李培昕， 張興燎， 周 楊， 張寧彥， 張 敬*， 張 軍*

(1. 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092; 2. 同濟大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092)

胚胎干細胞(embryonic stem cells， ESCs)是動物早期胚胎體外篩選出的一類具有發(fā)育多能性的細胞[1]，具有持續(xù)的自我更新和多向分化的潛能[2]。有多種因素嚴格調(diào)控著ESCs的多能性，目前發(fā)現(xiàn)了TGF-β、BMP及Wnt等關(guān)鍵信號通路均對ESCs的自我更新及多能性存在一定的調(diào)控及影響[3]。Kuroda等[4]發(fā)現(xiàn)Oct-4、Nanog和Sox-2會通過調(diào)節(jié)TGF-β和Wnt這兩條通路來調(diào)控早期的胚胎發(fā)育過程。目前，學(xué)界也稱這3個因子為多能性核心轉(zhuǎn)錄因子[5]。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA， lncRNA)是一類長度不小于200nt的RNA分子，不具備編碼蛋白質(zhì)的能力，但卻具有組織特異性表達的性質(zhì)[6]。研究表明，lncRNA參與了染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、基因組印記以及核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的表觀遺傳調(diào)控程序[7]。雖然近年來關(guān)于lncRNA的研究進展迅猛，但是絕大部分的lncRNA的功能仍不十分清楚。目前已有文獻報道lncRNA對ESCs干性的維持、自我更新以及定向分化有重要的作用，是體內(nèi)重要的基因調(diào)控分子[8]。并且，lncRNA很多情況下可以作為miRNA靶基因的ceRNA參與調(diào)控生物體內(nèi)基因的表達[9]。同時，學(xué)界也認為lncRNA往往扮演了miRNA的“分子海綿”的角色，基于其擁有的一個或多個結(jié)合位點的特點，在細胞內(nèi)像海綿一樣“吸附”miRNA，從而實現(xiàn)對特定miRNA的功能的負調(diào)控作用。

本課題組前期已報道了一個影響小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)分化的關(guān)鍵miRNA——miR-592[10]。此研究鑒定并驗證了miR-592的靶基因是cep135，過表達mESCs中的miR-592能夠使cep135的表達量顯著降低，同時也能使多能性核心轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Nanog和Sox-2表達量顯著降低?；诖耍狙芯恐泻Y選并驗證出了一條在細胞內(nèi)調(diào)控miR-592及其靶基因的關(guān)鍵lncRNA——lncRNA-135。然后，通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)方法，證明了lncRNA-135可以作為miR-592的“海綿”來保護具有序列相似性的靶基因cep135免受miR-592的沉默，并在mESCs多能性維持中起著一定的作用，從而闡明miR-592參與ESCs生物作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 mESCs及KO miR-592 mESCs的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

mESCs(J1 mESCs細胞株)，受贈于同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院薛志剛教授課題團隊。miR-592敲除型mESCs(KO-miR-592 mESCs細胞株)，從美國加州大學(xué)戴維斯分校購得。培養(yǎng)mESCs所使用的培養(yǎng)基成分為DMEM、15%胎牛血清、NEAA、GlutaMAX、LIF及β-Mercaptoetanol。在5% CO2、37℃條件的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在含有滋養(yǎng)層細胞的6孔板中接種 5×105數(shù)量級的mESCs，培養(yǎng)至細胞融合度約為50%時，使用XfectTMRNA試劑(Clontech)進行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建好的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至上述mESCs中。

1.2 lncRNA基因芯片

挑選3批生長狀態(tài)良好的mESCs和KO-miR-592mESCs樣本送往康城生物公司進行基因芯片分析。使用層次聚類對芯片結(jié)果進行分析，它可以根據(jù)樣品中基因的表達水平將樣品進行自動分組。這可以從整體上評估樣品間的基因表達差異，以及樣品之間的關(guān)系，適用于兩組或多組樣品的表達譜分析。一般來說，同一類樣品能通過聚簇出現(xiàn)在同一簇(cluster)中，聚在同一簇的基因可能有相類似的生物學(xué)功能。

1.3 qRT-PCR檢測表達情況

使用TRIzol試劑對細胞進行裂解，從而提取細胞中的總RNA或lncRNA或miRNA，將獲得的核酸進行濃度測定。借助反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit；PrimeScriptTMRT Reagent Kit，TaKaRa公司)對提取后的mRNA或lncRNA或miRNA進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨即進行實時熒光定量PCR檢測(SYBR Premix Ex Taq，TaKaRa公司)。本研究采用兩步法PCR擴增，5s，95℃變性，34s，60℃退火延伸，循環(huán)40次，miRNA及l(fā)ncRNA的退火溫度為56℃。

1.4 雙熒光素報告載體的構(gòu)建

利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證靶基因。pGL3-Control載體表達螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)，用于定量基因表達；海腎熒光素酶(renilla luciferase)報告基因載體pRL-TK則作為內(nèi)對照。所有雙熒光素報告載體均克隆至pGL3-Control載體骨架3′UTR區(qū)域中。

1.5 干擾質(zhì)粒的構(gòu)建

設(shè)計引物： 通過生物信息學(xué)軟件BLOCK-iTTMRNAi Designer預(yù)測得到lncRNA干擾片段，在片段5′端加入Hind Ⅲ酶切后片段，3′端加入BglⅡ酶切后片段，見表1。

表1 lncRNA干擾片段

1.6 免疫細胞化學(xué)染色

取待鑒定的細胞，加PBS清洗1遍。加4%多聚甲醛固定30～40min。用含5%山羊血清，0.3%Triton X-100的封閉液室溫封閉2h。4℃孵育一抗。后用PBS及封閉液各洗2次，后封閉30min。避光孵育二抗2h。使用PBS緩慢清洗后加入DAPI染色。使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.7 Western印跡法測定蛋白表達情況

在待檢測細胞中加入蛋白裂解液，以提取細胞蛋白，使用BCA法確定蛋白濃度。制備蛋白樣品，配制分離膠和濃縮膠用以電泳實驗，拔下梳子并上樣，電泳后使用轉(zhuǎn)膜儀進行轉(zhuǎn)模。完成后使用封閉液封閉，在4℃的條件下孵育一抗過夜。使用配制好的TBST溶液清洗復(fù)溫后的膜3次，室溫加入二抗進行孵育，本步驟需在黑暗條件下進行。約50min后用TBST溶液清洗3次。利用Odyssey紅外成像儀顯色，并對蛋白條帶的灰度值進行量化分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 基因芯片篩選mESCs和KO-miR-592 mESCs中差異性表達的lncRNA

為了確定mESCs和KO-miR-592mESCs的表達差異，對二者進行基因芯片分析。檢測mESCs中miR-592的存在與否對lncRNA表達的影響，以明確細胞內(nèi)參與miR-592調(diào)控的lncRNA。圖1中上側(cè)的樹狀圖可以反映樣品基因表達模式的關(guān)系，可以很直觀的由差異表達的lncRNA聚類圖中發(fā)現(xiàn)表達趨勢相近的lncRNA，并且可以從具有相似表達譜的基因推測其功能。從基因表達模式方面分析，本研究所提供的樣品一組與樣品二組在表達模式上更為接近，結(jié)果一致度更高。

圖1 差異表達的lncRNA層聚圖Fig.1 Layered map of differentially expressed lncRNA按表達趨勢劃分是否為同簇；圖中紅色表示表達量相對較高的lncRNA,藍色表示表達量相對較低的lncRNA

通過lncRNA芯片分析，篩選了27852條已知序列的lncRNA，其中檢測到527條lncRNA在正常mESCs和KO-miR-592 mESCs中有表達差異，設(shè)定以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，僅保留基因表達變化倍數(shù)達到2倍以上的候選基因。則其中有336條lncRNA在KO-miR-592 mESCs中表達上升至少2倍(P<0.05)，191條lncRNA在KO-miR-592 mESCs中表達下降至少0.5倍(P<0.05)。生物信息學(xué)分析得出差異表達(上調(diào)及下調(diào))的部分lncRNA見表2～3。

表2 部分差異表達的lncRNAs(上調(diào))

表3 部分差異表達的lncRNAs(下調(diào))

續(xù)表

2.2 芯片結(jié)果驗證

為了驗證上述芯片結(jié)果并篩選出最優(yōu)lncRNA，從生長正常的mESCs和KO-miR-592mESCs中提取總RNA，對14條評分較高的lncRNA進行real-time PCR表達分析，驗證與芯片得到的結(jié)果是否一致，見圖2。結(jié)果表明有4條lncRNA(AK029705、uc009she.1、NR_028110及AK135874)的表達與芯片結(jié)果不一致，將這4條lncRNA舍去。

圖2 Real-time PCR驗證芯片結(jié)果Fig.2 Verify chip results with Real-time RT-PCR*P<0.05

為了驗證候選lncRNA的polyA尾結(jié)構(gòu)，富集提取了mESCs和KO-miR-592 mESCs中具有polyA尾的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。對上述候選lncRNA 進行PCR，后電泳，見圖3。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中2條lncRNA(AK140555、AK138169)(圖3中紅色)的條帶位置與引物設(shè)計擴增大小不符，故將其舍去，結(jié)合上述結(jié)果，余下的8條lncRNA將被用以進行后續(xù)研究。接著利用TargetScan計算，結(jié)果中AK086964的context sco-re percentage為96分，為候選lncRNA中的分最高的1條。所以綜合以上芯片驗證數(shù)據(jù)并對TargetScan計算的結(jié)果進行挑選，選取AK086964(lncRNA-135)(圖3中黃色)為候選lncRNA進行進一步研究。

圖3 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 PCR product electropherogram

2.3 lncRNA-135可以與miR-592相結(jié)合

首先，利用RefSeq_NR，UCSC，knowngene，Ensembl和Fantom3等數(shù)據(jù)庫獲取lncRNA-135的序列信息。并通過生物信息學(xué)分析預(yù)測其確實含有可以與miR-592 3′UTR種子區(qū)結(jié)合的位點，見圖4。

圖4 lncRNA-135與miR-592種子區(qū)結(jié)合圖Fig.4 lncRNA-135 and miR-592 seed binding region

接著根據(jù)AK086964(lncRNA-135)含有miR-592結(jié)合位點的位置構(gòu)建了1個在pGL3-Control的3′UTR端插入含有miR-592結(jié)合序列的雙熒光素報告載體pGL3-Control-3′ UTR lncRNA，見圖5。

圖5 pGL3-Control-3′UTR lncRNA質(zhì)粒示意圖Fig.5 Schematic of pGL3-Control-3′UTR lncRNA plasmid

基于此，利用重組質(zhì)粒設(shè)置6個實驗組： (1) pGL3-Control質(zhì)粒與pSuper-EGFP過表達；(2) pGL3-Control質(zhì)粒與miR-592過表達；(3) pGL3-Control質(zhì)粒與miR-592-mut質(zhì)粒；(4) 重組lncRNA-135質(zhì)粒與pS-uper-EGFP過表達；(5) 重組lncRNA-135質(zhì)粒與miR-592過表達；(6) 重組lncRNA-135質(zhì)粒與miR-592-mut質(zhì)粒，各組均與pRL-TK共轉(zhuǎn)染293T細胞。在轉(zhuǎn)染后 48h，進行雙熒光素酶檢測，分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，并計算螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的比值(圖6)，將重組質(zhì)粒與miR-592過表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染測得的結(jié)果與重組質(zhì)粒與miR-592-mut表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染得到的結(jié)果計算比值。實驗結(jié)果反映出lncRNA-135雙熒光素酶實驗中引起雙熒光素酶表達下降較為明顯，這一定程度上說明了熒光素酶表達的下降是lncRNA-135可與miR-592相結(jié)合的結(jié)果。

圖6 雙熒光素報告系統(tǒng)表征lncRNA-135可與miR-592相結(jié)合Fig.6 Dual luciferin reporting system shows that lncRNA-135 can be combined with miR-592與pSuper-EGFP組相比，*P<0.05

為進一步證明lncRNA-135所包含的miR-592的結(jié)合序列，是與miR-592相結(jié)合所必需的，將這些重組pGL3-Control-3′UTR lncRNA載體中包含的miR-592的結(jié)合位點進行靶向敲除(圖7A)，后進行雙熒光素酶檢測。實驗表明如果敲除了重組質(zhì)粒中的miR-592靶位點，miR-592對螢火蟲熒光素酶就無抑制作用(圖7B)。并且在lncRNA-135和miR-592的劑量關(guān)系實驗中，重組lncRNA-135質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組也表現(xiàn)出隨miR-592共轉(zhuǎn)染表達量的逐漸增加，對螢火蟲熒光素酶的抑制作用逐漸增強(圖7C)，這表明lncRNA-135能夠與miR-592相結(jié)合。前期生物信息學(xué)分析得出的lncRNA-135中所包含的miR-592結(jié)合序列是二者實現(xiàn)結(jié)合并進一步發(fā)揮功能互作效應(yīng)的重要保障。

圖7 驗證lncRNA-135與miR-592結(jié)合必需有靶位點存在Fig.7 Validation of lncRNA-135 binding to miR-592 requires the presence of a target siteA： pGL3-Control-3 UTR ΔlncRNA-135質(zhì)粒示意圖；B： 雙熒光素報告實驗；C： lncRNA-135與miR-592的劑量作用關(guān)系；*P<0.05

2.4 lncRNA-135與miR-592呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系

因為lncRNA-135能夠與miR-592相結(jié)合，接著驗證了lncRNA-135對miR-592沉默靶序列的能力的影響效果。首先通過生物信息學(xué)軟件BLOCK-iTTMRNAi Designer預(yù)測得到lncRNA-135干擾片段，將干擾片段插入pSuper-GFP質(zhì)粒當中以構(gòu)建干擾了lncRNA-135的silncRNA-135質(zhì)粒。接著，將其轉(zhuǎn)染到mESCs中，通過real-time PCR檢測干擾效率及miR-592的表達情況，發(fā)現(xiàn)干擾了mESCs中的lncRNA-135后，lncRNA-135的表達量下降了50%左右，說明干擾效率較好。而lncRNA-135被干擾后，miR-592的表達量較對照組均有顯著的增加(圖8)。這初步顯示在mESCs中內(nèi)源性miR-592的表達與lncRNA-135呈負相關(guān)。

為了進一步研究lncRNA-135對miR-592的調(diào)控作用是結(jié)合miR-592后進而阻止其沉默靶基因，設(shè)計了雙熒光素酶報告系統(tǒng)，構(gòu)建miR-592-sensor，在pGL3-Control載體的3′UTR區(qū)域插入連續(xù)3個具有miR-592結(jié)合位點的質(zhì)粒以模擬miR-592的靶基因表達(圖9A)。在雙熒光素檢測中，過表達miR-592以后，miR-592-sensor中熒光素酶的表達下降。但在同等過表達miR-592的前提下，再干擾lncRNA-135，miR-592-sensor中熒光素酶的表達進一步下降，說明lncRNA-135含量的多少可以影響miR-592對其靶基因沉默能力的弱強(圖9B)。這從一定程度上表明mESCs內(nèi)存在lncRNA-135與miR-592互相作用的調(diào)控關(guān)系，lncRNA-135通過與miR-592結(jié)合來阻止miR-592與其靶基因的結(jié)合，從而阻止miR-592對其靶基因的沉默作用。

圖8 Rreal-time PCR檢測lncRNA-135，miR-592表達情況Fig.8 Real-time RT-PCR detection of relative expression of lncRNA-135 and miR-592與對應(yīng)組的siControl相比，*P<0.05

圖9 雙熒光素報告系統(tǒng)驗證lncRNA-135影響miR-592的活性Fig.9 Dual luciferin reporter system validates that lncRNA-135 affects miR-592 activityA: miR-592-sensor質(zhì)粒示意圖；B： 過表達miR-592下lncRNA-135影響miR-592活性；*P<0.05

2.5 lncRNA-135通過與miR-592互相作用影響mESCs多能性因子的表達

在正常mESCs中干擾lncRNA-135，使用Western印跡法檢測Oct-4、Nanog和Sox-2的表達，干擾lncRNA-135后，3種因子表達均降低(圖10)。

圖10 干擾lncRNA-135，Oct-4、Nanog、Sox-2的表達情況Fig.10 Detection of Oct-4, Nanog, Sox-2 expression after interference with lncRNA-135A： Western印跡法條帶圖；B： 蛋白條帶灰度分析；*P<0.05

為進一步闡明在mESCs中miR-592在lncRNA-135與cep135之間起到一個“媒介”的作用，且lncRNA-135可與cep135競爭性結(jié)合miR-592，在正常mESCs和KO-miR-592 mESCs中干擾lncRNA-135的表達，檢測cep135蛋白表達情況(圖11)。結(jié)果顯示，在正常mESCs中干擾lncRNA-135的表達可以使cep135的表達量下降，但是在KO-miR-592 mESCs中，干擾lncRNA-135對cep135蛋白的表達量沒有影響，說明lncRNA-135必須要通過miR-592作為“橋梁”才能實現(xiàn)對cep135蛋白表達的影響。這表明lncRNA-135對cep135無直接調(diào)控作用，而是通過調(diào)控miR-592進而實現(xiàn)對cep135的影響。并且在KO-miR-592 mESCs中，cep135的表達量比在正常mESCs中高，這也從另一個側(cè)面進一步說明了cep135是miR-592的靶基因，而lncRNA-135的作用發(fā)揮條件是源于與miR-592的結(jié)合。

接著在正常mESCs中分別過表達miR-592，干擾lncRNA-135和干擾lncRNA-135+過表達cep135，進行免疫細胞化學(xué)染色(圖12)。結(jié)果顯示，在正常mESCs中過表達miR-592組和干擾lncRNA-135組的Oct-4、Nanog和Sox-2基因的表達量下降，在silncRNA-135+過表達cep135組中，Oct-4、Nanog和Sox-2基因表達量出現(xiàn)上升。作為干細胞多能性的關(guān)鍵代表分子，這3個基因的表達變化在細胞層面驗證了lncRNA-135可以通過結(jié)合miR-592，而解除miR-592對其靶基因cep135的抑制作用，從而促進mESCs的核心多能性基因的表達。

圖11 lncRNA-135通過miR-592影響cep135的表達情況Fig.11 lncRNA-135 affects cep135 expression through miR-592A： Western印跡法；B： 蛋白條帶灰度分析；*P<0.05

圖12 免疫細胞化學(xué)染色檢測Nanog、Oct-4和Sox-2表達量(×100)Fig.12 Detection of Nanog, Oct-4, Sox-2 expression by immunocytochemistry(×100)

3 討 論

本研究通過高通量的基因芯片篩選技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了在正常mESCs和KO-miR-592 mESCs中表達差異顯著的lncRNA。成功篩選并驗證了能夠與miR-592結(jié)合的lncRNA-135。同時，通過干擾mESCs中的lncRNA-135，發(fā)現(xiàn)其可以通過結(jié)合miR-592而解除miR-592對其靶基因cep135的抑制作用，從而促進mESCs的核心多能性基因的表達。結(jié)合已有研究證明的miR-592可以通過作用于靶基因cep135進而影響ESCs的多能性，得出lncRNA-135可以一定程度上對ESCs多能性的影響，是由lncRNA-135/miR-592/cep135組合形成的動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用的。通過lncRNA-135與miR-592相結(jié)合，影響miR-592對cep135的抑制作用，從而對ESCs的多能性因子的表達產(chǎn)生影響。

目前，高通量測序技術(shù)的應(yīng)用對不斷擴展的非編碼RNA研究產(chǎn)生了巨大的影響[11-12]。miRNA的發(fā)現(xiàn)和驗證為基因的研究帶來了巨大的革命[13]，但lncRNA與miRNA共同構(gòu)成的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)則進一步為非編碼RNA的研究提供了新的方向[14]。大量lncRNA在發(fā)育和時間上限制于特定的組織或器官，表明它們在特定細胞或生理過程中具有重大作用，但也使其更加難以被發(fā)現(xiàn)[15-17]。

最近，ceRNA假說的提出，也支持了非編碼RNA可能充當miRNA的分子海綿[18]。進一步地闡明lncRNA的不同作用機制，不僅為研究細胞功能的基本生物學(xué)理解提供支持，更有利于揭示lncRNA在疾病病因?qū)W中的基礎(chǔ)及探索其在藥物設(shè)計中的重要用途。不同的lncRNA/miRNA/mRNA調(diào)控軸可能會調(diào)節(jié)不同疾病中的多種生物學(xué)功能[19-20]，包括但不限于惡性突變[21]、腫瘤耐藥[22]、機體的損傷修復(fù)[23]、細胞增殖等[24]。

在本研究首次篩選出并證實了lncRNA-135能夠扮演miR-592的“分子海綿”，解除其對靶基因cep135的內(nèi)源性抑制作用，而一定程度上影響ESCs的多能性。進一步完善了miR-592的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。提示miR-592、lncRNA-135、cep135之間具有的動態(tài)調(diào)控關(guān)系。綜上所述，基于miR-592在調(diào)控mESCs發(fā)育及干性維持的重要作用，lncRNA-135在其中扮演了關(guān)鍵的“分子海綿”的角色。通過與miR-592結(jié)合從而阻止miR-592沉默靶基因cep135，最終促進mESCs的多能性基因的表達。從一定程度上驗證了lncRNA-135、miR-592及cep135調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在ESCs的發(fā)育過程中的重要作用，這也說明了其具有潛在的研究地位及價值。