吳茂森，陳慶賢，劉麗霞

（海南西部中心醫(yī)院藥學(xué)部，儋州 571700）

近年來，腫瘤已經(jīng)成為威脅人類生存健康的重要疾病，其中肺癌的發(fā)病率不斷上升。惡性腫瘤患者的生存率低，在很大程度上與干細胞樣細胞的存在有關(guān)。腫瘤干細胞具有自我更新、增殖、分化的能力，參與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1］，腫瘤干細胞是目前廣大專家學(xué)者廣泛關(guān)注的問題之一。腫瘤的發(fā)展受癌基因、抑癌基因、生長因子的影響。血瘀證是惡性腫瘤臨床患者中醫(yī)癥狀，主要治療手段是活血化瘀，川芎嗪是中藥活血藥中川芎的主要有效成分。本實驗主要是研究分析了川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞原癌基因表達的抑制作用。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑細胞株：高轉(zhuǎn)移性人巨細胞肺癌細胞PG-BE1，購自上海酶研生物科技有限公司上海酶研生物科技有限公司。主要試劑：鹽酸川芎嗪（常州制藥廠）；雙抗（Hyclone公司）；胎牛血清（FBS）（Gibco公司）；人堿性成纖維細胞生長因子（FGF）（上海酶聯(lián)免疫生物有限公司）；重組人表皮生長因子（EGF）［（賽默飛飛世爾（上海）］；胰島素（美國 Sigma公司）；B27添加劑（美國Gibco公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（上海浩然生物科技有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（Sigma-Aldrich 公司）；VEGE ELISA試劑盒（美國R&D公司）；β-Actin Rabbit mAb（美國CST公司）；Anti-BCRP/ABCG2抗體（美國Abcam公司）；Anti-HIF-1-α抗體（美國Abcam公司）；Goat Anti-Rabbit IgG H＆ L（HRP）、GoatF（ab’）2 ployclonal Secondary Antibody to mouse IgG+IgM+IgAH&L（HRP）（均購自美國Abcam公司）；主要儀器：CO2培養(yǎng)箱（上海京孚公司）；光學(xué)顯微鏡（上海光學(xué)儀器一廠）；PCR儀（美國ABI公司）；低溫高速離心機（美國Thermo公司）；-80℃冰箱（海爾）；酶標儀（美國Bio Tek公司）；微量移液器等。

1.2 PG-BE1干細胞樣細胞分選采用無血清成球培養(yǎng)法分選PG-BE1干細胞樣細胞：常規(guī)復(fù)蘇PG-BE1細胞后在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。對細胞進行傳代培養(yǎng)，在達到指數(shù)生長期的時候，胰酶消化、沖洗、重新置于培養(yǎng)基中，調(diào)整其濃度為2×104個/mL，接種2mL/孔于六孔板中。待細胞成球、表面顏色變暗、折光度變低時收集細胞。

1.3 檢測PG-BE1干細胞樣細胞與親代細胞的克隆形成能力采用平板克隆形成實驗檢測PG-BE1干細胞樣細胞與親代細胞的克隆形成能力：收集兩種細胞，消化后置于培養(yǎng)基中，調(diào)整其濃度為200個/mL，分別接種2mL/孔于六孔板中。培養(yǎng)6天后棄去培養(yǎng)液，用95%乙醇固定并結(jié)晶紫染色，于顯微鏡下觀察。每孔隨機選擇5個視野下超過10個細胞的克隆灶數(shù)目。

1.4 檢測PG-BE1干細胞樣細胞與親代細胞表面OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表達Western blot法檢測PG-BE1干細胞樣細胞與親代細胞表面OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表達：收集兩種細胞后，提取各組細胞總蛋白并測定其總蛋白濃度。制備濃縮膠與分離膠、加樣、電泳、膜轉(zhuǎn)移、脫脂奶粉封閉、一抗與二抗孵育、暗室中發(fā)光、數(shù)據(jù)分析。以原代細胞光密度值作為參照，采用相對光密度值（RQ）表示。

1.5 分組與藥物干預(yù)將PG-BE1干細胞樣細胞培養(yǎng)48h，之后隨機分為空白對照組、低、中、高劑量川芎嗪組（分別為100μg/mL、300μg/mL、500μg/mL），在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時，之后收集各組細胞。

1.6 各組PG-BE1干細胞樣細胞的VEGF表達ELISA法檢測各組PG-BE1干細胞樣細胞的VEGF表達：將各組細胞的上清液收集后，嚴格按照ELISA試劑盒步驟操作。

1.7 各組PG-BE1干細胞樣細胞的HIF-1α和ABCG2蛋白表達Westen blot法檢測各組PG-BE1干細胞樣細胞的HIF-1α和ABCG2蛋白表達：收集各組細胞，按照1.4.3的步驟操作，檢測HIF-1α和ABCG2蛋白的表達。

1.8 VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表達RT-PCR檢測VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表達：收集各組細胞，提取細胞總RNA，置于PCR儀中進行逆轉(zhuǎn)錄操作，按照熒光定量PCR反應(yīng)程序進行擴增，反應(yīng)結(jié)束后，使用SDS軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析實驗所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示。用SPSS 19.0進行統(tǒng)計處理，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，多組內(nèi)兩組間比較采用 LSD檢驗。以P<0.05判定差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 PG-BE1干細胞樣細胞分選接種后第3天開始可以看見有細胞球形成，之后球體逐漸越來越大，到第6天時，細胞球表面顏色變暗、球體折光度變低，結(jié)果見圖1。

圖1 PG-BE1干細胞樣細胞形成的細胞形態(tài)（×200）

2.2 PG-BE1干細胞樣細胞克隆形成能力PG-BE1原代細胞與干細胞樣細胞的平板克隆灶形成數(shù)目分別為（8.47±1.48）個、（4.25±1.09）個，兩組相比較，PGBE1干細胞樣細胞克隆灶形成能力更強，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 PG-BE1干細胞樣細胞與親代細胞表面OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表達以原代細胞光密度值作為參照（設(shè)為1.00），并與其相比較，PG-BE1干細胞樣細胞表面OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表達均強于原代細胞（P<0.05，表1、圖2）。

表1 PG-BE1原代細胞與干細胞樣細胞表面相關(guān)標記蛋白的表達

圖2 Westen blot檢測SOX-2、OCT-4、Nanog蛋白表達的結(jié)果

2.4 不同濃度川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞VEGF表達的影響低、中、高濃度的川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞的VEGF表達均有抑制作用（P<0.05），各藥物組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表2）。

表2 不同濃度川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞VEGF表達的影響（ng/mL）

2.5 不同濃度川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞HIF-1α和ABCG2表達的影響低、中、高濃度的川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞的HIF-1α和ABCG2表達均有抑制作用（P<0.05），各藥物組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表3、圖3）。

2.6 不同濃度川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表達的影響低、中、高濃度的川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞的VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表達均有抑制作用（P<0.05），各藥物組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表4）。

表3 不同濃度川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞HIF-1α和ABCG2表達的影響

圖3 不同濃度川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞HIF-1α和ABCG2的表達

表4 不同濃度川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表達的影響

3 討論

中草藥對腫瘤細胞具有抑制作用，其可能是通過抗腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路［2-4］。川芎是一種活血藥，常用于活血行氣，祛風(fēng)止痛，活血祛瘀作用廣泛，適宜瘀血阻滯各種病癥，近年來發(fā)現(xiàn)川芎嗪具有抗腫瘤的作用，其主要的有效成分就是川芎嗪。有研究報道，腫瘤組織中存在著少數(shù)具有自我更新能力的細胞就是腫瘤干細胞，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)的根源，當機體腫瘤干細胞高度表達時，就會出現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［5］。肺癌干細胞比普通肺細胞更容易突變轉(zhuǎn)化為癌細胞，經(jīng)過多次突變就會轉(zhuǎn)變?yōu)榉伟└杉毎?/p>

目前，干細胞表面標志相關(guān)基因主要有Oct-4、Sox-2、Nanog［6］。Oct-4是POU家族的轉(zhuǎn)錄因子，Sox-2屬于Sox家族成員，Nanog于胚胎干細胞中被發(fā)現(xiàn)，在維持干細胞干性的自我更新及多能性等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此廣大學(xué)者認為這三種轉(zhuǎn)錄因子的表達是區(qū)別其他普通腫瘤細胞的標志之一。本研究結(jié)果顯示，Oct-4、Sox-2、Nanog三種轉(zhuǎn)錄因子在PG-BE1干細胞樣細胞的表達高于其原代細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1是存在于低氧微環(huán)境中作用于細胞核的的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在腫瘤生成與轉(zhuǎn)移、腫瘤干細胞干性維持、血管生成等方面起著重要作用，其過度表達會促進腫瘤干細胞的生長增殖。HIF-1α是HIF-1的特異性氧調(diào)節(jié)亞單位，可以通過刺激Oct4、Sox2等關(guān)鍵基因促進腫瘤干細胞樣細胞的維持，促進腫瘤干細胞樣細胞浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子表達［7］，還參與腫瘤血管的生成，刺激血管生成因子分泌，通過抑制HIF-1α基因的表達，來協(xié)調(diào)其下游的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達［8］。HIF-1α在正常組織中不表達，而在肺癌、宮頸癌、乳腺癌等腫瘤組織中過度表達［9-11］。本實驗研究中，western blot結(jié)果顯示不同濃度的川芎嗪對HIF-1α有一定的抑制作用，而RT-PCR實驗也進一步證明了這一點，提示川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞的抑制作用可能與HIF-1α表達有關(guān)。

VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最強烈的血管生成因子，存在于人體的各個器官組織，在缺氧環(huán)境下，癌基因和抑癌基因會對VEGF進行調(diào)節(jié)，增加VEGF表達［12］。目前報道，正常組織中VEGFmRNA表現(xiàn)為陰性，而在惡性腫瘤組織中則表達為陽性。而VEGF是HIF-1α分子介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生過程中密切相關(guān)的基因之一，是HIF-1α最重要的靶基因，HIF-1α高表達時會上調(diào)VEGF基因的表達，因為HIF-1是VEGF的主要刺激因子。VEGF會導(dǎo)致血管通透性增強，加快腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的進程，另外腫瘤細胞也可以通過合成、分泌VEGF，再反過來促進腫瘤血管的生長［13］。血管生成推動了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為腫瘤細胞的增長創(chuàng)造了有利條件，加速腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移等［14-15］。川芎嗪等活血藥能降低腫瘤的微血管密度，抑制腫瘤細胞VEGF表達，對腫瘤血管的生成產(chǎn)生一定的抑制作用。HIF-1α是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要標記物，而VEGF是其重要的靶基因，因此準確檢測HIF-1α、VEGF將對肺癌的臨床工作具有重要意義。本實驗通過ELISA實驗檢測，顯示不同濃度的川芎嗪均抑制PG-BE1干細胞樣細胞的VEGF的表達，RT-PCR結(jié)果顯示川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞的VEGF mRNA的表達也有作用，推測其作用機制可能是通過抑制HIF-1α基因的表達，進一步抑制VEGF的表達。

ABCG2是三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體（ABC）轉(zhuǎn)運家族的一種轉(zhuǎn)運蛋白，主要存在于細胞膜上，在維持機體正常生理功能和細胞自身結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要作用，其在正常人胚胎干細胞中并不表達，而對腫瘤則會導(dǎo)致其耐藥，它的過度表達與腫瘤密切相關(guān)，被認為是腫瘤干細胞的標記物［16］。ABC轉(zhuǎn)運蛋白通過ATP水解釋放能量來使細胞中的能量、代謝物、藥物等物質(zhì)逆濃度梯度滲出洗胞外面，而川芎嗪具有阻滯Ca2+活性的功能，可能通過抑制ATP依賴的轉(zhuǎn)運蛋白的表達來起到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用［17］。本實驗研究以ABCG2蛋白作為腫瘤干細胞標志物，觀察川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞的作用，western blot檢測結(jié)果顯示不同濃度的川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞的ABCG2表達均有一定的抑制作用，進一步經(jīng)PT-PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可明顯抑制ABCG2 mRNA的表達，western blot與PT-PCR的結(jié)果基本一致。川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞的殺傷作用可能是通過抑制ABCG2蛋白在mRNA水平上的表達實現(xiàn)的。

本研究結(jié)果顯示，無血清培養(yǎng)法可以有效聚集PG-BE1干細胞樣細胞，相對于原代細胞而言，PG-BE1干細胞樣細胞的HIF-1α、VEGF表達均上調(diào)，具有更強的促血管生成能力，其表面高表達ABCG2轉(zhuǎn)運蛋白，比普通細胞的耐藥性更強。表明川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞HIF-1α、VEGF、ABCG2表達在某種程度上有一定抑制作用。

腫瘤干細胞是引起腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)的根本原因，近年來對干細胞的研究越來越多越來越深。中醫(yī)藥是我國的瑰寶，有效的運用中醫(yī)藥來調(diào)控治療腫瘤是一種好的治療方法。而在研究肺癌干細胞的領(lǐng)域中，還有許多問題亟待解決，需要廣大學(xué)者的積極努力探索。