王 丹 ，傅俊范 ，尹海波 ，周如軍 ，李自博

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植 物保護學(xué)院，沈陽 110161）

人參（Panax ginseng C.A.Meyer）屬五加科（Araliaceae）、人參屬（Panax），是我國最重要的藥用植物之一。由于國家明令禁止新林地開墾栽參，農(nóng)田栽參已成為人參種植的主要方式。農(nóng)田病原菌繁多，且人參為多年生宿根植物，導(dǎo)致人參根部病害呈逐年加重的趨勢，已成為限制我國人參產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要障礙之一[1-3]。由人參核盤菌（Sclerotinia ginseng Wang et Chen）引起的人參菌核病是人參種植過程中危害最為嚴重的根部病害之一，主要侵染3 年以上參根[4]。發(fā)病初期，病株地上部分與健株無明顯差別，發(fā)病后期，地上部分萎蔫，葉片呈紅褐色或黃褐色，地下參根髓部組織腐解殆盡。人參受害后，一般發(fā)病率為10%～15%，嚴重時可達30%以上[5-6]。

許多產(chǎn)核真菌在菌核發(fā)育早期會在菌核表面形成分泌液，菌核分泌液成分復(fù)雜，在菌核生長發(fā)育和致病過程中起著重要的作用。LIANG 等[7]對核盤菌（S.Sclerotiorum）菌核分泌液中蛋白組成的結(jié)果表明，核盤菌菌核分泌液中碳水化合物代謝相關(guān)的蛋白比例最高，為45%，推測菌核分泌液參與真菌營養(yǎng)代謝和細胞壁的形成。PANDEY 等[8]對雪腐核盤菌（Sclerotium rolfsii）菌核分泌液中成分組成的測定結(jié)果表明，雪腐核盤菌菌核分泌液中含有多種酚酸類物質(zhì)，這些物質(zhì)可以有效抑制其他微生物的生長發(fā)育，從而保護自身不被其他微生物降解，可在土壤中長期存活。WANG 等[9]對人參核盤菌菌核分泌液有機酸鑒定結(jié)果表明，人參核盤菌菌核分泌液中含有大量草酸，而草酸是人參核盤菌的主要致病因子。為明確人參核盤菌菌核分泌液致病性及生物學(xué)特性，本研究測定了人參核盤菌菌絲及菌核分泌液對人參根組織的侵染特性和細胞壁降解酶活性差異，分析了培養(yǎng)基、碳源、氮源和pH 對人參核盤菌菌絲生長、產(chǎn)核及菌核分泌液形成的影響等，旨在明確人參核盤菌菌核分泌液的致病性及生物學(xué)特性，為揭示人參核盤菌菌核形成及致病機制的后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試3 年生活體參根購自遼寧省撫順市清源縣人參種植區(qū)。供試人參核盤菌（Sclerotinia ginseng），菌株編號GSgF-01，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院藥用植物病害研究室保藏提供。

供試 10 種培養(yǎng)基為：PDA 培養(yǎng)基、SDA 培養(yǎng)基、OA 培養(yǎng)基、MEA 培養(yǎng)基、MEA-peptone 培養(yǎng)基、CA 培養(yǎng)基、V8 培養(yǎng)基、Czapek 培養(yǎng)基、Richard 培養(yǎng)基和 OA-YE 培養(yǎng)基[10]。供試 20 種碳源為：蔗糖、葡萄糖、果糖、肌醇、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、半乳糖、甘油、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、葡萄糖酸鈉、可溶性淀粉、烏來糖、殼聚糖、鼠李糖、核糖和赤蘚糖醇。供試20 種氮源為：牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、丙氨酸、硝酸鈉、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸、脲、白氨酸、天門冬酰胺、草酸銨、磷酸銨、氯化銨、硝酸鉀、甲硫氨基酸、硝酸銨、半胱氨酸和硫酸銨。供試碳源和氮源均為分析純試劑，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人參核盤菌菌絲與分泌液的致病性測定 將供試人參核盤菌菌株活化，打取直徑5mm 菌餅，置于帶有玻璃紙的PDA 平板中央，20℃黑暗培養(yǎng)3d，將菌絲輕輕刮下，向收集的菌絲加適量無菌水勻漿，測其吸光度值（OD600），使菌絲懸浮液調(diào) OD600=2，備用。

將供試菌株活化，培養(yǎng)方法同前，培養(yǎng)11d 后用20μL 一次性采血管吸取菌核表面分泌液，經(jīng)0.22μm 的微孔濾膜過濾后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采取刺傷接種法，選取參體較為一致的供試參根，70%酒精擦拭后無菌水清洗，用無菌針刺傷處理，分別取1mL 的分泌液和菌絲懸浮液對傷口進行接種處理，于第3，5，9，15 天對人參根部拍照記錄發(fā)病情況。

1.2.2 病菌粗酶液的提取及細胞壁降解酶活性測定 取1g 菌絲和1mL 分泌液，加入5mL 0.1mol·L-1Naacetate 緩沖液，菌絲處理組冰浴條件下加入適量的石英砂充分研磨，過濾后，4℃、16000g 離心20min，取上清液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照王鵬程等[11]方法繪制半乳糖醛酸和葡萄糖標(biāo)準曲線。

細胞壁降解酶活性測定： 在試管中加入1.5mL 的對應(yīng)底物溶液，PG 酶底物為10g·L-1多聚半乳糖醛酸，PMG 酶底物為 10g·L-1果膠溶液，Cx 酶底物為 10g·L-1羧甲基纖維素鈉溶液，β-葡萄糖苷酶底物為 10g·L-1水楊苷，在PG 酶和PMG 酶測定試管中加入1mL 的乙酸-乙酸鈉緩沖液，將所有處理于37℃的恒溫水浴5min，之后加入0.5mL 的對應(yīng)粗酶液，對照為煮沸滅活的粗酶液，于37℃的恒溫水浴反應(yīng)1h，取出后立即加入1.5mL 的DNS 溶液，于沸水浴中加熱5min，之后迅速冷卻至室溫，用蒸餾水稀釋至25mL，在540nm 處測得吸光度值，計算酶活性，PG 酶和 PMG 酶活性按公式（1）計算，Cx 酶和 β-葡萄糖苷酶活性按公式（2）計算[12]。

式中：m 為從標(biāo)準曲線查得的半乳糖醛酸質(zhì)量（mg）；5.14 為1 mg 半乳糖醛酸的微摩爾數(shù)；V 為菌絲過濾后酶液總體積（m L）；V' 為測定時加入的樣品體積（mL）；t 為酶促反應(yīng)時間（min）；m' 為菌絲質(zhì)量（g）。

式中：m 為從標(biāo)準曲線查得的葡萄糖質(zhì)量 （mg）；5.56 為1 mg 葡萄糖的微摩爾數(shù)；V 為菌絲過濾后酶液總體積（mL）；V' 為測定時加入的樣品體積（mL）；t 為酶促反應(yīng)時間（min）；m' 為菌絲質(zhì)量（g）。

1.2.3 病菌生物學(xué)特性測定 將供試菌株GSgF-01 活化后，打取直徑為5mm 的菌餅，放置于不同處理培養(yǎng)基平板中央，3 次重復(fù)，20°C 黑暗培養(yǎng)，3d 后測量菌落直徑，11d 后測量產(chǎn)核數(shù)量、菌核干重、鮮重和分泌液產(chǎn)生量?？疾?0 種不同培養(yǎng)基對人參核盤菌生長的影響；以Czapek 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察供試20 種碳、氮源對人參核盤菌的影響；以PDA 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用1mol·L-1HCL 和1 mol·L-1NaOH 調(diào)pH 值，考察不同pH 值（3，4，5，6，7，8，9，10，11，12）對人參核盤菌的影響[13]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析方法 試驗所得數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel 2010 進行標(biāo)準偏差分析，使用SPSS 13.0 軟件進行顯著性差異分析。

圖1 人參核盤菌分泌液和菌絲懸浮液對人參的致病性Figure 1 The process of ginseng being infected by exudate and mycelial suspension

2 結(jié)果與分析

2.1 人參核盤菌菌絲與分泌液的致病性

以病菌菌絲懸浮液和分泌液分別接種人參根部的致病性測定結(jié)果表明，處理第3 天時，接種分泌液的參根部位顏色開始加深，接種菌絲懸浮液的參根部位無明顯癥狀；第5 天時，接種分泌液的參根部位顏色繼續(xù)加深，接種菌絲懸浮液的參根部位開始加深，并有菌絲形成；第9 天時，分泌液接種部位呈深褐色，病斑擴散較慢，菌絲懸浮液接種部位開始變軟，病斑擴散較快；第15天時，分泌液接種部位呈黑褐色，無軟化現(xiàn)象，菌絲懸浮液接種部位呈軟腐狀，根髓部逐漸腐解，僅存根皮部，表面生出黑色菌核（圖1）。

2.2 人參核盤菌分泌液和菌絲中的細胞壁降解酶含量

由圖2 可知，菌絲和分泌液中均含有PG 酶和Cx酶，分泌液中的PG 酶活性高于菌絲，Cx 酶活性低于菌絲，酶活性分別為 0.0098U·g-1和 0.0602U·g-1、0.0924U·g-1和0.0796U·g-1，PMG 酶只在菌絲中測得，酶活性為0.0252U·g-1，β-葡萄糖苷酶在二者中均未檢測到。

2.3 人參核盤菌的生物學(xué)特性

2.3.1 不同培養(yǎng)基對病菌菌絲生長、菌核產(chǎn)生及分泌液形成的影響 由表1 可知，人參核盤菌在10 種供試培養(yǎng)基中均能生長，在SDA 培養(yǎng)基中的生長速度最快，為13.47mm·d-1，Czapek 培養(yǎng)基中的生長速度最慢，為4.48mm·d-1；在V8 培養(yǎng)基中，供試菌株產(chǎn)核個數(shù)最多，為267 個，但菌核鮮重和干重最小，分別為0.1353g 和0.1441g；在OA 培養(yǎng)基中，供試菌株產(chǎn)核個數(shù)最少，為51 個；在MEA 培養(yǎng)基中，供試菌株菌核鮮重和干重最大，分別為0.8683g 和0.6004g；在PDA 培養(yǎng)基中，供試菌株分泌液產(chǎn)生量最大，為 1.3108g；在SDA，Czapek 和Richard 培養(yǎng)基中，未收集到分泌液。

圖2 人參核盤菌菌絲和分泌液中不同致病酶活性Figure 2 The enzymatic activity of mycelium and exudate of S.ginseng

表1 不同培養(yǎng)基對人參核盤菌生長速率、產(chǎn)核及分泌液形成的影響Table 1 Mycelial growth rate, sclerotial number and the formation of exudate on different cultivation media

2.3.2 不同碳源對病菌菌絲生長、產(chǎn)核及分泌液形成的影響 由表2 可知，人參核盤菌在不同碳源培養(yǎng)基中的菌絲生長速率、產(chǎn)核個數(shù)、菌核干、鮮重及分泌液形成存在顯著差異。以蔗糖與葡萄糖為碳源時，供試菌株菌絲生長速率最快，分別為18.12mm·d-1和17.02mm·d-1；以烏來糖為碳源時，供試菌株停止生長。以肌醇、海藻糖、阿拉伯糖、赤蘚糖和殼聚糖為碳源時，供試菌株僅進行菌絲生長，不產(chǎn)生菌核；以甘油和半乳糖為碳源時，供試菌株產(chǎn)生菌核，但不形成分泌液；以葡萄糖酸鈉為碳源時，菌核產(chǎn)量最多，為280 個。以果糖為碳源時，菌核鮮重和干重最大，分別為0.5383g 和0.2153g。以葡萄糖為碳源時，菌核分泌液產(chǎn)生量最大，為0.5456g。

2.3.3 不同氮源對病菌菌絲生長、菌核產(chǎn)生及分泌液形成的影響 由表3 可知，人參核盤菌在不同氮源培養(yǎng)基中的菌絲生長速率、產(chǎn)核個數(shù)、菌核干、鮮重及分泌液形成存在顯著差異。以蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉為氮源時，供試菌株菌絲生長速率最快，分別為19.76，19.74，19.61mm·d-1；以甲硫氨酸、半胱氨酸、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨、草酸銨、尿素、賴氨酸為氮源時，供試菌株停止生長。以丙氨酸為氮源時，供試菌株僅進行菌絲生長，不產(chǎn)生菌核；以酵母浸粉為氮源時，菌核產(chǎn)量、菌核鮮、干重和分泌液產(chǎn)生量最大，分別為132 個、0.7190g、0.2812g 和 1.3253g。

2.3.4 不同pH 值對病菌菌絲生長、菌核產(chǎn)生及分泌液形成的影響 由表4 測定結(jié)果表明，人參核盤菌在pH值為3～10 的范圍均可生長，pH 值為5 時，供試菌株菌絲生長速率、產(chǎn)核量、菌核鮮、干重以及分泌液產(chǎn)生量最大，分別為 16.37mm·d-1、267 個、0.8311g、0.6554g 和 1.5369g。

表2 不同碳源對人參核盤菌生長速率、產(chǎn)核及分泌液形成的影響Table 2 Mycelial growth rate, sclerotial number and the formation of exudate on different carbon sources

表3 不同氮源對人參核盤菌生長速率、產(chǎn)核及分泌液產(chǎn)生的影響Table 3 Mycelial growth rate, sclerotial number and the formation of exudate on different nitrogen sources

3 討論與結(jié)論

人參核盤菌主要以菌核在土壤或病殘體上越冬，翌年氣候條件適宜時，菌核萌發(fā)出菌絲進行侵染，越冬菌核數(shù)量和氣候條件是人參菌核病發(fā)生和流行的主要影響因素[14]。人參核盤菌的生長發(fā)育主要包括7 個階段，氣生菌絲的營養(yǎng)生長、菌絲團的初始聚集、菌絲團增大與內(nèi)部加固、菌核的發(fā)育初期、菌核的固化與分泌液的析出、菌核色素沉積與表皮的形成以及菌核的成熟[15-16]。菌核分泌液的形成開始于菌絲團表面，隨著菌核的進一步發(fā)育，分泌液開始大量析出，菌核老熟時，分泌液逐漸消失。菌核分泌液的形成伴隨著菌核的發(fā)育，對于菌核分泌液的研究有助于進一步闡明人參核盤菌致病機制及菌核發(fā)育機制。

表4 不同pH 濃度對人參核盤菌生長速率、產(chǎn)核及分泌液產(chǎn)生的影響Table 4 Mycelial growth rate, sclerotial number and the formation of exudate on different pH

本試驗對人參核盤菌菌核分泌液和菌絲懸浮液致病性的研究結(jié)果表明： 分泌液和菌絲都能使參根產(chǎn)生壞死狀病斑，且接種分泌液病斑出現(xiàn)的時間早于菌絲，但分泌液持續(xù)侵染能力比菌絲弱。對分泌液和菌絲中的細胞壁降解酶種類及活性的分析結(jié)果表明：分泌液和菌絲中均存在PG 酶和Cx 酶，分泌液中的PG 酶活性高于菌絲，Cx 酶活性低于菌絲，PMG 酶僅在菌絲中檢測到，分泌液和菌絲中均不含β-葡萄糖苷酶。細胞壁降解酶是許多植物病原真菌主要的致病因子，其主要作用為降解寄主植物中膠層，破壞纖維素，使細胞解離，組織崩潰，使侵染部位出現(xiàn)不同程度的軟腐或腐爛[17-18]。人參核盤菌分泌液中存在PG 酶和Cx 酶，說明分泌液具有分解寄主植物細胞壁和細胞膠質(zhì)結(jié)構(gòu)的能力，這可能是分泌液可導(dǎo)致參根出現(xiàn)壞死斑的主要原因。在侵染的早期階段，PG 酶是植物病原真菌最早分泌的細胞壁降解酶之一，其切割細胞壁果膠質(zhì)的α-1,4 糖苷鍵，導(dǎo)致細胞壁塌陷，使其他水解酶更容易降解細胞壁[19]。人參核盤菌分泌液中PG 酶活性高于菌絲，這解釋了在分泌液和菌絲接種參根時，分泌液接種壞死斑的出現(xiàn)早于菌絲。

碳源和氮源作為主要的能量來源、代謝底物和調(diào)節(jié)因子對真菌的生長發(fā)育過程具有十分重要的作用，真菌中存在復(fù)雜的碳源和氮源感應(yīng)系統(tǒng)[20-21]。本試驗分析了不同培養(yǎng)基、碳源、氮源和pH 值對人參核盤菌菌絲生長、產(chǎn)核及分泌液形成的影響，結(jié)果表明：人參核盤菌在不同培養(yǎng)條件下的菌絲生長速率、產(chǎn)核個數(shù)、菌核干、鮮重及分泌液形成存在顯著差異。供試菌株在SDA 培養(yǎng)基中生長速率最快，但產(chǎn)核數(shù)量較少，且不產(chǎn)生分泌液；在MEA 和MEA-peptone 培養(yǎng)基中產(chǎn)核數(shù)量最多，但分泌液產(chǎn)生較少；以烏來糖為碳源時，供試菌株停止生長，以肌醇、海藻糖、阿拉伯糖、赤蘚糖和殼聚糖為碳源時，供試菌株僅進行菌絲生長；以甘油和半乳糖為碳源時，供試菌株產(chǎn)生菌核，但不形成分泌液。由此可以推測人參核盤菌菌絲生長、菌核發(fā)育及菌核分泌液形成雖然是相互交織的連續(xù)過程，菌核是菌絲聚集的一種體現(xiàn)，但三者間具有相對獨立發(fā)育過程和營養(yǎng)調(diào)控。本試驗篩選出的不同培養(yǎng)基和營養(yǎng)成分可促進人參核盤菌的不同發(fā)育進程，用于人參核盤菌菌核發(fā)育機制的研究。

在人參種植過程中，隨著栽參年限的增加土壤pH 值會逐漸降低[22-23]。此外，農(nóng)藥化肥的施用、人參自身的化感作用以及根系分泌物等均可使得老參地土壤pH 值下降，引起土壤酸化。而土壤酸化會造成人參生長所需營養(yǎng)元素的缺失，增加土壤溶液中鋁離子的含量，嚴重阻礙人參的正常生長與發(fā)育，降低人參的品質(zhì)與產(chǎn)量[24-25]。本試驗對不同pH 值對人參核盤菌菌絲生長、產(chǎn)核及分泌液形成影響的研究結(jié)果表明：酸性條件下，人參核盤菌菌絲生長、產(chǎn)核個數(shù)、菌核鮮、干重以及分泌液形成量更多，更有利于人參菌核病的發(fā)生和流行。所以在人參菌核病的防控措施中，應(yīng)根據(jù)病原菌的生物學(xué)特性，結(jié)合土壤改良等多種農(nóng)業(yè)防治措施，以實現(xiàn)綠色有效防控的目標(biāo)。