兩階段調(diào)控葡萄糖質(zhì)量濃度強(qiáng)化赤蘚糖醇發(fā)酵的研究

劉金龍，孫錫友，趙國(guó)群*，王 勇，白 敬，孫 旭

（1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050000；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050000）

赤蘚糖醇是一種天然的四碳多元醇，化學(xué)名是1,2,3,4-丁四醇，分子式為C4H10O4，作為低熱量功能性甜味劑已經(jīng)使用了幾十年[1-2]，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥及飼料行業(yè)。據(jù)2017年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的全球糖尿病地圖（第8版）顯示，全球約4.25億人罹患糖尿病，這一數(shù)據(jù)還在急速增長(zhǎng)，而赤蘚糖醇誘導(dǎo)胰島素水平變化非常有限，是糖尿病患者理想的甜味劑[3-4]。

微生物發(fā)酵是赤蘚糖醇當(dāng)前主要生產(chǎn)方法[5-6]。利用特定菌種如出芽短梗霉菌（Aureobasidium pullulsns）、木蘭假絲酵母（Candida magnoliae）、圓酵母（Torulasp.），Pseudozyma tsukubaensis，變異三角酵母（Trigonopsis variabilis），毛孢子菌屬（Trichosporonsp.）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）等可高效合成赤蘚糖醇[7-12]。

赤蘚糖醇、甘露醇、甘油等在微生物細(xì)胞內(nèi)通常充當(dāng)平衡細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的抗?jié)B物質(zhì)。在利用耐高滲酵母發(fā)酵合成赤蘚糖醇過(guò)程中，赤蘚糖醇作為細(xì)胞對(duì)抗?jié)B透壓的物質(zhì)而產(chǎn)生，基于此生理特性，可以通過(guò)提供滲透壓脅迫來(lái)促進(jìn)赤蘚糖醇的合成[13-15]。ANDREISHCHEVA E N等[16]通過(guò)添加NaCl來(lái)改變發(fā)酵體系中的滲透壓，從而提高了赤蘚糖醇產(chǎn)量。楊利博等[17]將甘油作為碳源用于赤蘚糖醇發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度甘油產(chǎn)生的滲透壓脅迫可以提高赤蘚糖醇的產(chǎn)量。高濃度的葡萄糖也可通過(guò)碳源供給和滲透壓脅迫雙重作用于解脂耶氏酵母合成赤蘚糖醇的過(guò)程[18-19]，基于此原理，該研究通過(guò)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方面分析，優(yōu)化葡萄糖的添加策略，為提高赤蘚糖醇的發(fā)酵效率，降低工業(yè)生產(chǎn)成本提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）JZ-204：河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心保藏菌種。

1.1.2 化學(xué)試劑

酵母浸粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；玉米漿干粉（生化試劑）：天津市利發(fā)隆化工科技有限公司；一水合葡萄糖（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；尿素（分析純）：天津歐博凱化工有限公司；甘露醇（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；赤蘚糖醇（分析純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

搖瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L，酵母膏10 g/L，尿素1 g/L，pH自然。

搖瓶二級(jí)種子培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L，酵母膏10 g/L，尿素1 g/L，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿粉15.0 g/L，酵母膏3.0 g/L，尿素0.1 g/L，pH自然，葡萄糖質(zhì)量濃度根據(jù)需求添加。

培養(yǎng)基滅菌條件：使用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

5L發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；UV-6000PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；SK-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；MJ-54A高壓滅菌鍋：施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；LG16-A高速離心機(jī)：北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；S-10生物傳感器分析儀：深圳市希爾曼科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

一級(jí)種子培養(yǎng)：從斜面試管取一菌環(huán)接種于搖瓶中，裝液量100 mL/500 mL，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，30 ℃培養(yǎng)24 h。

二級(jí)種子培養(yǎng)：從培養(yǎng)好的一級(jí)種子搖瓶中，按10%接種量接種于二級(jí)種子搖瓶，裝液量100 mL/500 mL，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，30 ℃培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵罐裝液量3.5 L/5 L，轉(zhuǎn)速500 r/min，30 ℃，通氣量為3.5 L/min，初始pH自然。從培養(yǎng)好的二級(jí)種子搖瓶中，按10%接種量接種于發(fā)酵罐，培養(yǎng)至葡萄糖耗盡或216 h發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2 菌體濃度測(cè)定

取1 mL發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，用分光光度計(jì)測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm條件下的吸光度值（OD600nm值）。細(xì)胞干質(zhì)量（dry cell weight，DCW）測(cè)定：取不同時(shí)間的1 mL發(fā)酵液，10 000×g離心10 min，去離子水洗滌2次，將待測(cè)樣品于80 ℃干燥至質(zhì)量恒定，測(cè)其干質(zhì)量。建立OD600nm值與細(xì)胞干質(zhì)量方程（1）如下：

式中：OD600nm值控制在0.2～0.8，A為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 赤蘚糖醇、甘露醇含量測(cè)定

取5.0 mL發(fā)酵液，8 000×g離心10 min，取上清液用超純水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液使用高效液相色譜法測(cè)定赤蘚糖醇、甘露醇含量。

色譜條件：色譜柱為AminexHPX-87H糖分析柱（300mm×7.8mm），柱溫35℃，流動(dòng)相為5mmol/LH2SO4，流速0.6mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度30 ℃。

1.3.4 葡萄糖質(zhì)量濃度測(cè)定

取0.5mL發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使葡萄糖質(zhì)量濃度在0～4g/L范圍內(nèi)，使用S-10生物傳感器分析儀檢測(cè)葡萄糖質(zhì)量濃度。

生產(chǎn)強(qiáng)度是指單位時(shí)間內(nèi)單位罐體積發(fā)酵液的產(chǎn)物積累量。赤蘚糖醇發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度根據(jù)公式（2）計(jì)算：

式中：赤蘚糖醇發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度，g/（L·h），赤蘚糖醇產(chǎn)物質(zhì)量濃度，g/L，發(fā)酵時(shí)間單位為h。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。采用Microsoft Excel 2013軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用Origin 2017繪圖軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖初始質(zhì)量濃度對(duì)赤蘚糖醇發(fā)酵的影響

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一種耐高滲酵母，可以通過(guò)產(chǎn)生赤蘚糖醇、甘露醇、甘油或阿拉伯糖醇來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡，使細(xì)胞正常生長(zhǎng)[20-22]。葡萄糖作為碳源時(shí)，可以為發(fā)酵體系中的細(xì)胞提供滲透壓，從而促使解脂耶氏酵母菌過(guò)量合成赤蘚糖醇、甘露醇、甘油或阿拉伯糖醇等來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡[1，6]。

2.1.1 葡萄糖消耗過(guò)程曲線(xiàn)

在轉(zhuǎn)速（500 r/min）和培養(yǎng)溫度（30 ℃）的條件下，研究不同的初始葡萄糖質(zhì)量濃度（100 g/L、200 g/L、300 g/L和400g/L）對(duì)赤蘚糖醇發(fā)酵過(guò)程的影響。不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度條件下赤蘚糖醇發(fā)酵的葡萄糖消耗過(guò)程曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖2。

由圖1可知，100 g/L、200 g/L、300 g/L初始葡萄糖質(zhì)量濃度分別于52 h、144 h、216 h消耗殆盡，而400 g/L初始葡萄糖質(zhì)量濃度在216 h時(shí)還有143 g/L的殘?zhí)?。故高初始葡萄糖濃度?00 g/L和400 g/L）會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖質(zhì)量濃度變化曲線(xiàn)Fig.1 Change curves of glucose mass concentration during the fermentation process

2.1.2 不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)菌體干質(zhì)量的影響

如圖2所示，四種不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度（100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L）對(duì)菌體生長(zhǎng)影響顯著，菌體濃度同初始葡萄糖質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)初始葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L時(shí)，菌體濃度分別在62 h、144 h、216 h、216 h達(dá)到了各自最高值34.7 g/L、38.2 g/L、34.5g/L、30.2g/L。結(jié)果表明，100 g/L初始葡萄糖質(zhì)量濃度有利于解脂耶氏酵母的菌體生長(zhǎng)，而高初始葡萄糖質(zhì)量濃度（300 g/L和400 g/L）則會(huì)抑制解脂耶氏酵母的菌體生長(zhǎng)。

圖2 不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of different initial glucose mass concentration on cell growth

2.1.3 不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)赤蘚糖醇的影響

不同初葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖3。如圖3所示，四種不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度（100 g/L、200 g/L、300g/L和400 g/L）條件下，赤蘚糖醇產(chǎn)量與初始葡萄糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，最高產(chǎn)量分別為6.40 g/L、50.21 g/L、80.76 g/L和86.08 g/L。結(jié)果表明，低初始葡萄糖質(zhì)量濃度100 g/L不利于解脂耶氏酵母的合成赤蘚糖醇，而高初始葡萄糖質(zhì)量濃度（300 g/L和400 g/L）則有利于解脂耶氏酵母的菌體生長(zhǎng)。

綜上所述，初始葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L時(shí)，300 g/L和400 g/L的高初始葡萄糖質(zhì)量濃度有利于赤蘚糖醇合成，不利于菌體生長(zhǎng)，反之，低初始葡萄糖質(zhì)量濃度有利于菌體生長(zhǎng)，不利于赤蘚糖醇合成。

圖3 不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different initial glucose mass concentration on erythritol production

2.1.4 初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)副產(chǎn)物甘露醇的影響

在利用解脂耶氏酵母發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇過(guò)程中，還檢測(cè)到大量甘露醇存在。甘露醇作為公認(rèn)的細(xì)胞耐滲透物質(zhì)，它的存在進(jìn)一步印證了滲透壓脅迫有利于抗?jié)B透產(chǎn)物的合成。初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)副產(chǎn)物甘露醇的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)甘露醇的影響Fig.4 Effect of different initial glucose mass concentration on mannitol production

如圖4所示，副產(chǎn)物甘露醇在不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度（100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L）條件下，最高產(chǎn)量分別為9.87 g/L、14.48 g/L、15.92 g/L和16.44 g/L。結(jié)果表明，甘露醇最終濃度同初始葡萄糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。這一變化趨勢(shì)與TOMASZEWSKA L等[23]研究表明，甘油對(duì)解脂耶氏酵母菌發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇和甘露醇的影響結(jié)果一致。

2.2 不同葡萄糖質(zhì)量濃度下解脂耶氏酵母發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析

為了進(jìn)一步分析葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和赤蘚糖醇合成的影響，對(duì)4種不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度下的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)菌體比生長(zhǎng)速率μ的影響結(jié)果見(jiàn)圖5A。由圖5A可知，在整個(gè)赤蘚糖醇發(fā)酵階段，不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度（100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L）條件下μ變化趨勢(shì)相差很大，其最大值分別為2.61 h-1、1.26 h-1、0.93 h-1和0.40 h-1。通過(guò)圖5A的菌體比生長(zhǎng)速率曲線(xiàn)比較可知，初始葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L時(shí)最利于菌體生長(zhǎng)。

不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)赤蘚糖醇比合成速率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5B。由圖5B可知，不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度（100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L）下赤蘚糖醇比合成速率與初始葡萄糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，其最大比合成速率分別為0.014 h-1、0.039 h-1、0.075 h-1和0.082 h-1，由此可見(jiàn)，高濃度的葡萄糖更有利于赤蘚糖醇的合成。這與RYU Y W等[24]研究利用Candida magnolia菌生產(chǎn)赤蘚糖醇時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的最佳條件不同的結(jié)論相一致。

圖5 不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度條件下赤蘚糖醇發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化Fig.5 Change of kinetics parameters of erythritol fermentation under different initial glucose mass concentration

綜上所述，通過(guò)對(duì)赤蘚糖醇發(fā)酵過(guò)程中的菌體比生長(zhǎng)速率（μ）和赤蘚糖醇比合成速率（qp）的分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了300 g/L和400 g/L高初始葡萄糖質(zhì)量濃度有利于赤蘚糖醇合成，不利于菌體生長(zhǎng)，反之，低初始葡萄糖質(zhì)量濃度有利于菌體生長(zhǎng)，不利于赤蘚糖醇合成。

2.3 分階段葡萄糖質(zhì)量濃度控制策略

通過(guò)對(duì)各初始葡萄糖質(zhì)量濃度下的μ和qp進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，μ最大值隨著初始葡萄糖質(zhì)量濃度的升高而降低，在初始葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L時(shí)，菌體可以快速生長(zhǎng)，在22 h后開(kāi)始變緩；而qp則是隨著初始葡萄糖質(zhì)量濃度的升高而提高?？紤]到初始葡萄糖質(zhì)量濃度為400 g/L時(shí)，發(fā)酵到216 h時(shí)還有143 g/L的殘?zhí)牵l(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，且初始葡萄糖質(zhì)量濃度300 g/L與400 g/L的赤蘚糖醇產(chǎn)量接近，故將發(fā)酵過(guò)程分為2個(gè)階段，分別為0～22 h（第1階段，發(fā)酵初始葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L）和22 h以后（第2階段，使用補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)加葡萄糖，使總耗糖量與初始300 g/L發(fā)酵時(shí)總耗糖量一致），各階段的發(fā)酵過(guò)程參數(shù)見(jiàn)圖6和表1。

圖6 采用分階段控制葡萄糖質(zhì)量濃度的發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)Fig.6 Fermentation curves of two-staged glucose concentration control strategy

表1 不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度下赤蘚糖醇分批發(fā)酵過(guò)程參數(shù)比較Table 1 Comparison of fermentation parameters among batches at different glucose concentration

如圖6所示，采用分階段控制葡萄糖質(zhì)量濃度的策略，在前22 h，菌體可以快速生長(zhǎng)，縮短延滯期，在補(bǔ)加葡萄糖后，由于高濃度葡萄糖的抑制作用，菌體生長(zhǎng)變緩。但從圖中赤蘚糖醇產(chǎn)量變化曲線(xiàn)中可以看出，在補(bǔ)加葡萄糖后，赤蘚糖醇產(chǎn)量增加明顯。通過(guò)對(duì)不同葡萄糖質(zhì)量濃度下赤蘚糖醇分批發(fā)酵過(guò)程參數(shù)比較（表1）表明，采用這一葡萄糖質(zhì)量濃度兩階段控制策略，赤蘚糖醇最終產(chǎn)量為92.66 g/L，與初始葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L的培養(yǎng)相比，分別提高了1 347.81%、84.54%、14.66%、7.57%；生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到最高的0.48 g/（L·h），與初始葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L的培養(yǎng)相比，分別提高了300%、37.14%、29.73%、20.00%。采用分階段控制葡萄糖質(zhì)量濃度的策略，有利于縮短菌體生長(zhǎng)延滯期和促進(jìn)赤蘚糖醇的合成，為赤蘚糖醇的高效發(fā)酵合成提供參考。

3 結(jié)論

在發(fā)酵過(guò)程中，葡萄糖除作為碳源用于菌體生長(zhǎng)代謝以外，還可以為發(fā)酵體系提供不同的滲透壓，從而促使耐高滲酵母利用其過(guò)量合成赤蘚糖醇、甘露醇等物質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡，使細(xì)胞正常生長(zhǎng)。因此，在赤蘚糖醇發(fā)酵過(guò)程中，葡萄糖質(zhì)量濃度的控制對(duì)赤蘚糖醇的產(chǎn)量影響非常大。

本研究在5 L發(fā)酵罐水平上研究了葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）JZ-204發(fā)酵赤蘚糖醇的影響，發(fā)現(xiàn)較低的初始發(fā)酵葡萄糖質(zhì)量濃度（100 g/L）有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，縮短延遲期，使菌體快速增加；而較高的葡萄糖質(zhì)量濃度（200～400 g/L）則有利于赤蘚糖醇的合成。基于對(duì)發(fā)酵參數(shù)的動(dòng)力學(xué)分析，提出解脂耶氏酵母分批發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇的兩階段葡萄糖質(zhì)量濃度控制策略，即0 h時(shí)發(fā)酵初始葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L，22 h后通過(guò)補(bǔ)加葡萄糖，使總糖量與初始300 g/L發(fā)酵時(shí)總糖量一致。采用這一葡萄糖質(zhì)量濃度兩階段控制策略，與初始葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L的培養(yǎng)相比，赤蘚糖醇產(chǎn)量提高了1347.81%、84.54%、14.66%、7.57%；生產(chǎn)強(qiáng)度提高了300%、37.14%、29.73%、20.00%。