王慧豐，徐亦辰，趙文婧，陳維平

微小組織結(jié)構(gòu)是指在組織工程構(gòu)建過程中獲得，具有體積小、結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單等特點(diǎn)的組織樣結(jié)構(gòu)；與從成體器官分離、臨床病理穿刺活檢等途徑獲取的組織顯著不同，因此在制備微小組織結(jié)構(gòu)石蠟切片時(shí)，存在諸多問題。本科室根據(jù)微小組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過改良和優(yōu)化經(jīng)典石蠟包埋、切片制備方法，分析適合微小組織結(jié)構(gòu)石蠟包埋切片的制作方案，最終完成厚度為5 μm連續(xù)石蠟切片的制作，其蠟帶完整，HE染色可見微小組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞形態(tài)正常、著色效果好、色澤對(duì)比飽滿、各層次結(jié)構(gòu)完整，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 選取第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，由廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2儀器設(shè)備 石蠟切片機(jī)(RM2235 cwEU，徠卡公司)；切片機(jī)刀片(徠卡 819)。益迪生物組織攤烤片機(jī)(YD-A、B，浙江金華益迪醫(yī)療公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH2500，天津泰斯公司)；正置相差顯微鏡(尼康 ECLIPSE E100，日本)；包埋框；染色架；Corning 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(內(nèi)徑14 mm，美國康寧公司)等。

1.1.3試劑 石蠟切片，100%、95%乙醇，二甲苯，均購自天津市富宇公司。

1.2 方法

1.2.1取材 選用第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，加入胰腺組織誘導(dǎo)液進(jìn)行定向分化誘導(dǎo)，連續(xù)培養(yǎng)50天，培養(yǎng)孔板內(nèi)肉眼可見微小組織結(jié)構(gòu)(圖1)，經(jīng)PBS沖洗，2%福爾馬林固定30 min后，顯微鏡下機(jī)械剝離，移入小青瓶。

1.2.2脫水 梯度乙醇逐級(jí)脫水，每次8 min，其中100%乙醇脫水2次。具體操作步驟詳見表1。

1.2.3透明 使用二甲苯對(duì)微小組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行透明處理，微小組織結(jié)構(gòu)大小為2 mm×1 mm×1 mm，經(jīng)二甲苯透明2.5 min可充分使組織透明(表1)。

1.2.4浸蠟 石蠟二甲苯(1 ∶1)混合溶液處理30 min，石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別處理30 min，保證微小組織結(jié)構(gòu)浸蠟充分(表1)。

1.2.5包埋 將60 ℃恒溫箱內(nèi)熔化的石蠟倒入包埋框內(nèi)(材質(zhì)：銅)，用預(yù)熱的鑷子將完成浸蠟的微小組織結(jié)構(gòu)塊埋于石蠟中，對(duì)包埋組織進(jìn)行編號(hào)。

1.2.6切片 修整蠟塊，保留微小組織結(jié)構(gòu)蠟塊邊緣1 cm石蠟，調(diào)整組織塊形態(tài)至易于切片的角度，調(diào)整切片角度和組織塊位置，安裝刀片，調(diào)整切片厚度為最大，至可見微小組織結(jié)構(gòu)但未暴露微小組織結(jié)構(gòu)的切面，調(diào)整切片厚為5 μm進(jìn)行連續(xù)切片。隨后用鑷子夾蠟片，放入攤片機(jī)中進(jìn)行展片。用載玻片撈片、儲(chǔ)存。

1.2.7HE染色 根據(jù)微小組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)合組織學(xué)書籍[1]及文獻(xiàn)報(bào)道[2]確定適合染色方式，具體操作步驟：恒溫箱60 ℃拷片30 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟10 min；二甲苯無水乙醇溶液(1 ∶1)水化5 min，100%、95%、80%、75%乙醇各5 min，二甲苯無水乙醇溶液(1 ∶1 )5 s，蘇木精染液10 min，自來水洗浮色15 s，鹽酸乙醇分化1 s，自來水返藍(lán)30 min，伊紅染液20 s，自來水或95%乙醇洗浮色并調(diào)整染色強(qiáng)度，經(jīng)70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ乙醇脫水5 s，二甲苯無水乙醇溶液(1 ∶1)脫水5 s，二甲苯Ⅰ、Ⅱ乙醇脫水15 s，適當(dāng)晾干后，使用中性樹脂封固。

2 結(jié)果

按照優(yōu)化步驟操作，可順利完成微小組織結(jié)構(gòu)蠟塊的制備(圖2)，脫水后組織塊無明顯收縮，透明后浸蠟充分，組織與蠟塊融為一體，無明顯界限。采用徠卡超薄切片機(jī)，選擇切片厚度為5 μm，可順利完成微小組織結(jié)構(gòu)連續(xù)切片的制作，切片的切面平整、邊緣規(guī)則，切片內(nèi)的組織完整，無碎裂、破損。鋪片過程中無明顯掉片、脫片。染色后細(xì)胞排列整齊、細(xì)胞形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整、染色均勻、色澤對(duì)比度好；各層次結(jié)構(gòu)清晰，組織內(nèi)可見中空結(jié)構(gòu)，其游離面襯貼上皮組織(圖3)。

3 討論

組織工程是在體外特定培養(yǎng)條件下構(gòu)建組織樣結(jié)構(gòu)，如組織工程化心肌、組織工程化胰島等。微小組織結(jié)構(gòu)以細(xì)胞成分為主，細(xì)胞間質(zhì)成分少，體積小，多在1 mm3。肉眼下僅可見“米粒樣”微小組織塊，倒置顯微鏡下透光度差或不透光的團(tuán)塊。為了解組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)及分布等，制備高質(zhì)量的石蠟切片標(biāo)本是最直觀、最簡便的技術(shù)方法。但經(jīng)典石蠟切片技術(shù)多適用于成體器官的組織標(biāo)本，組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、有豐富的細(xì)胞間質(zhì)，甚至含有結(jié)締組織成分支持[3]。微小組織結(jié)構(gòu)由于間質(zhì)成分少或缺如、細(xì)胞比例較大等原因，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)松散，不易取材；標(biāo)本體積過小，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作中易丟失；不易控制脫水時(shí)間而導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化；透明時(shí)間掌握不好使組織變硬而導(dǎo)致切片時(shí)出現(xiàn)空洞。

表1 微小組織結(jié)構(gòu)脫水、透明、浸蠟時(shí)間

①②③圖1 微小組織結(jié)構(gòu)肉眼可見體積小,僅為2 mm×1 mm×1 mm;較難觀察細(xì)胞排列、形態(tài)及分布 圖2 蠟塊連續(xù)切片:切片的切面平整、邊緣規(guī)則,切片內(nèi)的組織完整,無碎裂、破損 圖3 蠟塊HE染色:染色后細(xì)胞排列整齊、細(xì)胞形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整、染色

微小組織體積小、結(jié)構(gòu)松散，不易取材，操作過程容易導(dǎo)致組織受擠壓而變形、結(jié)構(gòu)破壞，因此在實(shí)際操作過程中，采取先固定，后取材的方式，盡量保持微小組織結(jié)構(gòu)完整。根據(jù)間質(zhì)少、細(xì)胞多的特點(diǎn)，反復(fù)探索后確定福爾馬林固定液濃度為2%。微小組織結(jié)構(gòu)的脫水是整個(gè)石蠟包埋步驟的關(guān)鍵。成體組織脫水步驟可從75%乙醇開始[4]，但微小組織缺少間質(zhì)成分，高濃度脫水導(dǎo)致細(xì)胞失水過快，破壞組織的細(xì)胞形態(tài)，通過改良常規(guī)脫水步驟，調(diào)整起始濃度從50%乙醇開始，增加為6個(gè)濃度梯度、7次脫水步驟，適當(dāng)延長脫水時(shí)間，保證脫水效果，減少由于快速脫水導(dǎo)致組織過度收縮、變形等情況。微小組織結(jié)構(gòu)體積小，極容易透明過度導(dǎo)致組織“消失”或變硬，二甲苯透明時(shí)必須密切關(guān)注透明程度，提前準(zhǔn)備對(duì)照組織初步探索透明時(shí)間，確保在透明完成瞬間終止透明。常規(guī)的浸蠟時(shí)間多為過夜[5]，為避免浸蠟過程中標(biāo)本丟失，或浸蠟時(shí)間不足導(dǎo)致制作標(biāo)本不理想，通過縮短浸蠟時(shí)間，增加浸蠟次數(shù)，改善浸蠟效果，保證組織周圍及組織內(nèi)無二甲苯殘留。新買石蠟，經(jīng)過反復(fù)凍融，可以改善熔點(diǎn)不同、雜質(zhì)多等問題，為后續(xù)包埋提供良好的材料基礎(chǔ)[6]。質(zhì)量良好的切片，需要摸索出最佳切片機(jī)的切片角度，包括合理修片、根據(jù)調(diào)整組織塊形狀調(diào)整切片方向，盡量選擇適宜微小組織結(jié)構(gòu)的角度，可明顯提高切片質(zhì)量。此外，微小組織結(jié)構(gòu)的染色時(shí)間與成體組織不同，需要反復(fù)多次在顯微鏡下觀察著色效果，反復(fù)調(diào)整，最終確定HE染色時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)關(guān)注組織樣結(jié)構(gòu)的石蠟切片制備，通過改良和優(yōu)化經(jīng)典石蠟切片制備步驟，如組織固定、脫水、透明、浸蠟等，獲得質(zhì)量優(yōu)良的微小組織結(jié)構(gòu)切片，便于對(duì)微小組織結(jié)構(gòu)的深入探索。