劉曉清，蔡景竹，楊太新

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北 保定 071500)

苦參為豆科植物苦參(SophoraflavescensAit.)的干燥根[1]?？鄥⒆钤缬涊d于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、性寒，入肝、胃、大腸、膀胱經(jīng)，具有清熱燥濕、殺蟲(chóng)止癢、利尿之功效，同時(shí)外用可治滴蟲(chóng)性陰道炎、 外陰瘙癢等癥。

近些年，苦參除藥用外, 還廣泛用于生物農(nóng)藥以及日化產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，市場(chǎng)需求量逐年遞增,開(kāi)發(fā)前景十分廣闊。但隨著人們無(wú)節(jié)制地采挖和荒山、 荒地的開(kāi)發(fā),野生苦參資源越來(lái)越少，因此人工種植苦參的需求日益緊迫。苦參在河北省安國(guó)及張家口地區(qū)種植面積較大，其主要繁殖方式為種子繁殖，但種子質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重影響了苦參藥材的質(zhì)量和廣大藥農(nóng)種植的積極性。本研究在河北省目前還沒(méi)有關(guān)于苦參種子的相應(yīng)檢驗(yàn)規(guī)程和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的情況下，通過(guò)對(duì)采集于河北省不同地區(qū)的苦參的種子質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)，并對(duì)其進(jìn)行了質(zhì)量分級(jí)研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

為2017年和2018年收集于河北省安國(guó)、張家口等地區(qū)不同批次的苦參種子，共18份，每份約500 g。經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)楊太新教授鑒定為豆科植物苦參種子。

1.2 方 法

1.2.1真實(shí)性研究

采用GB/T 3543.5中形態(tài)鑒定法，通過(guò)對(duì)種子形態(tài)、大小、表面特征和種子顏色的差異來(lái)鑒別苦參種子的真?zhèn)?。隨機(jī)取100?？鄥舴N子，借助放大鏡等工具觀察種子形態(tài)、大小、色澤以及表面特征等，3次重復(fù)，記錄相關(guān)特征及數(shù)據(jù)。

苦參種子長(zhǎng)卵形，頂端鈍圓，下端尖，腹面稍壓扁，長(zhǎng) 4.8～6.0 mm、 寬3.5～4.7 mm；表面棕黃色或紫褐色，稍有光澤，背面中央有一縱棱線，腹面可見(jiàn)一暗褐色線狀種脊，種臍位于腹面斜截處，中央明顯凹陷，臍緣輪狀突起。

1.2.2凈度檢測(cè)

將準(zhǔn)確稱(chēng)量的苦參種子置于干凈整潔的桌面上，按照農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程，將苦參種子中含有的其他植物種子和雜質(zhì)分離，并將各組分進(jìn)行精密稱(chēng)重，計(jì)算各組分百分率，重復(fù)3次，其中重型混雜物需進(jìn)行結(jié)果換算。操作過(guò)程中注意避免損傷苦參種子，以保證種子發(fā)芽率的檢測(cè)。

種子凈度(%)=[凈種子重量/(凈種子重量+其他種子總重+雜質(zhì)總重)]×100%。

1.2.3千粒重檢測(cè)

選取經(jīng)過(guò)凈度分析后的純凈苦參種子，分別采用五百粒法和千粒法測(cè)定其重量，確定苦參種子適宜的千粒重測(cè)定方法。其中，五百粒法為精密稱(chēng)量500粒純凈種子，重復(fù)3次；千粒法為精密稱(chēng)量1 000粒純凈種子，重復(fù)3次，再比較2種方法結(jié)果的差異。

1.2.4含水量檢測(cè)方法

分別采用低恒溫(105±2)℃和高恒溫(133±2)℃2種烘干方法測(cè)定苦參種子的含水量，確定其水分測(cè)定的適宜方法。首先將樣品盒烘干至恒重，并記下盒號(hào)，重復(fù)3次。低恒溫法為每烘干1 h，取出樣品盒置干燥器中冷卻后稱(chēng)重，再繼續(xù)烘干， 1 h后取出置干燥器冷卻后稱(chēng)重。高恒溫法為每烘干0.5 h取出樣品盒置干燥器冷卻后稱(chēng)重，再繼續(xù)烘干，每隔0.5 h取出置干燥器冷卻后稱(chēng)重。

種子水分(%)=[(M2-M3)/(M2-M1)]×100%

式中：M1為干燥樣品盒重量(g)；M2為干燥樣品盒和烘前樣品總重(g)；M3為干燥樣品盒和烘后樣品總重(g)。

1.2.5發(fā)芽率檢測(cè)

各處理取苦參種子50粒，重復(fù)3次，采用單因素試驗(yàn)，比較不同發(fā)芽床、種子處理方法下各組苦參種子發(fā)芽情況，確定發(fā)芽率測(cè)定的適宜條件。發(fā)芽率測(cè)定過(guò)程中保持發(fā)芽床濕潤(rùn)，記錄初次記錄時(shí)間和末次記錄時(shí)間，以首次出現(xiàn)種子胚根長(zhǎng)度大于2 mm為初次計(jì)數(shù)時(shí)間；當(dāng)種子萌發(fā)數(shù)達(dá)到最大且再無(wú)種子萌發(fā)的天數(shù)為末次計(jì)數(shù)時(shí)間，計(jì)算發(fā)芽率。

1.2.6種子前處理

取凈種子分別作如下處理：98%濃硫酸浸泡40 min；45～50 ℃熱水浸泡12 h；用砂紙打磨苦參種子，直至表面失去光澤，有明顯劃痕以及未做處理的苦參種子為對(duì)照。每個(gè)處理取樣50粒，重復(fù)3次。0.5%高錳酸鉀浸泡10 min，采用紙間發(fā)芽法，即將苦參種子置于2層濕潤(rùn)濾紙之間，蒸餾水多次洗滌，培養(yǎng)條件為25 ℃培養(yǎng)箱，12 h光照12 h黑暗，注意保持濕潤(rùn)。以種子露出2 mm以上的胚根為種子發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，第5～15天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

1.2.7發(fā)芽床的選擇

取凈種子用0.5%高錳酸鉀浸泡10 min，蒸餾水沖洗3次，分別置于紙間、紙上、粗砂及脫脂棉4種發(fā)芽床上。紙間是指將種子置于2層潤(rùn)濕的濾紙上，種子上再蓋一層潤(rùn)濕的濾紙的方式；紙上是將2層潤(rùn)濕的濾紙放置于培養(yǎng)皿中，種子置于其上的方式；粗砂須經(jīng)過(guò)160 ℃高溫消毒2 h，使用時(shí)用無(wú)菌水濕潤(rùn)，種子置于粗砂表面；脫脂棉指將種子置于濕潤(rùn)的2層脫脂棉上，以上材料均于25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為12 h/光照12 h黑暗。

1.2.8種子質(zhì)量分級(jí)研究

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)苦參種子的凈度、發(fā)芽率、含水量、千粒重等指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析和K-均值聚類(lèi)分析，將苦參種子劃分等級(jí)。

2 結(jié) 果

2.1 千粒重檢測(cè)方法

采用五百粒法測(cè)定來(lái)自于安國(guó)和張家口的各樣品數(shù)值之間的變異系數(shù)均小于4.0%，說(shuō)明采用五百粒法可估測(cè)苦參種子的千粒重，且測(cè)得的結(jié)果與千粒法測(cè)得的數(shù)值無(wú)顯著性差異。因此確定苦參種子千粒重測(cè)定方法為五百粒法，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 苦參種子粒重測(cè)定方法比較

2.2 含水量檢測(cè)方法

研究結(jié)果(表2)表明：低恒溫烘干時(shí)，前3 h質(zhì)量均無(wú)明顯變化，說(shuō)明失水速度緩慢，從4 h開(kāi)始質(zhì)量變化顯著，失水速度加快，8 h以后質(zhì)量變化差異符合試驗(yàn)要求。用高恒溫烘干時(shí)，種子質(zhì)量在0.5 h以后就出現(xiàn)明顯變化，種子失水速度較快，2種樣品質(zhì)量均在2 h以后無(wú)明顯變化。綜上分析，用高溫烘干法烘干種子時(shí)，所用時(shí)間較短，高溫烘干所測(cè)種子含水量與低溫烘干所測(cè)種子含水量無(wú)顯著差異，故苦參種子水分測(cè)定應(yīng)選用高溫烘干法(133±2)℃，烘干時(shí)間為2 h。

表2 苦參種子含水量測(cè)定方法結(jié)果

2.3 種子前處理方法

結(jié)果(表3)表明：2份種子分別采用98%濃硫酸浸泡、45～50 ℃熱水浸泡以及砂紙打磨處理的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均有顯著差別；其中采用98%濃硫酸浸泡40 min處理發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)明顯高于其他2種方法。所以98%濃硫酸浸泡40 min為苦參種子最佳處理方法。

表3 不同處理苦參中種子發(fā)芽結(jié)果

2.4 發(fā)芽床研究

結(jié)果(表4)表明，苦參種子采用紙間培養(yǎng)時(shí)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)均顯著高于其他3種發(fā)芽床。因此，選擇紙間培養(yǎng)為苦參種子最適發(fā)芽床。

表4 不同發(fā)芽床處理苦參種子發(fā)芽結(jié)果

2.5 種子質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

對(duì)從河北省不同地區(qū)采集的18份苦參種子進(jìn)行凈度、千粒重、含水量以及發(fā)芽率等指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。苦參種子各批次樣品凈度在89.65%～98.12%之間，平均值為94.30%；各批次樣品千粒重在44.487～54.693 g之間；含水量在7.64%～8.51%之間，不同批次樣品間差異較小，平均值為8.08%；發(fā)芽率在48.33%～79.00%之間，不同批次間差異較大，平均發(fā)芽率為66.63%，其中有9份種子的發(fā)芽率在平均值以上。

表5 各批次苦參種子質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定

2.6 相關(guān)性及K-均值聚類(lèi)分析及結(jié)果

對(duì)18批苦參種子材料質(zhì)量分級(jí)指標(biāo)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，凈度、千粒重與發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)；含水量與發(fā)芽率呈負(fù)相關(guān)(表6)。

表6 苦參種子各指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)苦參種子的凈度、千粒重、含水量、發(fā)芽率等4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行K-均值聚類(lèi)分析，其質(zhì)量分級(jí)結(jié)果見(jiàn)表7。以聚類(lèi)中心值作為分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將苦參種子質(zhì)量分為3個(gè)等級(jí)，分級(jí)方法應(yīng)按任何一項(xiàng)不符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)都不能作為相應(yīng)等級(jí)的合格種子執(zhí)行，即采用最低定級(jí)原則。

表7 苦參種子各指標(biāo)K-均值聚類(lèi)分析結(jié)果

3 討 論

本研究主要是通過(guò)數(shù)學(xué)原理的分級(jí)方法，采用K-均值聚類(lèi)分析制定了苦參種子的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將苦參種子分為3級(jí)，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際和可操作性，建議在種植苦參時(shí)選擇1～2級(jí)種子，以保證生產(chǎn)。該方法在川牛膝[2]、王不留行[3]、北沙參[4]、金蓮花[5]等藥材種子的質(zhì)量分級(jí)中均有應(yīng)用，因此本研究也采用了該方法對(duì)苦參種子進(jìn)行了質(zhì)量分析。

種子繁殖是目前苦參繁殖的主要方式，種子的質(zhì)量是影響苦參藥材優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的根本原因之一，其種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究和制定，對(duì)于解決其藥材飲片及相關(guān)中藥產(chǎn)品的質(zhì)量有著非常重要的意義。加快苦參種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立，規(guī)范市場(chǎng)當(dāng)中苦參種子的質(zhì)量，才能保證苦參藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。本研究通過(guò)廣泛收集河北省不同地區(qū)不同批次的苦參種子，經(jīng)室內(nèi)測(cè)定和統(tǒng)計(jì)分析，初步制定了苦參種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，為河北省不同地區(qū)種植苦參所需的種子質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了理論依據(jù)。