好的互動性,在其主要功能細菌菌群結(jié)構(gòu)演替中仍然保持一致性,這也進一步說明環(huán)境微生物是醬香型白酒釀造過程中微生物的重要來源之一,因此對其功能進一步分析十分重要。

2.3 可培養(yǎng)細菌產(chǎn)酶及金屬離子吸附性功能分析

細菌對白酒釀造過程基礎(chǔ)酒體的風(fēng)格、酒體風(fēng)味物質(zhì)起著極大的調(diào)控作用,此外,細菌還為白酒釀造過程提供了環(huán)境凈化的功能作用[15]。為研究可培養(yǎng)優(yōu)勢細菌的功能,基于大曲與環(huán)境樣品中可培養(yǎng)細菌,在種水平上對可培養(yǎng)核心細菌屬下的優(yōu)勢細菌種進行了產(chǎn)酶和金屬離子的吸附性能分析,為其下一步精準(zhǔn)鑒定其可培養(yǎng)核心細菌菌群及其功能研究提供依據(jù)和奠定基礎(chǔ)。

表2 大曲樣品中優(yōu)勢細菌的功能總結(jié)分析Table 2 Functions of dominant bacteria in Daqu samples

由表2可知,僅存在于大曲樣品中的可培養(yǎng)優(yōu)勢細菌可代謝豐富的酶系。B. megaterium可產(chǎn)纖維素酶等酶,其代謝纖維素酶可催化β-1,4-糖苷鍵水解,可將纖維素降解為纖維二糖和葡萄糖[26]。在釀造過程B. megaterium可降解大曲原料、高粱原料,有利于制曲過程微生物的生長和富集。此外,L. fusiformis具有產(chǎn)蛋白酶和氨基酸酶的功能。而蛋白酶能夠水解醬香大曲中的蛋白質(zhì),一方面其產(chǎn)物為微生物生長提供營養(yǎng)物質(zhì),另一方面形成的氨基酸與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng),為白酒香味提供前體物質(zhì)[26]。Staphylococcussp.可代謝產(chǎn)脂肪酶,脂肪酶能水解長鏈脂肪酸甘油生成游離脂肪酸和甘油,生成的產(chǎn)物構(gòu)成了白酒中香味物質(zhì)的本身或者前驅(qū)物質(zhì)[26]。大曲中的優(yōu)勢細菌還有對金屬的吸附性,主要有B. megaterium和L. fusiformis,可吸附的金屬離子分別為Au3+和Cr6+。以上結(jié)果表明,存在于大曲樣品中的可培養(yǎng)優(yōu)勢細菌以產(chǎn)酶功能為主,且以富集白酒風(fēng)味的酶系居多。其菌株具體的代謝酶類和風(fēng)味成分正在開展進一步的研究工作。

表3 環(huán)境樣品中優(yōu)勢細菌的功能總結(jié)分析Table 3 Functions of dominant bacteria in environmental samples

從表3可知,存在于環(huán)境樣品中的優(yōu)勢細菌有4 種具有產(chǎn)酶功能,占比為67%,33%的菌株暫未發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)酶特性。可見,存在于環(huán)境樣品中的可培養(yǎng)優(yōu)勢細菌也具有豐富的代謝酶類,可代謝產(chǎn)10 種酶類,分別為蛋白酶、淀粉酶、漆酶、果膠酶、木聚糖酶、脂肪酶、D-氨基酰化酶、腈水解酶、纖維素酶和植酸酶,其中以蛋白酶及纖維素酶類為主,不同的代謝酶類共同構(gòu)成了釀酒環(huán)境中繁雜的酶系結(jié)構(gòu)。此外,具有吸附金屬特性的菌株分別是B. amyloliquefaciens和S. saprophyticus,可吸附金屬離子Cr6+、Pb2+和Cu2+。

表4 大曲和環(huán)境樣品中共有優(yōu)勢細菌功能總結(jié)分析Table 4 Functions of dominant bacteria common to Daqu and environmental samples

表4為大曲和環(huán)境樣品中共有的6 種優(yōu)勢細菌,結(jié)果表明其全部菌株都具有產(chǎn)酶功能。從所產(chǎn)酶類看,主要為蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶類,而這幾大酶類正是白酒釀造的重要酶結(jié)構(gòu)。從原料的降解到酒體風(fēng)味物質(zhì)的形成都與這四大酶系息息相關(guān)。對金屬具有吸附性的菌株有3 種,占比為50%,分別為B. licheniformis、Bacillussp.和B. subtilis,其中B. subtilis對金屬離子吸附能力最強,其吸附金屬離子的種類達7 種。由此說明,茅臺鎮(zhèn)釀造環(huán)境之所特殊,一方面是由于環(huán)境中富集了大量細菌及其具有代謝釀造酶類的多樣性潛質(zhì),不但可降解發(fā)酵底物,促進發(fā)酵和生香,同時也降解了環(huán)境中對釀造體系構(gòu)成污染威脅的一些大分子物質(zhì);另外,由于環(huán)境中有較多的細菌具有金屬離子吸附性,將工業(yè)化、水體等所難以避免而帶入的重金屬離子通過微生物吸附降解方式除去,凈化釀造環(huán)境,從而為醬香白酒釀造提供了良好的宏觀與微觀環(huán)境,促進了產(chǎn)品品質(zhì)的提升、產(chǎn)品安全性和微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

通過傳統(tǒng)可培養(yǎng)和分子生物學(xué)鑒定方法,對茅臺鎮(zhèn)2018—2019釀造年度1～7輪次大曲及環(huán)境樣品中可培養(yǎng)細菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及其功能開展研究。從樣品中共分離得1 370 株細菌,鑒定歸屬于5 個門、28 個屬和59 種細菌。所分離獲得菌株B. solani、B. gottheilii、B. paralicheniformis、B. agri、P. xanthomarina、L. nimipressuralis、Aureimonassp.、S. daejeonense、O. indicireducens、C. sakazakii、M. gaviniae和P. fungorum鮮見在醬香白酒釀造過程檢出和報道。同時,優(yōu)勢度高的可培養(yǎng)細菌高度集中在Bacillus、Lysinibacillus、Staphylococcus、Micrococcus和Alcaligenes這5 個屬里。細菌屬分布頻率和優(yōu)勢度表明,Bacillus、Lysinibacillus、Staphylococcus和Micrococcus為釀造大曲中的核心可培養(yǎng)細菌屬,Bacillus、Staphylococcus、Micrococcus和Alcaligenes為環(huán)境中的核心可培養(yǎng)細菌屬,Bacillus、Staphylococcus和Micrococcus為大曲和環(huán)境樣品中共有的可培養(yǎng)核心細菌屬;核心細菌屬下優(yōu)勢細菌的功能分析表明,各輪次大曲與環(huán)境中的細菌菌群結(jié)構(gòu)雖有差異性,但主要功能細菌菌群結(jié)構(gòu)及其演替基本保持一致。大曲和環(huán)境樣品中的優(yōu)勢細菌都具有產(chǎn)豐富酶系的功能,且具有較強的金屬離子吸附降解功能,說明可培養(yǎng)優(yōu)勢細菌一方面為茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒釀造提供了豐富的生物性資源、豐富的釀造酶系結(jié)構(gòu),調(diào)控重要風(fēng)味形成;另一方面為高品質(zhì)的醬香白酒釀造提供了凈化、安全的基礎(chǔ)環(huán)境條件。本研究為茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒釀造建立可培養(yǎng)細菌資源庫奠定了基礎(chǔ),為后續(xù)專項研究提供了參考,同時對茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒的產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了科學(xué)的微生物理論支撐。