高 珊 常玉梅 趙雪飛 3 孫 博 張立民 梁利群 董志國

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所,淡水魚類育種國家地方聯合工程實驗室,農業(yè)部淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室,中國水產科學研究院特殊生境魚類種質特性與抗逆育種重點實驗室,黑龍江 150070;2.江蘇海洋大學海洋生命與水產學院,連云港 222000;3.東北林業(yè)大學野生動物與自然保護地學院,黑龍江 150040)

我國有4.6×105km2低洼鹽堿水域,具有高堿度、高pH、水質類型復雜等特點,其中堿度常先于鹽度限制魚類的生存和繁衍,現絕大部分處于荒置狀態(tài)[1,2]。瓦氏雅羅魚(Leuciscus waleckii),俗稱東北雅羅魚、華子魚、白魚,隸屬于鯉形目、鯉科、雅羅魚亞科、雅羅魚屬,在我國黑龍江、遼河、黃河流域及內陸鹽堿湖泊均有分布,具有極強的耐高堿特性,能夠耐受內蒙古達里諾爾湖碳酸鹽堿度

(Carbonate alkalinity,CA)高達54 mmol/L,pH9.6的極端惡劣環(huán)境[3]。解析瓦氏雅羅魚耐高堿的生理和分子機制,培育耐高堿新品種,對推進鹽堿水域的開發(fā)利用進程具有重要的戰(zhàn)略意義。

鰓是魚類氣體交換、滲透壓調節(jié)、離子轉運、氨氮排泄等重要生理過程發(fā)生的主要場所,其形態(tài)結構發(fā)生變化直接影響魚類存活[4]。鰓是研究環(huán)境變化對魚類影響的代表性器官,其形態(tài)結構及功能隨著水體鹽度[5,6]、堿度[7]、pH[8]、溫度[9]等環(huán)境因子的變化而發(fā)生變化。因此,開展鰓的組織學調查是評估環(huán)境污染、魚病發(fā)生程度的重要研究手段[10,11]。

瓦氏雅羅魚作為耐堿魚類研究的模式生物,前期圍繞其耐高堿特性,已從生理生化、分子生物學、基因組學等方面開展了一系列研究,尤其借助于高通量測序技術,發(fā)現很多基因及通路在離子交換、滲透壓調節(jié)、酸堿平衡等生理過程發(fā)揮重要作用[12—15]。這些重要的生理活動與鰓的結構與功能變化密不可分。本研究擬通過比較不同碳酸鹽堿度脅迫下,達里諾爾湖瓦氏雅羅魚(堿水種)和松花江瓦氏雅羅魚(淡水種)鰓組織結構的微觀變化,探究達里諾爾湖瓦氏雅羅魚耐高堿特性與鰓組織結構微觀調整的適應性關系,為魚類耐鹽堿的生理和分子機制研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

實驗魚為內蒙古達里諾爾湖瓦氏雅羅魚自交F2和松花江瓦氏雅羅魚自交F2,飼養(yǎng)于黑龍江水產研究所呼蘭實驗站。選擇大小一致,體質量為(22.24±4.68) g的個體45尾,運回實驗室,在循環(huán)可控水族箱(42.6 cm×28.4 cm×29.3 cm)暫養(yǎng)7d。實驗用水為過濾、曝氣24h的自來水,水質檢測指標見表1。

1.2 不同NaHCO3堿度脅迫實驗

實驗設置對照組(CA0)、NaHCO3堿度30 mmol/L(CA30)、NaHCO3堿度50 mmol/L(CA50) 3組,每組3個重復,每個重復5尾實驗魚。采用緩慢提升堿度的方法開展脅迫實驗。以5 mmol/(L·d)的速度緩慢提升,堿度至30和50 mmol/L 后維持該堿度22d,每天換水1/2,實驗期間不投喂,采用YSI多功能水質分析儀監(jiān)測水質溫度、pH、溶氧、鹽度、氨氮等指標,用酸堿滴定法測定水體堿度。不同堿度脅迫期間,各實驗組水體檢測指標見表1。

表 1 對照組和實驗組水體檢測指標Tab.1 Water index control group and experimental group

1.3 樣品采集及固定

在堿度脅迫實驗結束后,對照及兩個堿度處理組各取5尾實驗魚的鰓組織,于Bouin’s液固定(苦味酸飽和溶液+福爾馬林25 mL+冰醋酸5 mL) 24h后,轉移至70%酒精于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 組織切片及拍照觀察

首先從70%酒精中取出組織,參考楊建等[16]的方法,切成大小適中的組織塊,進行脫水、透明和包埋。具體步驟如下: 50%酒精(12h)→70%酒精(過夜)→80%酒精(1h)→90%酒精(30min)→95%酒精(30min)→100%酒精Ⅰ(15min)→100%酒精Ⅱ(5min)→酒精、二甲苯(1∶1,30min)→二甲苯(15min)→二甲苯∶石蠟=1∶1(1h,烘箱)→包埋機(Leica EG1150)包埋。包埋后使用切片機(Microm HM 200)切成5 μm的薄片,在涂有蛋清甘油(1∶1)的載玻片上滴滿蒸餾水,并將切片展開。

然后進行脫蠟、染色。具體步驟如下: 二甲苯(10min)→二甲苯、酒精(1∶1,5min)→100%酒精(5min)→85%酒精(5min)→80%酒精(5min)→蒸餾水沖洗(10min)→蘇木子染色(10min)→流水沖洗(15min)→鹽酸分化液(8s)→流水沖洗(15min)蒸餾水沖洗(1min)→伊紅復染(2min)→流水沖洗(15min,根據染色情況控制沖洗時間)→80%酒精(5min)→90%酒精(5min)→100%酒精Ⅰ(5min)→100%酒精Ⅱ(3min)→二甲苯、酒精(1∶1,2min)→二甲苯Ⅰ(5min)→二甲苯Ⅱ(5min)→中性樹膠封片、烘干。

最后采用光學顯微鏡觀察、拍照(Olympus BX 53&DP74)。測微尺測定鰓呼吸面鰓絲寬度、鰓小片長度及鰓小片間距。

1.5 數據處理

實驗所有數據均以平均值±標準差表示。采用SPSS13.0軟件對鰓絲主干寬度、鰓小片長度及鰓小片間距進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。采用Duncan法進行組內多重比較分析,采用t檢驗進行組間差異比較分析。P＜0.05具有顯著差異,P＜0.01具有極顯著差異。

2 結果

2.1 不同NaHCO3堿度對瓦氏雅羅魚鰓組織結構的影響

組織切片結果顯示,在正常條件下(CA0),兩種實驗魚的鰓絲和鰓小片完整,鰓絲末端膨起呈棒狀,鰓小片垂直于鰓絲,呈柳葉狀向兩側伸展。細胞核小,染成藍紫色。在NaHCO3堿度脅迫下,兩種實驗魚的鰓絲寬度、鰓小片長度和鰓小片間距都發(fā)生了顯著變化(表1)。雅羅魚堿水種鰓小片無破損,而淡水種在CA30開始出現破損,CA50時破損面積增大(圖1)。

隨著堿度增加雅羅魚堿水種鰓組織結構均發(fā)生了顯著變化,鰓絲變寬、鰓小片變長、鰓小片間距變大(P＜0.05)。同樣地,隨著堿度增加,雅羅魚淡水種鰓組織結構也發(fā)生了顯著變化,鰓絲變寬、鰓小片間距變大(P＜0.05),鰓小片長度在CA30時顯著變長(P＜0.05),但在CA50時與對照組無明顯差異(表2)。

圖1 不同堿度對瓦氏雅羅魚堿水種和淡水鰓組織結構的影響Fig.1 Effects of bicarbonate alkalinity on the gill structure in alkali-adapted species and freshwater species of Amur ide

表 2 NaHCO3堿度對瓦氏雅羅魚鰓結構的影響Tab.2 Effect of NaHCO3 alkalinity on the gill structure of Amur ide (n=9)

在相同堿度脅迫下,與淡水種相比,雅羅魚堿水種鰓絲顯著變寬(P＜0.01),鰓小片長度在CA50時顯著變長(P＜0.01),鰓小片間距在CA30時顯著變大(P＜0.05,表2)。

2.2 不同NaHCO3堿度對瓦氏雅羅魚鰓絲上皮細胞結構的影響

鰓絲上皮由多層上皮細胞組成,包括扁平上皮細胞(Pavement cell,PVC)、氯細胞(Mitochondriarich cell,MRC)、黏液細胞(Mucous cell,MC)、柱細胞(Pillar cell,PC)等。由圖2可以看出,氯細胞(Mitochondria-rich cell,MRC)主要位于鰓小片基部,多為長柱形或卵圓形,體積膨大,蘇木精-伊紅染色(HE)著色較深;扁平上皮細胞呈薄鱗狀覆蓋于鰓小片上,與柱細胞、血細胞交替排列形成血管通道。

與對照組相比,瓦氏雅羅魚堿水種在CA30和CA50的氯細胞數量明顯增加,HE著色較深,CA50的細胞排列更加緊密,細胞核變大并且有疊加現象;扁平上皮細胞變大,細胞表面增厚。瓦氏雅羅魚淡水種,CA30的氯細胞明顯多于CA50;隨著堿度增加,鰓小片出現破損,扁平上皮細胞、柱細胞和血細胞融合、脫落現象嚴重 (圖2)。

圖2 不同堿度對瓦氏雅羅魚堿水種和淡水種鰓表皮MRC和PVC細胞的影響Fig.2 Effects of bicarbonate alkalinity on the gill MRC and PVC in alkali-adapted species and freshwater species of Amur ide

2.3 不同NaHCO3堿度對瓦氏雅羅魚鰓耙上皮黏液細胞的影響

在鰓耙(Gill raker,GR)上皮中發(fā)現了黏液細胞,呈透明狀 (Mucous cell,MC,圖3)。在正常條件下,黏液細胞呈近似圓的橢圓形,排列和大小不均勻;隨著堿度的增加,黏液細胞由大而稀疏變?yōu)樾《芗?并且分布均勻。CA30,黏液細胞呈長橢圓形,大小形狀相似,且大都排列在靠外的部位,排列緊密整齊;CA50,黏液細胞大小和形態(tài)與CA30相似,但排列更加整齊緊密。在相同堿度條件下,瓦氏雅羅魚堿水種的黏液細胞數量較淡水種多,而且排列更為整齊、密集(圖3)。

3 討論

3.1 NaHCO3堿度對瓦氏雅羅魚鰓組織結構的影響

魚類鰓組織直接與外界水體接觸,對水體的物理和化學變化非常敏感。Haaparanta等[17]發(fā)現季節(jié)性溫度及水質是導致鰓組織結構發(fā)生變化的主要因素,其中影響程度最為嚴重的是水體pH。在本研究中,添加NaHCO3導致水體pH處于9.44—9.55,基本與達里諾爾湖的pH 9.6相近。通過脅迫實驗發(fā)現,瓦氏雅羅魚堿水種鰓絲主干變寬,鰓小片變長,鰓小片間距變大(P＜0.05),這與花鱸(Lateolabrax japonicus)[18]、鯔(Mugil cephalus)[6]、星斑川鰈魚(Platichthys stellatus)[19]在鹽度脅迫下(pH 8.0)的鰓絲細胞收縮、鰓小片間距變大的研究結果稍有不同。由此可以看出,堿度與鹽度對魚類鰓組織結構的影響明顯不同,即耐鹽堿魚類和海水魚類鰓組織可能具備不同的生理調節(jié)機制。

高堿度高pH是耐鹽堿魚類生存環(huán)境的主要特點,因而賦予了這些魚類一些特殊的生理適應性機制。青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)為了適應高鹽堿的生活習性,其鰓組織形態(tài)結構包括鰓耙和鰓絲都發(fā)生了適應性改變[20—22]。本研究通過比較瓦氏雅羅魚堿水種和淡水種在相同堿度處理條件下的鰓組織結構發(fā)現,雅羅魚堿水種鰓絲主干顯著變寬(P＜0.01),鰓小片長度顯著變長(P＜0.01),鰓小片間距變大趨勢明顯(表2)。推測這種結構上的適應性變化,有利于增強瓦氏雅羅魚在堿度脅迫下的氣體擴散效率,機體攝氧量,以此促進自身的新陳代謝[5]。另外,從組織結構的完整性來看,隨著堿度的升高,瓦氏雅羅魚堿水種的鰓組織結構較為完整,無脫落、破損的現象;而瓦氏雅羅魚淡水種隨著堿度升高,鰓絲和鰓小片均有一定程度的脫落,這與花鱸[18]、鯔[6]等在鹽度脅迫下鰓小片出現斷裂、脫落的現象相符。這些研究結果表明,瓦氏雅羅魚堿水種由于長期生活在高鹽堿高pH的環(huán)境中,其鰓組織結構已經發(fā)生了適應性改變。

3.2 NaHCO3堿度對瓦氏雅羅魚鰓上皮細胞的影響

魚類鰓組織直接與外界水體接觸,覆蓋于鰓絲的表皮細胞對鰓生理功能的正常發(fā)揮至關重要。氯細胞在維持機體內環(huán)境穩(wěn)定、離子調節(jié)和滲透壓平衡方面發(fā)揮重要作用[23,24]。廣鹽性硬骨魚類可通過調節(jié)鰓絲上皮中氯細胞的數量、分布、內部結構以及Na+-K+-ATPase活性等來適應外界的鹽度變化[25,26]。目前已經在莫桑比克羅非魚(Oreochromis mossambicus)、大西洋鮭(Salmo salar)等魚類中鑒定了多種氯細胞類型[27]。研究發(fā)現,虹鱒(Oncorhynchus mykiss)鰓氯細胞數量與鹽度呈線性正相關[28]。Maina[29]在肯尼亞馬加迪湖(Lake Magadi,pH10)羅非魚(Oreochromis alacalicusgrahami)鰓上皮發(fā)現了2種氯細胞,其在不同環(huán)境刺激下的拓撲結構、超微結構、線粒體數量和大小存在顯著差異;張仁意等[22]觀察了青海湖裸鯉鰓氯細胞特征,發(fā)現其數量多于淡水型。本研究發(fā)現,隨堿度升高,瓦氏雅羅魚堿水種鰓氯細胞數量增多、體積變大并且有疊加現象。這些研究表明耐鹽堿魚類的氯細胞數量和堿度也存在正相關。氯細胞主要位于鰓小片基部,鹽度或堿度脅迫,魚類氯細胞數量增多與鰓小片間距變大的研究結果也是相符的。

鰓小片較薄的表皮細胞有利于環(huán)境和血液的氣體交換和擴散,但在環(huán)境脅迫時因防御反應會造成細胞隆起(Lifting up of the epithelium)和鰓小片融合(Lamellar fusion)現象,以避免損傷。細胞隆起會增加毒物進入血液的距離,鰓小片融合則會減少脆弱鰓表面積的數量[30]。本研究在堿度脅迫下未發(fā)現鰓小片融合現象,但發(fā)現瓦氏雅羅魚堿水種鰓小片上的扁平上皮細胞變大增厚,而淡水種則出現細胞融合脫落現象(圖2),這與食蚊魚(Gambusia affinis)[30]、大菱鲆幼魚(Scophthalmus maximus)[31]、莫桑比克羅非魚[32]、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[33]在pH、溴氰菊酯、Cd2＋脅迫時的研究結果相似,進一步表明瓦氏雅羅魚堿水種可通過細胞隆起阻止HCO和pH進入血液,保持細胞結構和生理功能的完整性以適應高堿環(huán)境,而淡水種由于細胞融合,結構不完整造成生理功能喪失,因而不能適應高堿環(huán)境。

黏液細胞的增加和分泌與魚類鹽度[34]、pH、氨濃度[35]的增加及病原微生物和寄生蟲感染[36]顯著相關。本研究通過比較瓦氏雅羅魚堿水種和淡水種在不同堿度脅迫下鰓耙上皮黏液細胞數量、分布、形態(tài)等特征發(fā)現,瓦氏雅羅魚堿水種隨著堿度增加,黏液細胞數量顯著增多、大小均勻、排列緊密,這與王瑞芳等[37]和Ouz[38]發(fā)現鹽堿湖泊瓦氏雅羅魚和卡拉白魚(Chalcalburnus tarichi)黏液細胞數量增多的研究結果相符,推測其數量增加可能在魚類滲透壓調節(jié)中發(fā)揮重要作用。也有學者認為黏液細胞的功能是分泌黏液,形成一個功能表面,促進水的微循環(huán),利于氣體交換等其他作用[39]。

本研究通過比較瓦氏雅羅魚堿水種和淡水種在不同堿度脅迫下鰓組織結構的差異,發(fā)現堿水種由于長期適應高堿環(huán)境,其鰓組織發(fā)生了適應性變化: 鰓絲寬,鰓小片長,鰓小片間距大,覆蓋于鰓絲上皮的氯細胞和黏液細胞數量多,增強滲透壓和離子調節(jié)能力,扁平上皮細胞增厚,可有效阻止有毒物質進入血液,并和柱細胞保持鰓小片結構的完整性,從而實現其在高堿環(huán)境下生理功能的正常發(fā)揮。