辣根過氧化物酶催化2-萘酚硝化反應(yīng)

夏志童 臧 碩 陸洪珅 閆福鵬 李延輝 趙 瑩

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)藥學(xué)院，山東 泰安 271016

辣根過氧化物酶(horseradish Peroxidase，HRP)是從植物辣根菜中提取出來的一種性質(zhì)穩(wěn)定、成本較低的酶[1-2]，由于對(duì)過氧化氫底物特異性強(qiáng)，因此作為一種重要的分析化學(xué)試劑廣泛用于有機(jī)合成、生物轉(zhuǎn)化、臨床化學(xué)、環(huán)境化學(xué)等領(lǐng)域，但是過氧化物酶應(yīng)用在硝化領(lǐng)域還只是在實(shí)驗(yàn)摸索階段[3-7]。為了研究辣根過氧化物酶催化2-萘酚硝化反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采用了水-有機(jī)相雙相反應(yīng)體系，用綠色氧化劑H2O2氧化、辣根過氧化物酶催化硝化2-萘酚，考察了關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)率的影響規(guī)律，并對(duì)主要產(chǎn)物進(jìn)行了分離及鑒定，完成了2-萘酚在辣根過氧化物酶下的催化硝化反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究，同時(shí)為1-硝基2-萘酚的綠色合成提供了一種新方法。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1儀器設(shè)備

P230Ⅱ型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)，IRTracer-100傅立葉變換紅外光譜儀(日本島津)，SZCL-2A數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，HH-2雙孔數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷″?金壇市城東新瑞儀器廠)，AR224CN分析天平(奧豪斯儀器有限公司)，KQ3200E超聲儀(昆山市超聲儀有限公司)，X-5顯微熔點(diǎn)測定儀(北京泰克儀器有限公司)，移液槍(蘭博利德公司)，微量進(jìn)樣器(無錫市東升玻璃儀器廠)，硅膠板G(青島海洋化工有限公司)，廣泛試紙pH 1-14(天津北方化學(xué)試劑廠)，DH-101鼓風(fēng)干燥箱(上海碩光電子科技有限公司)。

1.1.2試劑

辣根過氧化物酶(300 U/mg，購自北京夢(mèng)怡美生物技術(shù)有限公司)，乙萘酚(分析純，洛陽特來化工科技有限公司)，磷酸氫二鈉(分析純，蘇州市萬事發(fā)化工有限公司)，磷酸二氫鈉(分析純，蘇州市萬事發(fā)化工有限公司)，亞硝酸鈉(優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，過氧化氫(30%，萊陽市康德化工有限公司)，薄層及柱層析用硅膠(青島市基意達(dá)硅膠試劑廠)，甲醇(色譜純，上海廣諾化學(xué)科技有限公司)，乙酸乙酯(分析純，上海廣諾化學(xué)科技有限公司)，石油醚：沸程60～90℃(分析純，天津歐博凱化工有限公司)，純凈水(娃哈哈有限公司)。

1.2 方法

1.2.1主要溶液的配制

辣根過氧化物酶的配制：取一定量HRP用磷酸緩沖液配制成0.1 mg/mL備用。

乙萘酚溶液的配制：精密稱取25.4 mg的乙萘酚，用20 mL乙酸乙酯配制成5 mmol/L的溶液備用。

亞硝酸鈉溶液的配制(底物濃度的10倍)：精密稱取103.5 mg的NaNO2，用30 mL緩沖溶液配制成50 mmol/L的溶液備用。

1.2.2辣根或氧化物酶的催化硝化反應(yīng)

50 mL的反應(yīng)體系，在室溫下取25.8 mL的亞硝酸鈉溶液、20 mL乙萘酚溶液，加入磁子，置于磁力攪拌器攪拌混溶，快速加入2.5 mL HRP溶液繼續(xù)攪拌，取1.7 mL H2O2多次少量滴加，反應(yīng)1 h。

反應(yīng)結(jié)束后，將混合溶液置于分液漏斗中，用乙酸乙酯多次萃取，取上層有機(jī)相，常溫自然揮干得粗提物。

1.2.3硝化產(chǎn)物的分離及純化

利用硅膠柱層析法，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫，分別收集流份，用硅膠G板檢測，合并相同流份，常溫放置析晶。

1.2.4主要條件對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)率的影響

分別通過控制時(shí)間、NaNO2的量、溫度、pH值等不同條件，對(duì)得到的產(chǎn)物進(jìn)行含量測定。在高效液相色譜中，根據(jù)面積歸一化法，確定主要硝化產(chǎn)物的產(chǎn)率。

液相色譜分析條件：P230Ⅱ型高效液相色譜儀，檢測器：UV230Ⅱ，檢測波長：254 nm，色譜柱：Kromasil 100-5 C18column(250×4.6 mm，Sigma-Aldrich)，流動(dòng)相：水-甲醇(25∶75)，進(jìn)樣量：10 μL，流速1.0 mL/min，室溫[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

主要硝基產(chǎn)物為1-硝基-2-萘酚，黃色結(jié)晶。測得其熔點(diǎn)為103.5～104.3℃。ESI-MSm/z：190.05 [M+H]+。產(chǎn)物IR譜νmax(KBr壓片，cm-1):1620、1508、1428、1530、1340、842、735，與文獻(xiàn)上的相同[9]。

2.2 亞硝酸鈉量對(duì)硝化反應(yīng)的影響

亞硝酸鈉在本次實(shí)驗(yàn)研究中作為硝化反應(yīng)的硝化劑，為了解硝化劑量對(duì)硝化產(chǎn)物的影響，分別以硝化劑量為乙萘酚量的2、5、10、20、50倍考察對(duì)硝化產(chǎn)物的影響，結(jié)果見表1。

表1 亞硝酸鈉用量對(duì)硝化產(chǎn)物的影響

從表1中可明顯看出，隨亞硝酸鈉濃度的不斷提高，硝化產(chǎn)物的量也不斷增長，當(dāng)亞硝酸鈉的濃度高于100 mM，即底物量的20倍以上時(shí)，產(chǎn)物的量不再明顯增加。從整體來看，亞硝酸的過量并不會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生太大的影響。所以，為了節(jié)約硝化劑，亞硝酸鈉的濃度應(yīng)控制在底物濃度的20倍左右。

2.3 時(shí)間對(duì)硝化反應(yīng)的影響

時(shí)間作為一個(gè)在硝化反應(yīng)中影響產(chǎn)率的重要因素，分別研究反應(yīng)時(shí)間為0.2、0.5、1、2、5 h硝基產(chǎn)物的產(chǎn)率。

由表2可明顯看到，隨著時(shí)間的延長，硝基產(chǎn)物的產(chǎn)率增加，但1 h后產(chǎn)物的產(chǎn)率增加不明顯，趨近平穩(wěn)，說明該反應(yīng)在開始1 h后基本結(jié)束。導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)束的原因有很多，可能是有機(jī)試劑引起酶的失活，也可能是反應(yīng)物的濃度不足等引起，原因還有待進(jìn)一步研究。綜合考慮，反應(yīng)時(shí)間控制到1 h。

表2 時(shí)間對(duì)硝化產(chǎn)物的影響

2.4 溫度對(duì)硝化反應(yīng)的影響

溫度會(huì)影響酶的結(jié)構(gòu)及底物和產(chǎn)物的溶解性，是影響酶催化反應(yīng)的重要條件，分別觀察4℃、20℃、35℃、50℃、80℃硝基產(chǎn)物的產(chǎn)率。

根據(jù)表3可以看出，反應(yīng)溫度在20℃時(shí)，產(chǎn)率較高，酶相對(duì)穩(wěn)定；當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，產(chǎn)率下降很快，說明高溫影響了HRP的穩(wěn)定性和活性。為了節(jié)約能源，將反應(yīng)溫度定為20℃或室溫。

表3 溫度對(duì)硝化產(chǎn)物的影響

2.5 pH對(duì)硝化反應(yīng)的影響

pH會(huì)影響酶的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和活性，同樣是影響酶催化反應(yīng)的重要條件，分別觀察pH值為5、6、7、8、9時(shí)硝基產(chǎn)物的產(chǎn)率。

根據(jù)表4可以看出，過酸過堿均會(huì)影響產(chǎn)率，pH值等于7時(shí)，生成產(chǎn)物的濃度最大，所以確定最適pH值為7。

表4 pH對(duì)硝化產(chǎn)物的影響

3 討 論

辣根過氧化物酶在亞硝酸鈉、過氧化氫體系中能與乙萘酚發(fā)生催化硝化產(chǎn)物，主要的產(chǎn)物是單硝基產(chǎn)物1-硝基-2-萘酚。反應(yīng)條件對(duì)催化活性和產(chǎn)物產(chǎn)率影響較大，由于酶的失活和H2O2的消耗，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)率較低，可通過后續(xù)少量多次補(bǔ)加酶和H2O2來提高產(chǎn)率[10]。亞硝酸鈉的量∶底物的量 = 20∶1，反應(yīng)溫度20℃，反應(yīng)時(shí)間為1 h，硝化產(chǎn)率25.5%。本實(shí)驗(yàn)為實(shí)現(xiàn)硝基萘酚的綠色合成提供了一種新的方法。