陳 捷 張 立

肺炎支原體是一種附著于纖毛上皮細(xì)胞并在呼吸道黏膜中破壞它們的微生物，可引發(fā)各種嚴(yán)重程度的疾病，從輕度上呼吸道感染到嚴(yán)重的非典型肺炎[1]。在肺炎支原體感染的免疫應(yīng)答過程中，遺傳多態(tài)性的作用不容忽視，特定基因可能影響肺炎支原體的易感性[2-3]。遺傳多態(tài)性與肺炎支原體感染之間的關(guān)系越來越受到公眾的關(guān)注。CRP 是機(jī)體在急性感染時由炎癥刺激所產(chǎn)生的一種能夠加強(qiáng)機(jī)體吞噬作用的蛋白，CRP 蛋白水平與感染引起炎癥反應(yīng)強(qiáng)度有關(guān)[4-5]。rs1205 位點是位于CRP 基因3'非翻譯區(qū)（UTR）的一個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，該位點突變與CRP 的表達(dá)水平有關(guān)[6-8]。本研究通過病例對照研究的方式分析CRP 基因rs1205 位點SNP 與兒童支原體肺炎感染風(fēng)險及其嚴(yán)重程度的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2015 年2 月—2018 年12 月杭州市兒童醫(yī)院收治的205 例支原體肺炎患兒作為研究組，根據(jù)病情嚴(yán)重程度[9]分為輕癥組107 例、重癥組98 例。另招募205 例急性病毒性上呼吸道感染患兒作為對照組。所有患兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書，本研究經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，批件號：（2015）年倫審（臨研）第（12）號。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 兒童支原體肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10-11]：（1）主要表現(xiàn)為持續(xù)劇烈的咳嗽。（2）胸片或肺部CT呈肺間質(zhì)浸潤性、小葉性、大葉性肺實變。（3）肺炎支原體抗體血清學(xué)檢測：急性期和恢復(fù)期雙份血清特異性IgG 抗體比較呈4 倍以上的升高或下降到原來的1/4；或單份血清特異性IgM 抗體陽性。（4）肺炎支原體核酸檢測：鼻咽分泌物或痰液核酸檢測陽性。急性病毒性上呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9-10]：（1）有鼻塞、流涕、咽部不適、干咳、發(fā)熱等臨床表現(xiàn)，查體：咽部紅腫，雙側(cè)扁桃體未見分泌物。（2）外周血白細(xì)胞計數(shù)正常或者偏低。（3）胸片檢查正常。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡1～13 歲；（2）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有其他臟器疾?。唬?）患有炎癥性疾?。唬?）由肺炎支原體以外的其他病原體感染引起的肺炎。

1.4 CRP 基因rs1205 位點基因型分析 所有受試者均取5mL 肘靜脈血，3000r/min 離心20min 后分離上清血漿，保存于-80℃冰箱，用于血漿CRP 蛋白檢測。取分離血漿后的白細(xì)胞層，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen，51106，German）提取基因組DNA，以提取的基因組DNA 為模板，CRP 基因rs1205 位點PCR 擴(kuò)增引物為，5'-CTTGGCTCCTCCACTTCCAG-3'（正向）；5'-TGAACCTGGGACCACCAGTA-3'（反向）。進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為無菌雙蒸水13.8μL；2μL 10×PCR buffer；1μL 10mM dNTP mix；1μL Primer Forward；1μL Primer Reverse；0.25μL Taq DNA Polymerase；1μL 基 因 組DNA，PCR 反應(yīng)程序為95℃，5min；（94℃，45s；58℃，45s；72℃，30s）30cycles；72℃，10min。PCR 產(chǎn)物采用DNA Gel Extraction Kit（D0056，Beytime）純化，然后采用Sanger 測序分析SNPs 位點序列信息，確定基因型，見圖1。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血漿CRP 蛋白水平 使用購自美國R&D Systems 公司的human CReactive protein quantikine ELISA kit（catlog：DCRP00，批號R0201503125、R201503127）檢測受試者血漿CRP 蛋白水平，敏感度為0.022ng/mL，檢測限為0.8～50ng/mL，每個樣品檢測時均設(shè)置3 個復(fù)孔。

圖1 CRP 基因rs1205 位點不同基因型Sanger 測序結(jié)果

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件分析本研究數(shù)據(jù)，連續(xù)參數(shù)和非參數(shù)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，分類變量用[n（%）]表示，Pearson 卡方檢驗用于比較分類變量，通過ANOVA 比較正態(tài)分布的連續(xù)變量的平均值，Mann Withney U 檢驗比較偏態(tài)分布連續(xù)變量，兩組間非參數(shù)統(tǒng)計學(xué)分析采用t 檢驗，基因型頻率采用χ2檢驗是否符合Hardy-Weinberg 平衡，采用優(yōu)勢比（OR）和95%置信區(qū)間（CI）分析CRP基因rs1205 位點各基因型發(fā)生支原體肺炎的風(fēng)險，并采用多因素Logistic 回歸分析對年齡、性別等因素進(jìn)行校正，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患兒一般資料比較 輕癥組男65 例，女42 例，年齡2～13（6.25±2.14）歲，病程1～6（4.17±1.24）天；重癥組男50 例，女48 例，1～12（6.31±2.32）歲，病程1～6（4.19±1.31）天。對照組男112 例，女93例，年齡2～14（6.51±2.53）歲，病程1～5（4.09±1.17）天。三組年齡、性別、病程等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，輕癥組和重癥組病程比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 CRP 基因rs1205 位點SNP 與支原體肺炎發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性 經(jīng)遺傳學(xué)平衡檢測，本研究所選受試者群體CRP 基因rs1205 位點基因型頻率符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。以CC 基因型為參考，研究組患者CT 基因型和TT 基因型頻率均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CRP 基因rs1205 位點加性模型、顯性模型和隱性模型下支原體肺炎發(fā)病風(fēng)險均顯著降低（P＜0.05），T 等位基因攜帶者支原體肺炎的發(fā)病風(fēng)險相對于C 等位基因攜帶者顯著降低0.57 倍（95%CI：0.43-0.76，P＜0.001）。見表1。

2.3 CRP 基因rs1205 位點SNP 與支原體肺炎嚴(yán)重程度相關(guān)性 以CC 基因型為參考，重癥組CT 基因型和TT 基因型頻率均顯著低于輕癥組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。以C 等位基因為參考，T等位基因攜帶者進(jìn)展為重癥支原體肺炎的概率顯著降低0.41 倍（95%CI：0.27-0.63，P＜0.001）。見表2。

表1 CRP 基因rs1205 位點基因型和等位基因頻率

表2 CRP 基因rs1205 位點基因型和等位基因頻率與支原體肺炎嚴(yán)重程度相關(guān)性

2.4 血漿CRP 蛋白水平比較 輕癥組和重癥組支原體肺炎患兒血漿CRP 蛋白水平顯著高于對照組，重癥組血漿CRP 蛋白水平顯著高于輕癥組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表3。

2.5 CRP 基因rs1205 位點SNP 與血漿CRP 蛋白水平相關(guān)性 分析205 例支原體肺炎患兒血漿CRP蛋白水平與CRP 基因rs1205 位點SNP 相關(guān)性，結(jié)果顯示，CC 基因型攜帶者血漿CRP 蛋白水平最高，CT基因型其次，TT 基因型最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表4。

3 討論

支原體肺炎是一種常見的兒科疾病，近年來發(fā)病率有上升的趨勢，且呈現(xiàn)低齡化的趨勢[12-13]。目前，支原體肺炎的發(fā)病原因并未完全闡明，炎性因子在其中的作用十分重要。CRP 是一種急性時相炎性反應(yīng)蛋白，在炎癥反應(yīng)、病毒和細(xì)菌感染以及應(yīng)激反應(yīng)過程中均有顯著性升高[14-16]。從相關(guān)研究中可知，CRP 在支原體肺炎的發(fā)病和轉(zhuǎn)歸中具有重要的作用，但目前關(guān)于CRP 基因多態(tài)性與支原體肺炎發(fā)病風(fēng)險相關(guān)性的研究較少，本研究的目的是探討CRP 基因3'UTR 區(qū)rs1205 位點SNP 與兒童支原體肺炎發(fā)病風(fēng)險及其嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

表3 三組患兒血漿CRP 蛋白水平比較（mg/L，）

表3 三組患兒血漿CRP 蛋白水平比較（mg/L，）

注：CRP 為C 反應(yīng)蛋白；t1/P1 為對照組與輕癥組比較；t2/P2 為對照組與重癥組比較；t3/P3 為輕癥組與重癥組比較；輕癥組、重癥組為支原體肺炎患兒；對照組為急性上呼吸道感染患兒

表4 CRP 基因rs1205 位點不同基因型患兒血漿CRP 蛋白水平比較（mg/L，）

表4 CRP 基因rs1205 位點不同基因型患兒血漿CRP 蛋白水平比較（mg/L，）

注：CRP 為C 反應(yīng)蛋白；t1/P1 為CC 基因型與CT 基因型比較；t2/P2 為CC 基因型與TT 基因型比較；t3/P3 為CT 基因型與TT 基因型比較

從本研究結(jié)果來看，攜帶CRP 基因rs1205 位點T 等位基因的受試者患支原體肺炎的風(fēng)險較小，相對于攜帶C 等位基因的受試者，T 等位基因攜帶者患支原體肺炎的風(fēng)險降低了0.57 倍（95%CI：0.43-0.76）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，攜帶T 等位基因的支原體肺炎患兒血漿中CRP 蛋白水平顯著低于C 等位基因攜帶者，與部分研究者發(fā)現(xiàn)rs1205 位點T 等位基因受試者血漿中CRP 蛋白水平顯著低于C 等位基因攜帶者的相關(guān)研究結(jié)果一致[17-18]。分析原因，筆者認(rèn)為rs1205 位點位于CRP 基因的3'UTR，可能突變的位點位于CRP 基因3'UTR 與微小RNA（miRNAs）相結(jié)合的區(qū)域，突變影響了miRNAs 對CRP 基因表達(dá)的調(diào)控作用，導(dǎo)致CRP 蛋白表達(dá)水平的改變。Arouca 等[19]研究顯示，rs1205 位點CT/TT 基因型與較低的CRP 濃度相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。筆者推測具體機(jī)制可能與調(diào)控miRNA 與rs1205 位點不同等位基因的結(jié)合效率差異較大，導(dǎo)致CRP 蛋白表達(dá)水平之間存在顯著差異，還需體外模型進(jìn)行驗證。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，rs1205 位點SNP 與小兒支原體肺炎的嚴(yán)重程度相關(guān)，攜帶T 等位基因的患兒其嚴(yán)重程度顯著低于C 等位基因攜帶者，顯然攜帶T等位基因的支原體肺炎患兒血漿中CRP 蛋白水平顯著低于C 等位基因攜帶者。由此說明，rs1205 位點SNP 與支原體肺炎的嚴(yán)重程度相關(guān)。

綜上所述，CRP 基因rs1205 位點SNP 與兒童支原體肺炎發(fā)病風(fēng)險及其嚴(yán)重程度相關(guān)，C 等位基因是支原體肺炎的高危因素，且攜帶C 等位基因的支原體肺炎患兒更容易進(jìn)展為重癥支原體肺炎。

但本研究也有一些不足之處，首先與CRP 表達(dá)水平相關(guān)的SNP 位點較多，本研究僅闡明了一個SNP 位點，尚且需要進(jìn)一步研究；其次，與CRP 蛋白結(jié)構(gòu)相關(guān)的SNP 位點也可能與支原體肺炎風(fēng)險相關(guān)，也需要進(jìn)一步證實；另外，需要設(shè)計體外研究證實其具體機(jī)制。