邢冰 董誠明 魏碩

摘要：以轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用MISA軟件對簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）進行檢測及分析，分析懷菊轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點信息，并設(shè)計SSR引物，為后期SSR標記的開發(fā)和物種遺傳多樣性檢測等提供參考。結(jié)果表明，共檢測到8 553個SSR位點，它們分布在 7 369 條Unigene中，出現(xiàn)頻率為2.83%，SSR位點的發(fā)生頻率為2.44%;其中單核苷酸重復(fù)基序最多、其次為三核苷酸重復(fù)基序。懷菊轉(zhuǎn)錄組基序長度主要集中于 12～19 bp，多具有中等多態(tài)性。對SSR序列設(shè)計引物，共得到25 662對引物可供今后使用。總之，懷菊SSR位點類型豐富，具有良好的多態(tài)性潛力及可開發(fā)性。

關(guān)鍵詞：懷菊;SSR;位點信息;轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號： S567.23+9.01 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0057-04

收稿日期：2019-09-20

基金項目：2016年度中央引導地方科技發(fā)展專項資金“河南道地大宗藥材種質(zhì)評價及集約化種植與示范”。

作者簡介：邢 冰（1995—），女，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事藥用植物研究。E-mail：xingbingywz@163.com。

通信作者：董誠明，教授，主要從事藥用植物研究。E-mail：dcm371@hactcm.edu.cn。 ?懷菊為菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥頭狀花序[1]，栽培及藥用歷史悠久，研究表明，經(jīng)過長期的自然環(huán)境改變和人工干預(yù)，懷菊種質(zhì)可能發(fā)生了變異與分化，品質(zhì)下降[2]。目前關(guān)于懷菊的研究主要集中于人工栽培、組織培養(yǎng)、質(zhì)量評價等方面，對于其種質(zhì)資源和分子標記輔助育種的研究尚少[3-6]。因此，對于懷菊品種鑒別及遺傳多樣性的研究具有重要意義。

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）是指由1～6個核苷酸為重復(fù)單位組成的簡單串聯(lián)重復(fù)序列。簡單重復(fù)序列能反映出物種間高度的等位基因多樣性，不同物種的重復(fù)次數(shù)、基序類型、長度等差異很大，由此開發(fā)的SSR分子標記技術(shù)具有操作簡便、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高等優(yōu)點，已經(jīng)在品種純度鑒定、基因功能研究、遺傳多樣性分析等方面有廣泛的應(yīng)用[7-8]。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可開發(fā)大量的SSR標記，且速度快、成本較低[9]，能夠克服傳統(tǒng)SSR分子標記技術(shù)的弊端。本研究基于高通量測序結(jié)果，獲得大量懷菊轉(zhuǎn)錄組序列信息，并對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的SSR位點進行檢測，分析其分布及結(jié)構(gòu)特點，以期為懷菊種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析及遺傳圖譜構(gòu)建等提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗中的轉(zhuǎn)錄組測序樣本懷菊來源于河南省焦作市溫縣，種植于河南中醫(yī)藥大學藥用植物園溫室，采集后于河南中醫(yī)藥大學組織培養(yǎng)實驗室進行離體培養(yǎng)得到懷菊愈傷組織、芽叢、幼苗。

1.2 方法

1.2.1 樣品檢測、文庫構(gòu)建與測序 將樣品送至北京百邁客生物科技有限公司提取mRNA，分別采用Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100方法檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性等，檢測合格后，進行文庫構(gòu)建，分別使用Qubit 2.0和Aglient 2100方法對文庫的濃度和插入片段大小進行檢測，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后，利用Illumina HiSeqTM 2000 高通量測序平臺對其進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.2 懷菊轉(zhuǎn)錄組SSR的篩選 采用MISA軟件對組裝出來的Unigene序列進行SSR檢測、篩選。各重復(fù)次數(shù)搜索標準如下：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)次數(shù)至少分別為10、6、5、5、5、5次。對不同SSR類型在基因轉(zhuǎn)錄本的密度分布進行統(tǒng)計。同時篩選被間隔≤100 bp 堿基間隔的復(fù)合型SSR。

1.2.3 懷菊SSR引物設(shè)計 使用Primer 3.0（235 版，默認參數(shù)）軟件進行SSR引物設(shè)計，并針對預(yù)測到的每一個SSR位點分別設(shè)計3組引物供后期試驗選擇。主要的引物參數(shù)設(shè)置：退火溫度（Tm）在57～63 ℃，上、下游引物Tm值相差小于 5 ℃;擴增產(chǎn)物大小為100～280 bp，引物長度為 10～27 bp;GC含量小于60%。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷菊轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

懷菊高通量測序后總計產(chǎn)出 83.67 GB 數(shù)據(jù)，干凈讀序經(jīng)Trinity組裝后最終獲得302 379條Unigene，過濾后發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量不低于30的堿基比例（Q30，測序錯誤率 < 1%）為90.92%，表明測序結(jié)果良好，可對獲得的數(shù)據(jù)進行進一步分析。

2.2 懷菊SSR數(shù)量與分布

采用MISA軟件對Unigene進行SSR檢測，共檢出 8 553 個SSR位點，它們分布在7 369條Unigene中，其中有4 477條Unigene含單個SSR位點，有 2 553 條Unigene含2個及2個以上SSR位點。SSR發(fā)生頻率為2.44%，出現(xiàn)頻率為2.83%，平均每 10 kb 有1.27個SSR位點（表1）。

2.3 懷菊轉(zhuǎn)錄組中SSR基元類型和比例

對SSR類型進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，二核苷酸至六核苷酸重復(fù)類型均有出現(xiàn)，不同核苷酸基序種類及重復(fù)次數(shù)差異明顯。在考慮到堿基互補配對原則的情況下，單核苷酸重復(fù)單元有4種，占60.77%，多數(shù)重復(fù)次數(shù)為10～22次，主要為A/T基序重復(fù)，而 C/G 基序出現(xiàn)頻率較低;二核苷酸重復(fù)單元有12種，占14.40%，多數(shù)重復(fù)次數(shù)為6～10次，重復(fù)次數(shù)最多的基序是TG，其次是TA;三核苷酸重復(fù)單元有63種，占19.17%，多數(shù)重復(fù)次數(shù)為5～7次，重復(fù)次數(shù)最多的基序為TGA，其次是ATC;四核苷酸重復(fù)單元有48種，占0.83%，重復(fù)次數(shù)最多的基序為TAAA，其次是TTAT;五、六核苷酸重復(fù)單元分別有9、3種，分別占0.11%、0.04%，重復(fù)次數(shù)最多的基序分別是GGGGA與TTGATA（表2）。

2.4 懷菊SSR基元長度分布及其多態(tài)性

究篩選出的懷菊SSR長度均≥10 bp，其中12～19 bp 的SSR有4 279個（占比為50.03%），具有中等多態(tài)性;而≥20 bp的SSR有621個（占比為726%），具有較高的多態(tài)性。此外，研究發(fā)現(xiàn)，高級基元SSR的多態(tài)性普遍比低級基元的低[10]。本研究中，低級基元單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸共占總SSR的9434%，而在長度≥20 bp的SSR中共有138個，占長度≥20bp的所有SSR的22.22%，表明大部分懷菊轉(zhuǎn)錄組SSR具有高多態(tài)性潛能（圖1）。

2.5 懷菊SSR引物設(shè)計

為了篩選出可在試驗中應(yīng)用的懷菊SSR，使用Primer 3.0軟件對含有SSR位點且SSR上下游序列

均不小于150 bp的unigene進行引物設(shè)計。結(jié)果根據(jù)SSR位點信息，批量設(shè)計了25 662對引物（部分引物見表3）。

3 討論與結(jié)論

近年來，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)開發(fā)分子標記已成為一種主要的方式。Han等基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果對野菊花SSR分子標記進行開發(fā)，并對其遺傳分化等方面開展系統(tǒng)研究[11]。Kobeissi等使用SSR標記評估菊花遺傳多樣性，以利于種質(zhì)資源保護和遺傳育種[12]。張運興等利用MISA軟件對SSR位點進行搜索，并開發(fā)系列引物，為菊花種質(zhì)資源和遺傳多樣性分析提供依據(jù)[13]。從本研究的結(jié)果來看，首先進行全基因組測序，再分析SSR信息，不僅可以得到更多的信息，準確性也大大提高。然而，由于不同品種的菊花之間基因組差異巨大，僅參考菊花基因組序列，并不能系統(tǒng)地對懷菊進行分析。本研究針對懷菊基因組進行初步組裝，并進行SSR分析及引物設(shè)計，這有利于懷菊的種質(zhì)鑒定，同時也對懷菊的遺傳分析具有重要意義。

懷菊轉(zhuǎn)錄組測序后共獲得302 379條Unigene，利用MISA軟件進行搜索，共發(fā)現(xiàn)8 553個SSR位點，其中以單核苷酸和三核苷酸重復(fù)為主，占SSR總數(shù)的79.94%。張運興等的研究表明，菊花中以三核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)頻率最高[13]，而本研究發(fā)現(xiàn)，懷菊中的單核苷酸最多，可能是由于不同植物SSR的主導重復(fù)基元類型有所不同[14-15]，范三紅等認為，可能是由于這種重復(fù)基元編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)的出現(xiàn)率較高[16]。同時，樣品、測序技術(shù)的不同，研究中檢測及評價方法的不同，也可能會造成同類型物種的SSR信息出現(xiàn)一定的差異。本研究發(fā)現(xiàn)，A/T、TGA/ATC分別是懷菊中單核苷酸和三核苷酸SSR類型的優(yōu)勢重復(fù)基元。有研究表明，單核苷酸中A/T重復(fù)的數(shù)量居多，而雙子葉植物中三核苷酸主要重復(fù)類型是AAG/CTT[17]。張華麗等的研究表明，在萬壽菊三核苷酸SSR類型中出現(xiàn)次數(shù)最多的重復(fù)基元是ATC/ATG[18]。初步分析這一差異可能與懷菊的SSR特性和物種的差異有關(guān)。SSR長度是影響其多態(tài)性高低的重要因素[19]，本研究發(fā)現(xiàn)，懷菊中長度大于12 bp的SSR共有4 900個，占總數(shù)的57.29%，具有中等以上的多態(tài)性，可以重點利用這類SSR進行懷菊分子標記的開發(fā)及遺傳多樣性等方面的研究。

綜上所述，通過檢測懷菊轉(zhuǎn)錄組序列中SSR信息，得到數(shù)量多、可用性強的SSR位點， 對于加速懷菊SSR標記的開發(fā)、種質(zhì)鑒定及遺傳性狀分析等研究具有重要意義。

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