王李勃　束長龍　朱延明　耿麗麗

摘要 本研究針對重要的農(nóng)業(yè)害蟲白星花金龜Protaetia brevitarsis幼蟲，建立RNA干擾體系，以期為免疫相關(guān)基因功能研究奠定基礎(chǔ)。通過血腔注射dsRNA，成功干擾了肽聚糖識別蛋白（peptidoglycan-recognition protein LB，PGRP-LB）基因的表達，發(fā)現(xiàn)dsRNA注射量為9 μg，注射后48 h取樣，pgrp-lb基因沉默效率最高。通過血腔注射對白星花金龜無殺蟲活性的Bt菌株G03，發(fā)現(xiàn)pgrp-lb基因沉默破壞了白星花金龜幼蟲的免疫防御系統(tǒng)，顯著提高了白星花金龜對G03菌株的敏感性。表達免疫識別基因dsRNA菌株的構(gòu)建，將為白星花金龜?shù)纳锓乐翁峁┬滤悸贰?/p>

關(guān)鍵詞 白星花金龜; 生物信息學(xué); RNA干擾; 肽聚糖識別蛋白

中圖分類號： S 433.5

文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019256

Construction of a hemocoel injection interference system for Protaetia brevitarsis larvae

WANG Libo1，2， SHU Changlong2， ZHU Yanming1*， GENG Lili2*

（1. Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China; 2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and

Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

In this study， RNA interference system was established for the larvae of Protaetia brevitarsis， an important agricultural pest in order to lay a foundation for the study of immune-related gene functions. The expression of peptidoglycan-recognition protein LB （PGRP-LB） gene was successfully interfered by intravenous injection of dsRNA. It was found that the highest silencing efficiency of pgrp-lb gene was achieved when the quantity of dsRNA was 9 μg and the samples were taken 48 hours after injection. When Bt strain G03 （no insecticidal activity against P.brevitarsis） was injected into the blood cavity， the silencing of pgrp-lb gene destroyed the immune defense system of P.brevitarsis larvae and significantly increased the sensitivity of P.brevitarsis to the strain G03. The construction of the strain expressing the dsRNA of immune recognition gene may provide a new method for biological control of P.brevitarsis.

Key words

Protaetia brevitarsis; bioinformatics; RNAi; peptidoglycan-recognition protein

白星花金龜Protaetia brevitarsis屬鞘翅目Coleoptera多食亞目Polyphaga金龜科Scarabaeoidea，廣泛分布于我國東北、華北、黃淮海、甘肅、新疆等地區(qū)，成蟲取食14科26屬29種植物[1]，造成作物嚴(yán)重減產(chǎn)。在其2001年入侵新疆地區(qū)后大量增殖，暴發(fā)成災(zāi)[2]，是一種危害嚴(yán)重、防治困難的農(nóng)業(yè)害蟲。白星花金龜一年發(fā)生1代，其幼蟲多以腐敗物為食，常見于堆肥和腐爛秸稈中，對環(huán)境適應(yīng)性較強[3]，具有強大的免疫能力、消化能力[4]。一般生物防治方法如蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis（簡稱Bt），對白星花金龜幼蟲的生物防控效果不盡如人意[5]，急需開辟新的生防途徑。

昆蟲RNA干擾的方法包括浸泡、注射、飼喂、轉(zhuǎn)染、病毒侵染等手段。其中注射法應(yīng)用較多，即通過注射的方式將dsRNA、siRNA導(dǎo)入昆蟲的卵、血腔、蛹、特定組織等[6-9]，引發(fā)系統(tǒng)性干擾效應(yīng)。自RNAi在果蠅中實現(xiàn)以來，在鞘翅目、鱗翅目Lepidoptera、膜翅目Hymenoptera、雙翅目Diptera昆蟲中均有實現(xiàn)RNAi的報道。在鞘翅目中已經(jīng)有17種昆蟲實現(xiàn)RNAi，研究對象主要集中在赤擬谷盜Tribolium castaneum、紅棕象甲Rhynchophorus ferrugineus、非洲甘薯象Cylas puncticollis、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata、玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera等一類體型較小的甲蟲中[7，10-14]。研究發(fā)現(xiàn)，dsRNA或siRNA注射濃度、采樣時間、昆蟲形態(tài)的大小、對RNA干擾的敏感程度、目的基因的區(qū)域選擇等因素對于干擾效率均具有較大的影響。長紅錐蝽Rhodnius prolixus幼蟲、印度柞蠶Antheraea mylitta的研究中還發(fā)現(xiàn)發(fā)育階段較早、體型較小的昆蟲對干擾較為敏感[15-17]。

PGRP-LB蛋白是一種能夠特異性結(jié)合肽聚糖的酰胺酶類肽聚糖識別蛋白（peptidoglycan-recognition protein，PGRP）L型家族蛋白[18]，只有一個保守的PGRP結(jié)構(gòu)域[19-20]。對黑腹果蠅Drosophila melanogaster、埃及伊蚊Aedes aegypti、赤擬谷盜等昆蟲的研究表明[21-23]，其表達受到免疫缺陷（immune deficiency pathways，IMD）途徑的調(diào)控。對小菜蛾P(guān)lutella xylostella的研究發(fā)現(xiàn)，PGRP-LB蛋白能夠積極地響應(yīng)革蘭氏陽性菌Bt菌株的入侵并大量表達，酶解肽聚糖，負(fù)反饋調(diào)節(jié)免疫缺陷途徑[24]。抑制免疫反應(yīng)在維持腸道微生物群落結(jié)構(gòu)方面起到了重要作用[25-27]。另一方面，在對斯氏按蚊Anopheles stephensi的研究中發(fā)現(xiàn)，免疫識別蛋白影響圍食膜蛋白，進而影響免疫耐受能力，在抵抗瘧原蟲入侵中發(fā)揮功能[28]。以PGRP-LB蛋白為研究對象對昆蟲免疫機制、昆蟲的生物防治具有重要意義。因此，本研究以白星花金龜pgrp-lb為目的基因，預(yù)測蛋白性質(zhì)及功能，并建立其幼蟲血腔注射的RNAi體系，研究目的基因干擾對昆蟲免疫及腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx及培養(yǎng)方法

供試?yán)ハx：白星花金龜3齡幼蟲由河北省滄州市農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所惠贈;飼養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度（25±2）℃，濕度（50±2）%，光周期L∥D=14 h∥10 h;生存環(huán)境為腐殖土∶木屑∶白星花金龜幼蟲糞便為10∶5∶1的人工土壤環(huán)境。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

對白星花金龜幼蟲進行體表消毒，沿腹中線解剖，取出中腸組織，去除中腸內(nèi)容物后于液氮中凍存。采用液氮研磨的方法破碎組織，以Triquick Reagent（Solarbiolife science）說明書提取中腸組織總RNA，0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。用DNase I消化總RNA，消化后使用RNA抽提試劑（pH 5.2）進行抽提，異丙醇沉淀總RNA后使用75%乙醇洗滌，沉淀用DEPC水溶解，0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA抽提質(zhì)量，并使用微量分光光度計（NanoDropTM，Thermo FisherTM，美國）檢測濃度，對總RNA進行稀釋處理，使樣品濃度均為1 μg/μL，使用SuperScript IV First-Strand Synthesis System kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3 白星花金龜幼蟲免疫識別蛋白PGRP-LB的生物信息學(xué)分析及核酸序列克隆

根據(jù)本實驗室前期獲得的白星花金龜幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果設(shè)計其上下游引物（表1），以cDNA為模板獲得白星花金龜幼蟲pgrp-lb基因片段，測序后進行生物信息學(xué)分析：使用 DNAMAN 7.0軟件分析PGRP-LB氨基酸序列、使用ProtParam工具分析蛋白理化性質(zhì)，使用SMART軟件及SOPMA軟件分析蛋白結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，使用Phyre2及SWISS MODEL預(yù)測其三級結(jié)構(gòu);使用MEGA 7.0軟件將白星花金龜幼蟲與其他50種昆蟲的PGRP-LB氨基酸序列進行比對分析，鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，使用戴霍夫法（Dayhoff）計算距離矩陣，檢驗計算100次。

1.4 白星花金龜幼蟲免疫識別蛋白pgrp-lb基因干擾載體的構(gòu)建

根據(jù)獲得的白星花金龜幼蟲免疫識別蛋白PGRP-LB中關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域序列，利用在線RNAi序列預(yù)測網(wǎng)站（http：∥rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/）及Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴增pgrp-lb基因的RNA干擾片段引物，上下游分別引入Bgl II及Sal I酶切位點，同時設(shè)計了干擾GFP蛋白的RNA干擾片段擴增引物，分別引入了Pst I及Sal I酶切位點（表1）。使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase進行PCR擴增，回收PCR擴增產(chǎn)物。分別對目的片段及L4440干擾載體進行酶切后連接，獲得L4440-pgrp-lb及L4440-gfp重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞（氨芐青霉素抗性），PCR鑒定、雙酶切鑒定并測序。將L4440-pgrp-lb及L4440-gfp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化用超級感受態(tài)制備法制備的HT115感受態(tài)細(xì)胞中，PCR及雙酶切鑒定篩選陽性克隆。

1.5 白星花金龜免疫識別蛋白PGRP-LB干擾dsRNA的表達優(yōu)化

采用Kamath等[29]的方法對dsRNA表達體系進行優(yōu)化，將帶有L4440-pgrp-lb重組質(zhì)粒的HT115菌株接種于雙抗（氨芐青霉素：終濃度100 μg/mL及四環(huán)素：濃度12.5 μg/mL）LB培養(yǎng)基中進行第一次活化，在37℃下220 r/min培養(yǎng)12～16 h，菌液按1∶50接種到雙抗2×YT培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)至OD600為0.5、1、1.5、2后分別加入IPTG至終濃度為1 mmol/L。另外在菌液培養(yǎng)至OD600為0.5后，加入IPTG至終濃度分別為0.2、1、5、25 mmol/L，在30℃下250 r/min繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在4℃下4 500 r/min離心5 min，菌體用DEPC處理水懸洗1次。采用苯酚法提取總RNA，并使用DNase I及RNase A消化處理后抽提獲得dsRNA。使用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用NanoDrop測定消化后總RNA濃度，并使用Image J分析dsRNA所占比例。

1.6 白星花金龜幼蟲免疫識別蛋白基因RNA干擾dsRNA注射劑量篩選

選取3齡白星花金龜幼蟲40頭分組，每組8頭，體表消毒后注射dsRNA，對照組分為注射gfp-dsRNA和DEPC水，處理組每頭注射pgrp-lb-dsRNA 10 μL，每組濃度分別為：0.2、0.4、0.9 μg/μL，注射后隔離在6孔生測板中，并放置在人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在注射后36 h取樣，取樣方法、總RNA提取，cDNA合成方法同上，以β-actin蛋白基因作為內(nèi)參基因進行熒光定量分析，每個試驗處理取3個樣本。實時熒光定量PCR反應(yīng)檢測目的基因表達量，體系參照SuperReal PreMix Plus使用說明，使用ABI 7500 Real Time PCR擴增儀進行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃ 15 min; 95℃ 10 s，62℃ 32 s，40個循環(huán)。

1.7 白星花金龜幼蟲免疫識別蛋白基因RNA干擾時效篩選

選取3齡白星花金龜幼蟲40頭，分別作為對照組及處理組，每組20頭，體表消毒每頭注射濃度為0.4 μg/μL dsRNA 10 μL（對照組注射gfp-dsRNA，試驗組注射pgrp-lb-dsRNA），注射后隔離在6孔生測板中，并放置在人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在注射后24、48、72 h取樣，每個時間點取樣6頭，取樣方法、總RNA提取及cDNA合成方法同上。熒光定量PCR檢測目的基因的表達量，每個時間點取3個樣本。熒光定量PCR反應(yīng)條件及體系同上。

1.8 pgrp-lb基因干擾的白星花金龜幼蟲對Bt菌株敏感性的檢測

選取本實驗室保存的對鞘翅目無殺蟲活性的Bt菌株G03進行血腔注射試驗，濃度為：1.57×107、3.14×106、6.28×105、1.26×105、2.51×104、5.02×103 cfu/mL。注射dsRNA后48 h進行G03菌株注射，每個濃度10頭幼蟲，3次重復(fù)，以注射gfp-dsRNA的幼蟲作為對照，3 d后統(tǒng)計死亡率，分析白星花金龜幼蟲免疫基因干擾對Bt菌株敏感性影響。

1.9 數(shù)據(jù)分析

基因相對表達量的計算采用2-ΔΔCT法[31]，pgrp-lb基因表達量是與內(nèi)參基因相比的相對表達量，并以未處理的對照組進行歸一化處理。

幼蟲死亡率計算方法如下：

死亡率=死蟲數(shù)/（死蟲數(shù)+活蟲數(shù)）×100%;

校正死亡率=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）×100%。

參照賈春生的方法進行致死中濃度（LC50）計算[32]。數(shù)據(jù)差異顯著性分析采用生物統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS中的單因素方差分析（ANOVA）方法。

2 結(jié)果

2.1 白星花金龜幼蟲中腸免疫相關(guān)蛋白pgrp-lb基因的生物信息學(xué)分析

2.1.1 PGRP-LB蛋白序列克隆及關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域分析

以cDNA為模板，克隆得到pgrp-lb基因序列1 499 bp，測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，GenBank登錄號MK691594。白星花金龜PGRP-LB蛋白的第25～168位氨基酸殘基上存在PGRP的結(jié)構(gòu)域，蛋白二級結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲。由預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)可知，該蛋白由3個主要的α螺旋部分及無規(guī)則卷曲部分纏繞中央的β片層構(gòu)成，這與已報道的PGRP-LB蛋白結(jié)構(gòu)相同。

2.1.2 白星花金龜PGRP-LB蛋白氨基酸序列與其他昆蟲的PGRP-LB序列進化分析

為了進一步分析免疫相關(guān)蛋白PGRP-LB在鞘翅目及其他昆蟲中的親緣關(guān)系并預(yù)測其生物學(xué)功能，構(gòu)建了PGRP-LB蛋白親緣關(guān)系樹。其中，白星花金龜與鞘翅目多食亞目的食糞金龜Onthophagus taurus序列相似程度較高，說明兩者遺傳關(guān)系較為接近，PGRP-LB蛋白序列具有較高的相似性，這與物種親緣關(guān)系分布一致。說明了其PGRP-LB蛋白在功能和結(jié)構(gòu)上與已報道的其他鞘翅目昆蟲相似（圖1）。

2.2 pgrp-lb基因RNA干擾載體構(gòu)建

2.2.1 pgrp-lb基因克隆及功能預(yù)測

通過在線預(yù)測（http：∥rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/）蛋白表達的ORF區(qū)541 bp位點到1 207 bp位點中潛在的RNAi靶位點，在734～1 059 bp位點處得到10個可能的RNAi位點，所以選擇了該325 bp序列作為干擾片段進行克隆。同時以實驗室已有的GFP蛋白核酸序列為模板，對其中173～677 bp片段進行克隆。將目的片段和L4440載體進行雙酶切并連接，成功構(gòu)建了L4440-pgrp-lb及L4440-gfp重組質(zhì)粒（圖2）。

2.2.2 pgrp-lb-dsRNA及gfp-dsRNA的誘導(dǎo)表達

分別對含有L4440-pgrp-lb和L4440-gfp重組質(zhì)粒的HT115菌株dsRNA誘導(dǎo)表達，并用DNase I和RNase A對誘導(dǎo)表達后的總RNA進行消化，電泳結(jié)果顯示菌體DNA及RNA被降解，目的條帶為500 bp和300 bp，與pgrp-lb-dsRNA 和 gfp-dsRNA預(yù)期大小一致，干擾載體構(gòu)建成功（圖3）。為了大量表達dsRNA，對其表達條件進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)不同接菌濃度影響較小，而IPTG終濃度影響較大，在終濃度為5 mmol/L時表達效果最好（圖4）。

2.3 pgrp-lb-dsRNA劑量對目的基因干擾效率的影響

檢測不同劑量dsRNA注射白星花金龜幼蟲體腔所能獲得的最大干擾效率，對3組不同濃度dsRNA注射的對照組和處理組白星花金龜幼蟲中腸cDNA樣品進行實時熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示，在dsRNA濃度為0.9、0.4、0.2 μg/μL時目的基因表達量分別為對照組的17.2%、63.4%、85.1%，注射濃度為0.9 μg/μL時干擾效率最大，目的基因的相對表達量顯著低于其他兩組（圖5，P<0.05）。

2.4 不同處理時長下pgrp-lb-dsRNA干擾效率變化

為了檢測dsRNA注射后不同間隔時間采樣下目的基因表達量變化，對對照組和處理組白星花金龜幼蟲中腸cDNA樣品進行實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示，在dsRNA注射后24、48、72 h時干擾效率分別為68.3%、25.5%、63.7%，48 h時采樣干擾效率最大，目的基因的相對表達量顯著低于其他兩組（圖6，P<0.05）。

2.5 pgrp-lb基因干擾的白星花金龜幼蟲對Bt菌株的敏感性分析

為了進一步分析免疫基因干擾是否破壞了白星花金龜幼蟲的免疫防御系統(tǒng)，影響了幼蟲對Bt菌株敏感性，選擇對白星花金龜無殺蟲活性的Bt菌株G03對免疫識別基因pgrp-lb干擾的幼蟲進行血腔注射，72 h后對幼蟲死亡率進行統(tǒng)計（表2）。結(jié)果表明，pgrp-lb處理組中G03菌株的LC50極顯著低于對照組（P <0.01），干擾pgrp-lb基因增加了幼蟲對G03菌株的敏感性。

3 討論

華北大黑鰓金龜Holotrichia oblita、食糞金龜?shù)冉瘕斂浦械亩喾N甲蟲已經(jīng)實現(xiàn)了通過注射dsRNA對目的基因的干擾，但白星花金龜中尚無相關(guān)的研究報道。大黑鰓金龜?shù)臍馕蹲R別蛋白（OBP）研究中，通過將dsRNA顯微注射進入雌性成蟲的頭部實現(xiàn)對OBP的干擾[33];在食糞金龜科的復(fù)眼發(fā)育研究中，通過將不同稀釋濃度的dsRNA注射進入食糞金龜科不同屬昆蟲3齡幼蟲的血腔，均實現(xiàn)了對Orthodenticle基因的干擾，這一結(jié)果說明了注射濃度及昆蟲的敏感性對干擾效率的影響[34]。本研究發(fā)現(xiàn)0.9 μg/μL濃度干擾效率最高，這與煙粉虱Bemisia tabaci的CYP6CM1基因研究中，高濃度dsRNA所引發(fā)的基因干擾效率更好的結(jié)果相符[36]。

白星花金龜幼蟲腸道菌落環(huán)境復(fù)雜，田小燕等[4]和Shan等[35]從白星花金龜幼蟲腸道內(nèi)分離的共生菌株可以有效抑制蘇云金芽胞桿菌的生長。這種復(fù)雜的共生關(guān)系得益于昆蟲在漫長的進化過程中形成的一套包括免疫防御、免疫穩(wěn)定、免疫監(jiān)視功能在內(nèi)的快速準(zhǔn)確的免疫防御系統(tǒng)。PGRP-LB蛋白在這一過程中起到了重要作用，通過降解游離和進入細(xì)胞間的肽聚糖（peptidoglycan，PGN），抑制了免疫反應(yīng)，穩(wěn)定了腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，保證了對生存有利菌株的存在，對PGRP-LB蛋白的研究有助于理解昆蟲與其腸道菌落間的互作關(guān)系。

研究首次建立了血腔注射dsRNA介導(dǎo)的白星花金龜RNA干擾體系，為進一步使用RNAi方法研究白星花金龜基因功能奠定了基礎(chǔ)。并通過使用HT115菌株構(gòu)建dsRNA表達體系，壓縮了干擾成本。利用該體系成功干擾了免疫識別蛋白pgrp-lb基因的表達，并發(fā)現(xiàn)pgrp-lb基因沉默的白星花金龜幼蟲對Bt菌株敏感性顯著提高，為進一步研究白星花金龜中腸免疫與Bt菌株侵染間的關(guān)系提供了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）