高志偉，王龍

真核生物起源研究進(jìn)展

高志偉1，王龍2

1. 南京大學(xué)匡亞明學(xué)院，南京 210023 2. 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023

作為重大進(jìn)化謎題，真核生物起源的研究對于解碼真核基因組、闡釋真核細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系有重要啟示作用。在1977年美國微生物學(xué)家Carl Woese發(fā)現(xiàn)古細(xì)菌并提出三域生命之樹之后，大量研究顯示古細(xì)菌與真核生物在進(jìn)化上存在著密切聯(lián)系。21世紀(jì)以來，系統(tǒng)發(fā)育分析方法不斷改進(jìn)，泉古菌門(Crenarchaeota)、廣古菌門(Euryarchaeota)之外與真核生物更加相似的新古細(xì)菌門類也相繼被發(fā)現(xiàn)，這些證據(jù)更加支持將真核生物與古細(xì)菌合并為一域，形成二域生命之樹。目前，通過宏基因組技術(shù)發(fā)現(xiàn)的Asgard古細(xì)菌是與真核生物進(jìn)化距離最近的原核生物。然而，真核生物祖先的身份以及線粒體起源的時(shí)間等核心問題仍是學(xué)術(shù)界爭論的焦點(diǎn)。本文結(jié)合近年來國內(nèi)外研究成果，從生命之樹的形態(tài)變化與真核生物演變的具體機(jī)制兩個(gè)角度梳理了目前對真核生物起源的認(rèn)知過程、現(xiàn)有水平和研究前景，以期為揭示真核生物起源進(jìn)程的后續(xù)研究提供參考與指引。

真核生物起源；生命之樹；古細(xì)菌；三域；二域；內(nèi)共生；線粒體；Asgard超門

真核生物起源被稱為生物界僅次于生命起源的第2大謎團(tuán)[1]。加拿大著名微生物學(xué)家Roger Stanier曾指出：“原核生物與真核生物細(xì)胞之間的差異是當(dāng)今世界中已發(fā)現(xiàn)的最大的單一不連續(xù)性”[2]。雖然許多原核生物已經(jīng)具有帶有膜的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)[3]，但真核生物的復(fù)雜程度卻遠(yuǎn)高于此。真核生物具有核膜包被的細(xì)胞核，將轉(zhuǎn)錄與翻譯過程分隔開，為基因調(diào)控提供更多選擇[4]；眾多細(xì)胞器組成的內(nèi)膜系統(tǒng)使細(xì)胞具有精密高效的運(yùn)輸和代謝功能[5]。這些結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了真核生物的環(huán)境適應(yīng)能力，使其演化為現(xiàn)存物種中數(shù)目占大多數(shù)的生命形式。

從原核到真核這一巨大轉(zhuǎn)變通常在教科書中被過度簡化為一個(gè)迅速的單一事件[6]。然而從時(shí)間上看，化石記錄顯示目前最早的真細(xì)菌[7,8]和古細(xì)菌化石距今約35億年，相比之下，真核生物化石距今約18億年[9]，與利用分子鐘計(jì)算的17~19億年時(shí)間相一致[10]，由此推算出的原核生物和真核生物的出現(xiàn)時(shí)間相差17億年之久。闡釋這一漫長歷史過程中真核生物的演變歷程對人們認(rèn)知真核生物乃至人類自身的細(xì)胞和基因組結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。

真核生物的祖先是什么？真核生物演變的具體機(jī)制是什么？這兩大核心問題也成為學(xué)界長久以來爭論的焦點(diǎn)。其中，尤其是真核生物在生命之樹上所處的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)位置，以及線粒體的起源問題上，依然存在有很大的分歧。近年來，與真核生物進(jìn)化密切相關(guān)的Asgard古細(xì)菌超門的發(fā)現(xiàn)[11,12]以及其在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)研究的實(shí)現(xiàn)[13]，為解決這一僵局帶來了光明。因此，本文在回顧歷史的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)聚焦近年來在該領(lǐng)域取得的重大研究進(jìn)展，從生命之樹和演化機(jī)制兩個(gè)角度深入闡述真核生物的起源問題。

1 生命之樹中的真核生物

1.1 古細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)和三域生命之樹的提出

1977年，美國微生物學(xué)家Carl Woese通過16S/18S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析偶然發(fā)現(xiàn)了古細(xì)菌。他們據(jù)此將原核生物分為兩大類——真細(xì)菌和古細(xì)菌，并將真細(xì)菌、古細(xì)菌和真核生物各分為一個(gè)“域”(Domain)，作為比“界”(Kingdom)高一級的分類系統(tǒng)，分別命名為細(xì)菌域(Bacteria)、古菌域(Archaea)和真核域(Eukarya)[14]。自此，真核生物在分類學(xué)中的位置迎來巨變，利用保守基因?yàn)樗屑?xì)胞生命建立分類系統(tǒng)的方法開始流行。20世紀(jì)80年代末，基于基因重復(fù)(gene duplication)[15]和SSU rRNA[16]的研究發(fā)現(xiàn)真核生物雖與古細(xì)菌形態(tài)差異大，但屬于姐妹群(sister groups)，具有一個(gè)獨(dú)立于真細(xì)菌之外的共同祖先。據(jù)此，Woese等[16]提出了著名的三域(three primary domains, 3D)生命之樹(tree of life/ universal tree)，包含細(xì)菌域、古菌域(分為泉古菌門和廣古菌門)和真核域(圖1)[17]，長期以來得到各類教科書和文獻(xiàn)的廣泛認(rèn)可[18]。

20世紀(jì)80年代到21世紀(jì)初，許多研究發(fā)現(xiàn)古細(xì)菌和真核生物在分子層面上高度相關(guān)，直接或間接地為Carl Woese的三域生命之樹提供證明。在遺傳信息復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上，真核生物與古細(xì)菌具有許多真細(xì)菌不具有的相似性。例如，免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)[19]和進(jìn)化計(jì)算[20]都證明古細(xì)菌依賴于DNA的RNA聚合酶與真核生物的結(jié)構(gòu)同源性。真核生物與古細(xì)菌的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始因子、30種共有的核糖體蛋白、翻譯因子、DNA復(fù)制相關(guān)的部分酶、組蛋白等都體現(xiàn)出真細(xì)菌所缺乏的相似性[21]。此外，真核生物和古細(xì)菌具有多種相似的、維持細(xì)胞基本生存的酶和代謝通路，如液泡ATPase、分泌通路、輔酶A生物合成的部分酶以及嘧啶和精氨酸生物合成的部分酶等[21]。古細(xì)菌細(xì)胞分裂系統(tǒng)內(nèi)的部分蛋白甚至與真核生物的內(nèi)體分選復(fù)合體同源[22,23]。如此多的進(jìn)化關(guān)聯(lián)性使古細(xì)菌成為揭示真核生物起源的重要研究對象[24]。

當(dāng)然，古細(xì)菌和真核生物之間也存在許多差別。最為顯著的是膜脂，古細(xì)菌采用醚鍵相連，而真核生物采用酯鍵相連；古細(xì)菌的甘油磷酸骨架使用甘油-1-磷酸，而真核生物和真細(xì)菌使用甘油-3-磷酸，兩者由不相關(guān)的酶合成。古細(xì)菌還擁有獨(dú)特的產(chǎn)甲烷代謝途徑、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶和DNA聚合酶等[21]。此外，真核生物與真細(xì)菌也有代謝[25,26]和膜化學(xué)性質(zhì)[27]的部分相似之處。

圖1 Carl Woese的生命之樹

Carl Woese依據(jù)16S/18S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)古細(xì)菌后，將自然界中的生物分為真核域、細(xì)菌域和古菌域三域。根據(jù)文獻(xiàn)[17]修改繪制。

1.2 二域與三域的爭端

雖然Carl Woese提出的三域系統(tǒng)(圖2A)受到廣泛認(rèn)可，但同時(shí)期，Lake等[28]依據(jù)核糖體結(jié)構(gòu)證據(jù)、Rivera和Lake[29]依據(jù)延伸因子EF-1α同系物保守區(qū)有共同氨基酸插入的證據(jù)，提出真核生物是泉古菌門的一個(gè)姐妹群，即真核生物是從古細(xì)菌域之內(nèi)產(chǎn)生的，是二級域，而一級域僅為真細(xì)菌和古細(xì)菌，形成二域(two primary domains, 2D)生命之樹(圖2B)。人們對應(yīng)地提出了許多演化模型支持二域系統(tǒng)，實(shí)質(zhì)均為古細(xì)菌與細(xì)菌之間的相互作用[30]，如支持泉古菌門(Crenarchaeota)與細(xì)菌相互作用的泉古菌假說(eocyte hypothesis)[28,29]，廣古菌門(Euryarchaeota)與細(xì)菌相互作用的氫假說(hydrogen hypothesis)[31]和互養(yǎng)共棲假說(syntrophic hypo-thesis)[32]等。

21世紀(jì)的第一個(gè)10年中，生物信息學(xué)蓬勃發(fā)展。從系統(tǒng)發(fā)育重建的角度看，三域與二域的爭端依然激烈。在2003~2009年發(fā)表的7篇文獻(xiàn)中，通過真核生物、真細(xì)菌、古細(xì)菌物種取樣，測定基因組中的系統(tǒng)發(fā)生信號(phylogenetic signal)標(biāo)記，進(jìn)行大規(guī)模系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，3篇文獻(xiàn)得出三域系統(tǒng)結(jié)果[33~35]，4篇文獻(xiàn)得出二域系統(tǒng)結(jié)果[36~39]。7篇文獻(xiàn)采用的數(shù)據(jù)和方法比較如表1所示。

值得注意的是，上述7篇文獻(xiàn)使用數(shù)據(jù)在很大程度上有重疊，大多基于蛋白相鄰類的聚簇(Cluster of Orthologous Groups of proteins, COG)數(shù)據(jù)庫，最終卻得到了截然不同的結(jié)論，集中體現(xiàn)了系統(tǒng)發(fā)育學(xué)方法在解決真核生物起源時(shí)面臨的典型難題：

圖2 三域與二域生命之樹的對比

A：三域系統(tǒng)；B：二域系統(tǒng)。AB圖中的1、2、3分別對應(yīng)真核域、古菌域和細(xì)菌域的最近共同祖先；真核域與古菌域是兩個(gè)距離遙遠(yuǎn)的姐妹群，具有一個(gè)最近共同祖先4。B圖中真核域的最近共同祖先1直接產(chǎn)生自古菌域內(nèi)，所以古菌域的最近共同祖先2同時(shí)也是古菌域和真核域的最近共同祖先，這與A圖的情況不同。根據(jù)文獻(xiàn)[21]修改繪制。

表1 2003~2009年間發(fā)表的7篇闡釋生命之樹中古細(xì)菌與真核生物關(guān)系的文章比較

3D：三域系統(tǒng)；2D：二域系統(tǒng)；HGT：水平基因轉(zhuǎn)移。表格根據(jù)Gribaldo等[21]的綜述拓展。

(1)長期的堿基替換導(dǎo)致基因組中遺留的系統(tǒng)發(fā)育信號很微弱，若使用單基因位點(diǎn)或較短的16S rRNA、18S rRNA分析跨域的物種，背景噪聲大，可以得到的有效信息很少，如前述Harris等[33]與Yutin等[35]兩文的方法正如此。同時(shí)，單個(gè)基因可能受基因特異性事件影響(如基因重復(fù)、丟失和轉(zhuǎn)移)，不能反映真實(shí)的物種進(jìn)化情況[40,41]。

(2)為解決單基因信號微弱的問題，許多研究采用了分散基因串聯(lián)(concatenation)的方法[34,38,39]，即將多個(gè)不連續(xù)的基因直接串聯(lián)組合為“普遍基因”(universal gene)，序列對齊后再統(tǒng)一分析。但此舉的局限性在于真核生物起源分析的范圍廣，真核生物、古細(xì)菌和真細(xì)菌3個(gè)類群跨域分析時(shí)很可能將非同源蛋白強(qiáng)制對齊，在組合基因時(shí)人為引入偏差[21]。此外，可供大范圍跨域分析的“普遍基因”本身數(shù)量也十分有限。

(3)同樣為解決單基因信號微弱的問題，有研究采用全基因組比對，但局限性在于可用的全基因組數(shù)據(jù)比單基因數(shù)據(jù)少，且計(jì)算更加復(fù)雜。選取物種數(shù)少時(shí)，結(jié)果受抽樣本身影響大，例如Rivera和Lake[36]僅僅使用了7個(gè)全基因組，偶然誤差較大。但該方法隨著未來基因組數(shù)據(jù)的快速增加和組學(xué)分析方法的不斷進(jìn)步，有望提供更多可靠的信息。

(4)不同物種間的水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer, HGT)和基因丟失都可能抹去進(jìn)化印記。HGT和基因丟失可能發(fā)生在真核生物進(jìn)化的各個(gè)階段(圖3)，機(jī)制包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合等[42~44]。在Cox等[38]的研究中，檢測到選取的80個(gè)基因有30個(gè)受到HGT影響，數(shù)據(jù)舍棄不用。Akanni等[45]利用超樹方法分析了392個(gè)真細(xì)菌和51個(gè)古細(xì)菌基因組，在古細(xì)菌進(jìn)化樹基部發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)來自真細(xì)菌的大規(guī)模HGT，基因來源涉及δ-變形桿菌、梭菌和放線菌。對此，Cotton等[46]和Cohen等[47]認(rèn)為，與轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)的核心基因的負(fù)選擇壓大，受HGT的影響應(yīng)比一般代謝通路的基因小，是更加合適的分析對象。

(5)長支吸引(long branch attraction, LBA)，由于不同域間的基因差別可能很大，在同源性高的物種之外可能形成進(jìn)化距離遙遠(yuǎn)但仍然相互靠近的長支，造成偏差[48,49]。早在1999年，Tourasse等[50]便認(rèn)為三域樹結(jié)果是受LBA影響產(chǎn)生的。

(6)建立的模型本身設(shè)計(jì)過于簡單，模擬能力差[48]。近10年來，隨著模型的復(fù)雜化和基因數(shù)據(jù)的積累，人們盡量規(guī)避上述6點(diǎn)對結(jié)果的影響。2011~ 2013年發(fā)表的3篇文獻(xiàn)結(jié)果都支持二域系統(tǒng)[48,51,52]。2014年，Rochette等[53]的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，真核生物與古細(xì)菌間的聯(lián)系比真細(xì)菌緊密得多，但與泉古菌門和廣古菌門沒有密切聯(lián)系，真核生物分支接近古細(xì)菌并很可能從中發(fā)出。與此同時(shí)，泉古菌和廣古菌以外古細(xì)菌門類的發(fā)現(xiàn)為二域系統(tǒng)提供了更多的支持，相關(guān)內(nèi)容將在下一部分闡述。

圖3 真核生物進(jìn)化過程中的水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)與基因丟失

HGT可能發(fā)生在古細(xì)菌祖先→FECA→LECA→現(xiàn)存真核生物演化進(jìn)程中的各個(gè)階段。線粒體和葉綠體的內(nèi)共生過程也為HGT的發(fā)生提供條件。HGT和基因丟失均能削弱現(xiàn)存生物基因組中遺留的系統(tǒng)發(fā)育信號。根據(jù)文獻(xiàn)[17]修改繪制。

1.3 新古細(xì)菌類群的發(fā)現(xiàn)對生命之樹的影響

2004年，Venter等[54]首次采用不經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)直接測定環(huán)境中微小生物基因組的“全基因組鳥槍測序”方法，即通常所說的宏基因組(metagenome)技術(shù)，研究海水中的微生物樣本，發(fā)現(xiàn)了148個(gè)新細(xì)菌種類和120萬個(gè)此前未知的基因。此后，人們不斷利用宏基因組技術(shù)發(fā)現(xiàn)多個(gè)泉古菌門、廣古菌門之外的古細(xì)菌新門，為生命之樹帶來巨大變化。

2008年后，奇古菌門(Thaumarchaeota)[55]、初古菌門(Korarchaeota)[56]、曙古菌門(Aigarchaeota)[57]相繼被發(fā)現(xiàn)。其中奇古菌門是被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)新古細(xì)菌門類，而曙古菌門是第一個(gè)完全由宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)重建的基因組，并且發(fā)現(xiàn)了與真核生物同源的泛素系統(tǒng)。依據(jù)16S rRNA測序結(jié)果，這3個(gè)新門與泉古菌門一起歸為一個(gè)單系群(monophyletic group)，稱為“TACK”超門(TACK superphylum)或變形古菌(Proteoarchaeota)[58,59]。通過改進(jìn)的最大似然估計(jì)或貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型，人們發(fā)現(xiàn)真核生物從TACK超門內(nèi)分支出來或是TACK超門的一個(gè)姐妹群(圖4A)[17,60]。這表明真核生物分支是從古細(xì)菌域內(nèi)發(fā)出的，支持上一部分所敘述的二域系統(tǒng)，否定三域系統(tǒng)。新發(fā)現(xiàn)的TACK超家族成員含有大量一般只在真核生物中表達(dá)或與其相關(guān)的真核生物標(biāo)志蛋白(eukaryotic signature proteins, ESPs)，如肌動(dòng)蛋白、微管蛋白的古細(xì)菌同源物、轉(zhuǎn)錄翻譯因子類似的蛋白等[11]。TACK超門成為追溯真核細(xì)胞起源的重要研究材料。

2014年以來，通過改進(jìn)的宏基因組技術(shù)——解碼宏基因組(genome-resolved metagenomics)，人們又在TACK超門中發(fā)現(xiàn)新的古細(xì)菌門：深古菌門(Bathyarchaeota)、地古菌門(Geoarchaeota)和韋斯特古菌門(Verstraetearchaeota) (圖4B)[17]。廣古菌門外還存在著一個(gè)深枝DPANN超門(DPANN super-phylum)，包含丙鹽古菌門(Diapherotrites)、小古菌門(Parvarchaeota)、謎古菌門(Aenigmarchaeota)、納古菌門(Nanoarchaeota)和納鹽古菌門(Nanohaloar-chaeota) (圖4B)[17]。這些發(fā)現(xiàn)極大地豐富了生命之樹中古細(xì)菌的分支。

近5年來的一個(gè)重要突破是發(fā)現(xiàn)了與真核生物遺傳關(guān)系更近的Asgard古細(xì)菌。Asgard古細(xì)菌大多生活在海底，分類上原先屬于海洋底棲類群B (Marine Benthic Group B, MBG-B)、古代古細(xì)菌群(Ancient Archaeal Group, AAG)、深海古細(xì)菌群(Deep-sea Archaeal Group, DSAG)和海洋熱液噴口群(Marine Hydrothermal Vent Group)[61]。2015年，瑞典烏普薩拉大學(xué)Ettema課題組在北冰洋Loki’s Castle附近的海底沉積物中利用宏基因組技術(shù)重建出一種新的古細(xì)菌基因組，命名為洛基古菌門(Lokiarchaea)，蛋白質(zhì)組中的重要部分(175個(gè)蛋白質(zhì)，占比3.3%)都與真核蛋白相似，為ESPs，參與膜的變形和細(xì)胞形狀的形成過程[11]。此后，又發(fā)現(xiàn)了與Lokiarchaea門相近的3個(gè)新門：奧丁古菌門(Odinarchaeota)、索爾古菌門(Thorarchaeota)和海姆達(dá)爾古菌門(Heimdallarchaeota)[12,62]。這4個(gè)新門被一并命名為Asgard超門(Asgard superphylum)[11,12](圖4B)，是真核生物的姐妹群。其中，海姆達(dá)爾古菌門與真核生物距離最近[63]。

圖4 發(fā)現(xiàn)新門類古細(xì)菌后的生命之樹

A：新發(fā)現(xiàn)TACK超門古細(xì)菌。真核生物是TACK超門的一個(gè)姐妹群，或者直接從TACK超門中產(chǎn)生。B：新發(fā)現(xiàn)DPANN超門和Asgard超門古細(xì)菌。DPANN超門形成古細(xì)菌的一個(gè)深枝，Asgard超門與真核生物進(jìn)化距離最近，真核生物是Asgard超門的一個(gè)姐妹群，或者直接從Asgard超門中產(chǎn)生。根據(jù)文獻(xiàn)[17]修改繪制。

不過，新的發(fā)現(xiàn)也引發(fā)了學(xué)術(shù)界的爭議。一方面，Da Cunha等[64]指出，Ettema課題組的取樣存在污染，最終結(jié)果也因?yàn)槿〉窖莼俣瓤斓男蛄卸斐蒐BA效應(yīng)，并且去除數(shù)據(jù)集中的蛋白延伸因子EF2便足夠破壞真核生物與Lokiarchaea的密切關(guān)系。他們認(rèn)為Lokiarchaea和Asgard超門是廣古菌門的姐妹群，而非真核生物的姐妹群，且真核生物為單系群，根源通往TACK超門中Thaumarchaeota的分支，最終結(jié)果是三域系統(tǒng)。Ettema課題組的Spang等對此進(jìn)行了反駁，認(rèn)為沒有證據(jù)表明取樣污染，去除EF2依然能夠證明Asgard與真核生物屬于一個(gè)單系群，而Da Cunha等使用了不合適的方法導(dǎo)致三域系統(tǒng)結(jié)果[65]。此后雙方仍有爭論，但未有結(jié)果[66,67]。最近，Williams等[49]針對Da Cunha等[64]的結(jié)果，使用相同軟件的不同最大似然方法包分析相同數(shù)據(jù)，得到與原文不同的二域系統(tǒng)結(jié)果；他們進(jìn)一步使用多個(gè)新模型分析35個(gè)基因的對齊結(jié)果，真核生物均與Asgard古細(xì)菌形成姐妹群；基于“超樹”和基因合并對齊方法分析3000多個(gè)古細(xì)菌和真核生物基因的結(jié)果顯示真核生物是從古細(xì)菌域內(nèi)產(chǎn)生的，因此認(rèn)為“生命之樹”應(yīng)當(dāng)為二域系統(tǒng)。另一方面，Harish等[68~70]以蛋白質(zhì)折疊作為分析對象，將前人證明三域系統(tǒng)的模型[71,72]擴(kuò)展為非平穩(wěn)模型(non- stationary model)，推算出的生命之樹樹根將細(xì)胞生命分為無核生物(Akaryote，即古細(xì)菌與真細(xì)菌)和真核生物二域，形成了一個(gè)與此前二域、三域生命之樹均不同的二域系統(tǒng)(圖5)。分析結(jié)果還指出，Asgard古細(xì)菌與所有其他的古細(xì)菌是姐妹群，難以作為一個(gè)整體處理。這一結(jié)論說明細(xì)胞生命內(nèi)最深層次的分裂位于原核與真核之間。相比常用的蛋白質(zhì)氨基酸序列[49]，Harish等[73]認(rèn)為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在生化角度上非冗余和更保守，更適合作為進(jìn)化標(biāo)記進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。然而，這個(gè)新的二域生命之樹是選取不同進(jìn)化分子標(biāo)記的結(jié)果，違背了此前眾多研究所證明的真核生物與古細(xì)菌間的密切關(guān)系，因此爭論依然存在。

對于Asgard古細(xì)菌與真核生物的密切關(guān)系也存在不同解讀。Fournier和Poole[74]便試圖以現(xiàn)代哺乳動(dòng)物的祖先合弓綱(Synapsida)與現(xiàn)代爬行動(dòng)物的進(jìn)化關(guān)系作為平行案例，說明僅從真核生物與Asgard古細(xì)菌的譜系關(guān)系無法解決二域/三域爭論，此外還應(yīng)確定古細(xì)菌和真細(xì)菌之間的根源。

雖有上述爭論，但發(fā)現(xiàn)新的、進(jìn)化上更接近于真核生物的Asgard種類依然是重要的研究方向。Seitz等[75]發(fā)現(xiàn)了新的Asgard古細(xì)菌海拉古菌門(Helarchaeota)。深圳大學(xué)李猛課題組利用開源數(shù)據(jù)庫中的現(xiàn)有數(shù)據(jù)分析Asgard古細(xì)菌16S rRNA序列，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)此前未知的Asgard亞組(subgroup)，并且為Asgard古細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄活性混合營養(yǎng)型生活方式提供了證據(jù)[76]。他們利用幾個(gè)沿海沉積物樣本重建出15個(gè)基因組，其中包括一個(gè)新的Asgard門類“Gerdarchaeota”[77]。最近，他們設(shè)計(jì)的新SSU rRNA引物完成了Asgard中一種不能與通用引物匹配的新類群的擴(kuò)增工作[78]。Ettema課題組未發(fā)表的結(jié)果也顯示發(fā)現(xiàn)了5個(gè)新Asgard類群，其中Idunnarchaeota是目前與真核生物最接近的類群[79]。

總之，隨著模型的復(fù)雜化、基因序列和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)的積累以及新門類古細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)，學(xué)術(shù)界對于生命之樹的爭論已逐漸由三域系統(tǒng)向二域系統(tǒng)學(xué)說傾斜。主流觀點(diǎn)認(rèn)為真核生物產(chǎn)生自古細(xì)菌域內(nèi)，Asgard超門是目前與其進(jìn)化距離最接近的古細(xì)菌。在未來，生命之樹的形態(tài)以及真核生物的定位仍可能不斷改變，但Carl Woese的三域生命之樹仍將長期存在于教科書與人們的腦海中。

2 真核生物的起源機(jī)制

2.1 真核生物起源機(jī)制的研究現(xiàn)狀

關(guān)于真核生物的起源，首先需要明確的兩個(gè)概念是FECA和LECA。FECA (first eukaryotic common ancestor)指所有真核生物的最早共同祖先；而LECA (last eukaryotic common ancestor)指所有現(xiàn)存真核生物距今最近的共同祖先[17]。FECA與LECA間的階段常被稱為進(jìn)化樹上的莖期(stem phase)[80]。大量原生生物和多細(xì)胞生物的基因組學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究已證明，LECA擁有現(xiàn)代真核生物的大部分遺傳和細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征，如細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞骨架、囊泡和運(yùn)輸系統(tǒng)、細(xì)胞周期等[6]。保守估計(jì)LECA基因組有至少4000~5000個(gè)基因[80,81]。

圖5 有爭議的新二域生命之樹

依據(jù)蛋白質(zhì)折疊分析結(jié)果構(gòu)建的生命之樹將生物分為真核生物和無核生物兩域。根據(jù)文獻(xiàn)[73]修改繪制。

從理論上分析，原核生物向真核生物的轉(zhuǎn)變大致涉及以下方面：由厭氧向兼性厭氧、好氧代謝方式的轉(zhuǎn)變，共生與內(nèi)共生，吞噬作用的產(chǎn)生，基因組嵌合體的變化，細(xì)胞核的出現(xiàn)，信號通路的復(fù)雜化，被膜細(xì)胞器的出現(xiàn)，細(xì)胞周期的出現(xiàn)，細(xì)胞體積的增大等等[1]。研究真核生物起源機(jī)制的關(guān)鍵在于以FECA和LECA為坐標(biāo)，理清莖期中這些進(jìn)化事件的先后關(guān)系和具體過程。

結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論分析，一些局部的問題已經(jīng)得到充分闡釋，例如GTPase、longins、COPs和ESCRT-III復(fù)合物等真核生物標(biāo)志性蛋白的進(jìn)化歷程，內(nèi)膜系統(tǒng)和核孔復(fù)合物等真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組建過程已在大量綜述中有詳盡描述[6,82,83]。

然而，從整體上解決真核生物的起源機(jī)制始終繞不開線粒體的起源問題(圖6)[6,84]。作為細(xì)胞的能量工廠，線粒體為真核生物在“大氧化事件”后在有氧環(huán)境中的輻射進(jìn)化提供了必要條件；真核生物內(nèi)膜系統(tǒng)與細(xì)胞核的產(chǎn)生也與線粒體的內(nèi)共生密切相關(guān)。

2.2 線粒體與真核生物起源

線粒體普遍存在于現(xiàn)代真核生物體內(nèi)，且隨不同物種展現(xiàn)出豐富的多樣性[85]。許多真核生物(多營寄生生活)為適應(yīng)厭氧環(huán)境，將線粒體簡化為線粒體相關(guān)細(xì)胞器(mitochondrion-related organelles, MROs)[86,87]。極端的例子如sp.的線粒體已完全喪失[88]。但學(xué)界普遍認(rèn)為線粒體的簡化喪失是發(fā)生在LECA之后比較新的進(jìn)化行為，LECA擁有線粒體結(jié)構(gòu)[30,81,89]。

圖6 線粒體內(nèi)共生是引發(fā)真核生物起源的重要事件

現(xiàn)有的主流觀點(diǎn)認(rèn)為一種類似于現(xiàn)存Asgard超門的古細(xì)菌宿主內(nèi)共生一種α-變形菌后形成胞內(nèi)的線粒體，原核細(xì)胞逐漸演化為真核細(xì)胞。根據(jù)文獻(xiàn)[6]修改繪制。

真核生物祖先最初通過內(nèi)共生途徑獲得線粒體。1905年，俄國植物學(xué)家Konstantin Mereschkowsky便提出葉綠體由內(nèi)共生形成的構(gòu)想；20世紀(jì)20年代，Wallin將此推廣至線粒體[90]。40多年后，美國生物學(xué)家Lynn Sagan (后來的Lynn Margulis)重拾內(nèi)共生理論，在著名的一文中提出真核生物的細(xì)胞器包括線粒體和葉綠體在內(nèi)都是由內(nèi)共生細(xì)菌演化而來的[91]，引發(fā)巨大爭議。不過，隨后對于線粒體、葉綠體的基因和蛋白的分析顯示它們都擁有與真核譜系相距甚遠(yuǎn)的原核特征，分別對應(yīng)α-變形菌和藍(lán)細(xì)菌，為內(nèi)共生學(xué)說提供了佐證[92~94]。后來在一書中，Margulis正式提出線粒體是原始真核生物吞噬革蘭氏陰性好氧細(xì)菌后，通過長期內(nèi)共生作用形成的[90]，逐漸得到學(xué)術(shù)界的廣泛認(rèn)可。自此，線粒體的內(nèi)共生起源成為真核生物起源研究的核心點(diǎn)。

2.2.1 線粒體內(nèi)共生的早期與晚期之爭

長期以來，學(xué)界在線粒體內(nèi)共生發(fā)生的時(shí)間問題上存在爭論。主要觀點(diǎn)分為兩派：一派認(rèn)為宿主吞噬好氧的α-變形菌前，已經(jīng)先通過不同途徑形成細(xì)胞核，成為具有真核細(xì)胞特征(含細(xì)胞核、動(dòng)態(tài)細(xì)胞骨架、內(nèi)膜系統(tǒng))的過渡體，具有原始吞噬功能等，被稱為晚期線粒體模型(“Mito-late” models)；另一派認(rèn)為，宿主首先與好氧的α-變形菌內(nèi)共生形成帶有線粒體的原核細(xì)胞，隨后促進(jìn)原核細(xì)胞演化出細(xì)胞核、內(nèi)膜系統(tǒng)等真核生物特征，被稱為早期線粒體模型(“Mito-early” models)。

20世紀(jì)80年代，研究者在現(xiàn)存真核生物中發(fā)現(xiàn)了不含線粒體的物種，如賈第蟲屬()、毛滴蟲屬()等，大多是寄生蟲。英國演化生物學(xué)家Cavalier-Smith將它們歸類為源真核生物(archezoans)[95]，祖先是細(xì)胞內(nèi)部已具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)而尚未內(nèi)共生線粒體的初級真核生物，屬于真核生物樹中的早期分支譜系[96]。傳統(tǒng)的晚期線粒體假說認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)部的復(fù)雜結(jié)構(gòu)以及吞噬營養(yǎng)能力是線粒體起源的前提，細(xì)胞核的出現(xiàn)是為了避免細(xì)胞骨架牽拉對DNA的損傷[97,98]。基于此的真核生物起源機(jī)制有很多，幾個(gè)影響深遠(yuǎn)的模型如(圖7，A~D)所示[32,97,99~101]。內(nèi)共生學(xué)說提出者M(jìn)argulis本人認(rèn)為吞噬宿主是一種類似現(xiàn)代spp. (屬于廣古菌門)的嗜酸無壁古細(xì)菌，細(xì)胞核在嵌合細(xì)胞形成后自發(fā)進(jìn)化形成(圖7A)[100,102]；著名的互養(yǎng)共棲假說(圖7B)認(rèn)為真核生物來自產(chǎn)甲烷菌與δ-變形桿菌的共生作用[32]；Cavalier-Smith本人則認(rèn)為真核生物與古細(xì)菌演化自一個(gè)共同祖先，真核域與古菌域歸屬于新壁總域(Neomura) (圖7D)[98]。

但是，針對Cavalier-Smith提出的源真核生物概念，21世紀(jì)以來的研究表明，此前發(fā)現(xiàn)的所有不含線粒體的真核生物均含有產(chǎn)氫體(hydrogenosome)或mitosome等細(xì)胞器，與線粒體同源，是上文所說的MROs[1,30,105]。早期支持源真核生物概念的研究也被認(rèn)為受到分析偏差影響，導(dǎo)致源真核生物概念不再流行[30]。

此后，另一派早期線粒體假說獲得了許多擁護(hù)者。幾個(gè)經(jīng)典的Mito-early模型如(圖7，E~G)所示[31,103,104]，相似之處在于都是一對古細(xì)菌和真細(xì)菌首先形成共生關(guān)系，真細(xì)菌是古細(xì)菌代謝產(chǎn)物的受體，隨后內(nèi)共生，形成細(xì)胞核等其他結(jié)構(gòu)，其中包含著名的氫假說(圖7E)。

早期線粒體假說最有力的論據(jù)在于現(xiàn)存生物中尚未發(fā)現(xiàn)不含線粒體或其同源物的真核細(xì)胞過渡形態(tài)，這似乎暗示線粒體的內(nèi)共生應(yīng)發(fā)生在一個(gè)較早的時(shí)期，很可能早于細(xì)胞核。Von Dohlen等[106]在非吞噬作用的原核細(xì)胞體內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在其他原核細(xì)胞的現(xiàn)象也表明，內(nèi)共生或許不需要真核生物祖先擁有復(fù)雜的吞噬營養(yǎng)系統(tǒng)。

從線粒體與真核細(xì)胞其他結(jié)構(gòu)的關(guān)系角度也支持早期線粒體假說。Martin等[4,107~110]提出了對線粒體、細(xì)胞核和真核細(xì)胞分裂形式出現(xiàn)順序的推測。在線粒體始祖進(jìn)入宿主胞質(zhì)形成內(nèi)共生體后，兩者間的基因重組和啟動(dòng)子的相互關(guān)聯(lián)導(dǎo)致內(nèi)共生體(原始線粒體)基因在宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)[107]。這種嵌合的原核基因組模糊了宿主與內(nèi)共生體間的區(qū)別，彼此出現(xiàn)基因片段交換，如從線粒體基因組向宿主基因組轉(zhuǎn)移II型內(nèi)含子等。然而，原核生物的共轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制無法解決內(nèi)含子剪接速度比蛋白翻譯速度慢從而產(chǎn)生缺陷肽鏈的矛盾，細(xì)胞核的出現(xiàn)則為轉(zhuǎn)錄和翻譯提供了物理屏障[4]。隨后染色體被局限在細(xì)胞核內(nèi)，失去與細(xì)胞膜的接觸，在細(xì)胞分裂時(shí)無法自動(dòng)分離，使細(xì)胞體積較原核生物顯著增加[108]。同時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)由于富含線粒體產(chǎn)生的ATP，蛋白表達(dá)水平顯著升高。為解決染色體分離問題，可能出現(xiàn)了依賴于微管的染色體分離方式，最終形成減數(shù)分裂、真核細(xì)胞周期和有絲分裂過程[109,110]。此外，線粒體早期內(nèi)共生釋放外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)的過程也有利于解釋真核生物內(nèi)膜系統(tǒng)的快速形成[111]，詳細(xì)機(jī)制可參閱McBride[112]的綜述。

圖7 有關(guān)線粒體起源的模型

A~D為晚期線粒體模型，E~G為早期線粒體模型。A：Margulis認(rèn)為古細(xì)菌宿主熱原體菌()首先與螺旋菌(Spirochaete)內(nèi)共生，逐漸演化出細(xì)胞核，后形成線粒體[100]。B：互養(yǎng)共棲假說，產(chǎn)甲烷古細(xì)菌與δ-變形菌在代謝上存在氫的交換。一個(gè)產(chǎn)甲烷菌被多個(gè)δ-變形菌包圍后，δ-變形菌間的相互作用促進(jìn)胞質(zhì)融合，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)，δ-變形菌基因組隨著基因的轉(zhuǎn)移逐漸消失，線粒體的內(nèi)共生最后發(fā)生[32]。C：內(nèi)生核假說，泉古菌與G-真細(xì)菌互相作用，泉古菌形成細(xì)胞核，真細(xì)菌形成細(xì)胞質(zhì)，再與α-變形菌內(nèi)共生形成線粒體[101]。D：Cavalier-Smith認(rèn)為真核生物與古細(xì)菌演化自一個(gè)共同祖先，同屬新壁總域[97,99]。E：氫假說，宿主是嚴(yán)格依賴氫且嚴(yán)格自養(yǎng)的厭氧古細(xì)菌，共生體能進(jìn)行有氧呼吸，但通過厭氧異養(yǎng)代謝為宿主提供氫氣[31]。F：古細(xì)菌宿主在形成真核細(xì)胞的其他復(fù)雜結(jié)構(gòu)前首先與耗氧的α-變形菌內(nèi)共生形成線粒體[103]。G：基于硫元素的代謝循環(huán)，宿主是產(chǎn)H2S的古細(xì)菌，線粒體祖先是耗H2S的α-變形菌[104]。根據(jù)文獻(xiàn)[30]修改繪制。

近10年來，有關(guān)Mito-late和Mito-early模型的問題仍有爭論。延續(xù)Mito-early假說風(fēng)潮，主流觀念認(rèn)為線粒體祖先先于宿主吞噬作用出現(xiàn)，直接侵入古細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生內(nèi)共生，導(dǎo)致真核細(xì)胞的產(chǎn)生[53,113]。然而，發(fā)現(xiàn)Asgard古細(xì)菌Lokiarchaeota后，基因組重建出大量細(xì)胞骨架相關(guān)的ESPs，開啟了具有吞噬作用的原核生物譜系從古細(xì)菌域內(nèi)部進(jìn)化的可能性，支持Mito-late模型[11,114]。但后續(xù)基于宏基因組重建的研究顯示，Asgard古細(xì)菌不具備吞噬營養(yǎng)功能，吞噬作用的形成涉及來自古細(xì)菌、真細(xì)菌以及真核生物新基因的組合[115]，宿主是否具有吞噬功能依然未知。不過，限于主流觀念大多是依據(jù)對當(dāng)今真核生物組織和功能方面的觀察所作的進(jìn)化推斷，始終缺乏確切的實(shí)驗(yàn)分析證據(jù)，Hampl等[116]便認(rèn)為沒有充分的理由肯定線粒體產(chǎn)生于細(xì)胞吞噬作用之前。

總的來說，目前Mito-early假說更為流行，但也面臨著其他一些無法解釋的現(xiàn)象：真核生物的嵌合性基因組中，大多數(shù)來自細(xì)菌的基因無法回溯到線粒體的祖先α-變形菌。2016年，Pittis和Ga-baldón[2,117]首次通過比較真核生物與距離最近的原核生物蛋白間的親緣距離，發(fā)現(xiàn)α-變形菌與真細(xì)菌來源蛋白之間的進(jìn)化距離短于真細(xì)菌與古細(xì)菌來源蛋白之間的進(jìn)化距離，推測線粒體內(nèi)共生前，真核細(xì)胞祖先可能已與其他真細(xì)菌內(nèi)共生形成嵌合基因組，胞內(nèi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，但還不是進(jìn)化成熟的真核細(xì)胞。Ettema[118]將其稱為介于Mito-early和Mito-late間的中期線粒體(Mito-intermediate)假說。但此結(jié)果引發(fā)許多質(zhì)疑。William和Nelson-Sathi[119]認(rèn)為作者采用了錯(cuò)誤的統(tǒng)計(jì)和分析方法；Esposti也認(rèn)為Pittis和Gabaldón的方法早已被證明失準(zhǔn)[53]，低估了α-變形菌祖先對真核生物譜系的影響[120]。此外，目前認(rèn)為與真核生物祖先關(guān)系最密切的Asgard古細(xì)菌本身也存在大量其他真細(xì)菌基因[17]。又鑒于位于現(xiàn)存α-變形菌綱深枝的磁球菌()具有一個(gè)α-變形菌成分僅占1/3的嵌合基因組，Esposti[120]推測久遠(yuǎn)的線粒體祖先本身很可能就是一個(gè)嵌合基因組，而非僅有α-變形菌的血統(tǒng)[121]，所以Pittis與Gabaldón的最終結(jié)論顯得有些草率。

至今，線粒體內(nèi)共生的早期與晚期之爭依舊無法定論，不過可以確定的是，線粒體的內(nèi)共生發(fā)生在TACK和Asgard古細(xì)菌基因組中所編碼的ESPs基因出現(xiàn)之后。若真如Esposti所說，線粒體祖先是一個(gè)嵌合基因組的話，這段長達(dá)30余年的爭論便可以畫上句號。

2.2.2 線粒體祖先的確定

探索線粒體始祖細(xì)菌的性質(zhì)有助于人們了解具體的內(nèi)共生過程。長久以來，線粒體祖先與α-變形菌綱相關(guān)的結(jié)論為學(xué)術(shù)界廣泛接受[93]，但與其中哪一譜系更加接近的問題始終沒有解決，給重建線粒體與現(xiàn)存α-變形菌譜系的最近祖先(last common ancestor)帶來困難。

大量通過單基因或全基因組基因串聯(lián)建樹的結(jié)果常常將線粒體與立克次氏體目(Rickettsiales)相關(guān)聯(lián)[122,123]。而當(dāng)引入Pelagibacterales目(SAR11)基因組數(shù)據(jù)作系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)，則發(fā)現(xiàn)Pelagibacterales目是線粒體-立克次氏體目一枝的姐妹群[124]，或直接是線粒體的姐妹群[125]。后來的分析表明，這些結(jié)果是受到線粒體和Pelagibacterales目之間趨同相似性影響帶來的偏差[126,127]。隨后，依賴于核基因編輯和線粒體基因編輯的線粒體蛋白數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果支持線粒體發(fā)源自立克次氏體目內(nèi)[128,129]。

但是，上述將線粒體與立克次氏體目關(guān)聯(lián)的研究也存在缺陷。第一，線粒體、立克次氏體目以及上文提到的Pelagibacterales目(SAR11)與其他α-變形菌綱的物種相比進(jìn)化更加迅速且已經(jīng)失去了許多基因，在基因組層面A+T占比頗高，很容易招致LBA偏差[89]。對此，一些研究的應(yīng)對措施是選用較早由線粒體基因組轉(zhuǎn)移到核基因組的基因進(jìn)行分析[128]，但不可忽視的一點(diǎn)是前文所提到的核基因組中存在的堿基替換、基因丟失和HGT問題。第二，推測的立克次氏體目在地球上的存在時(shí)間不夠長，目內(nèi)處于主干地位的屬僅有大約5億年歷史[120]。第三，立克次氏體目的代謝方式也與線粒體差別很大，普遍不存在現(xiàn)代真核生物的厭氧性狀，不編碼調(diào)節(jié)線粒體嵴的MICOS蛋白和功能等同于線粒體ATP合酶抑制亞基的相關(guān)結(jié)構(gòu)[120]。

另一種通過單基因數(shù)據(jù)集和多基因串聯(lián)數(shù)據(jù)集推斷網(wǎng)絡(luò)的方法將線粒體與其他α-變形菌綱分支相連，如紅螺菌目(Rhodospirillales)的紅螺菌屬()和根瘤菌目(Rhizobiales)的蒼白桿菌屬()[89]。從代謝相似性來看，有分析認(rèn)為線粒體可能更加接近于紅螺菌屬[120]。還有研究認(rèn)為線粒體來自α-變形菌綱內(nèi)的一個(gè)獨(dú)立深枝[127]。

2018年，Martijn等[130]通過宏基因組重建得到12個(gè)α-變形菌綱譜系(包含幾個(gè)新發(fā)現(xiàn)的譜系)，將線粒體放在了這些譜系的進(jìn)化分支之外，是所有測序的α-變形菌綱序列的姐妹群，與此前的眾多結(jié)果存在矛盾。然而，2019年Fan等[131]的結(jié)果則又顯著支持線粒體來源于α-變形菌綱內(nèi)的傳統(tǒng)觀點(diǎn)，并指出Martijn等在規(guī)避異源基因的處理時(shí)可能存在模型過度擬合的缺陷。

形成這一僵局的原因來自多方面。首先，許多現(xiàn)存的α-變形菌綱生物受到與其他細(xì)菌之間的雙向水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)影響[132]，線粒體始祖本身甚至可能就有一個(gè)嵌合體基因組[120]；其次，線粒體基因在進(jìn)化上比一般自由生活的細(xì)菌更加迅速[128]，且線粒體基因組向核基因的轉(zhuǎn)移與時(shí)間呈現(xiàn)非線性關(guān)系[133]，為模型的建立帶來困難；最后，α-變形菌綱作為一個(gè)成員變異性極大的綱，現(xiàn)存成員間的進(jìn)化關(guān)系仍在調(diào)整，例如Mu?oz-Gómez等[134]的研究已將Holosporales目從“廣義的立克次氏體目”(Rickett-siales sensu lato)中分離出來。環(huán)境微生物基因組的測定也在不斷發(fā)現(xiàn)新的α-變形菌綱物種。

綜上，線粒體始祖的判定仍是探索真核生物起源道路上亟需解決的問題。

2.2.3 古細(xì)菌宿主的確定

長期以來的系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究已經(jīng)基本確定線粒體內(nèi)共生的宿主與古細(xì)菌相關(guān)[84]。宏基因組技術(shù)出現(xiàn)之前，古細(xì)菌分為廣古菌門和泉古菌門兩門。宿主身份有頗多說法。泉古菌假說支持宿主屬于泉古菌門[28,29]；氫假說(圖7E)[31]與互養(yǎng)共棲假說(圖7B)[32]支持宿主屬于廣古菌門中的產(chǎn)甲烷菌(methanogens)；Searcy等[135]與Margulis等[100]支持宿主屬于廣古菌門中的熱原體菌() (圖7A)。這些模型雖彼此對立，但共同點(diǎn)是線粒體內(nèi)共生僅涉及一個(gè)古細(xì)菌宿主和一個(gè)真細(xì)菌內(nèi)共生體。然而，與此不同的其他一些模型則認(rèn)為宿主是兩種原核生物的嵌合體，這些觀點(diǎn)被統(tǒng)一稱作三元假說(ternary hypothesis)。其中較為流行的是內(nèi)生核假說(endokaryotic hypothesis) (圖7C)，推測宿主的細(xì)胞核起源于一種古細(xì)菌，而細(xì)胞質(zhì)起源于一種真細(xì)菌，以此解釋真核生物基因組中無法追溯到α-變形菌綱的細(xì)菌來源基因[101,136]。然而，后期的系統(tǒng)發(fā)育檢驗(yàn)并沒有發(fā)現(xiàn)這樣一個(gè)細(xì)菌譜系，這表明內(nèi)生核假說缺乏證據(jù)支持[53]。面對眾多模型長期不可調(diào)和的僵局，2012年，Godd[137]提出了另一種三元假說。在融合納古菌屬() (當(dāng)時(shí)未獨(dú)立為門，屬于廣古菌門)和燃球菌屬() (屬于泉古菌門)兩種古細(xì)菌的基因組后，Godd發(fā)現(xiàn)可以解釋當(dāng)時(shí)的大部分?jǐn)?shù)據(jù)，提出宿主可能是兩種古細(xì)菌的嵌合體(chimera)。這一設(shè)想具有很強(qiáng)的創(chuàng)新性，但仍然需要大量的系統(tǒng)發(fā)育分析和細(xì)胞學(xué)研究檢驗(yàn)才能令人信服。

在結(jié)合宏基因組和單細(xì)胞基因組分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)TACK超門和Asgard超門以后，內(nèi)共生宿主的身份逐漸明朗，也基本消除了第三個(gè)原始真核生物譜系存在的可能性[11,17]。Asgard古細(xì)菌中大量ESPs的出現(xiàn)同時(shí)否定了其他一些有關(guān)病毒影響真核生物起源的理論。這些理論認(rèn)為真核生物的大量基因，甚至細(xì)胞核本身都來自核質(zhì)大DNA病毒(nucleo-cytoplasmic large DNA viruses, NCLDVs)[138,139]，其基于的證據(jù)主要是在NCLDVs中發(fā)現(xiàn)了許多與真核生物相關(guān)的基因。而如今Asgard古細(xì)菌中大量ESPs的發(fā)現(xiàn)以及隨后糾正的系統(tǒng)發(fā)育分析則表明，NCLDVs中的真核樣基因?qū)嶋H來自于真核生物病毒的HGT。病毒的高進(jìn)化速率為此前的系統(tǒng)發(fā)育重建帶來偏差，導(dǎo)致了NCLDVs是真核生物基因甚至是細(xì)胞核源頭的判斷。事實(shí)上，NCLDVs可能是Asgard古細(xì)菌或相關(guān)譜系的古老成員[90]。

如今，對Asgard古細(xì)菌的分析研究已經(jīng)成為了解真核生物祖先的重要手段。Asgard超門呈現(xiàn)出豐富的代謝方式。宏基因組重建分析推測Asgard超門普遍存在氮和硫代謝循環(huán)[61]，不能進(jìn)行吞噬作用[115]，Lokiarchaeota存在依賴氫的代謝途徑[140]，Thorar-chaeota存在依賴無機(jī)碳和有機(jī)碳的混合代謝以及產(chǎn)乙酸途徑[62,141]，Lokiarchaeota和Thorarchaeota存在鹵代有機(jī)物代謝途徑[142]，Heimdallarchaeota存在光能營養(yǎng)途徑[143,144]，Helarchaeota存在厭氧碳?xì)浠衔锎x途徑[75]，部分Lokiarchaeota編碼鎳鐵氫化酶[142]?；谶@些代謝研究提出的真核生物起源新模型也不斷涌現(xiàn)，如電子或氫從有機(jī)異養(yǎng)古細(xì)菌宿主流向細(xì)菌共生體的“逆流模型”(reverse flow model) (圖8A)[145]。此外，對水底生物墊內(nèi)Asgard古細(xì)菌與周圍其他細(xì)菌的基因組綜合研究也有助于闡釋線粒體祖先與宿主內(nèi)共生前的共生關(guān)系，例如Sagha?等[146]便利用16S/18S rRNA宏條形碼和多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)，在鹽沼池水中發(fā)現(xiàn)了Lokiarchaeota與此前知之甚少的細(xì)菌門類TA06間的強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系，可能存在共生作用。

由于大量Asgard古細(xì)菌的研究結(jié)論都只是基于宏基因組分析的結(jié)果，細(xì)胞生物學(xué)層面的研究驗(yàn)證便顯得尤為重要。然而，Asgard古細(xì)菌的生長環(huán)境大多處于海底沉積物中，且可能依賴其他共生細(xì)菌生存，這為Asgard古細(xì)菌的分離培養(yǎng)和蛋白的提純帶來巨大困難，相關(guān)工作開展緩慢。Ak?l和Robinson[147]取得了標(biāo)志性成果。他們利用質(zhì)粒載體表達(dá)Asgard古細(xì)菌的前纖維蛋白編碼基因，發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物能夠成功與哺乳動(dòng)物的肌動(dòng)蛋白結(jié)合，即使相距2、30億年的進(jìn)化距離依舊與哺乳動(dòng)物的相關(guān)蛋白呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的相似性，這為Asgard超門與真核生物的相似性提供了一個(gè)細(xì)胞學(xué)證據(jù)。

圖8 真核生物起源的逆流模型與E3模型的對比

A：逆流模型；B：E3模型。兩個(gè)模型的共同點(diǎn)是異養(yǎng)古細(xì)菌宿主與α-變形菌內(nèi)共生形成線粒體；不同點(diǎn)在于E3模型比逆流模型多引入了一個(gè)共生菌——硫酸鹽還原細(xì)菌。

近年來，對Asgard古細(xì)菌的研究終于迎來里程碑式的成果。日本科學(xué)家Imachi等[13]花費(fèi)12年時(shí)間利用連續(xù)流動(dòng)生物反應(yīng)器，成功從深海沉積物中分離，并首次在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下提純培養(yǎng)出一個(gè)Asgard古細(xì)菌菌株MK-D1，屬于Lokiarchaeota。該研究的原始目的是尋找甲烷降解菌[148]。分離到的Lokiarchaeota門古細(xì)菌生長緩慢，滯后期長達(dá)3~6個(gè)月，二倍擴(kuò)增需14~25天。進(jìn)一步觀察顯示，這是一種小型厭氧球菌，細(xì)胞可以形成凸起結(jié)構(gòu)、氣泡和胞外小泡，沒有明顯的真核樣細(xì)胞器，具備厭氧代謝氨基酸的能力，依賴共生菌一起生存。Imachi等據(jù)此提出了新的真核生物起源模型——糾纏–吞噬–內(nèi)生(entangle–engulf–endogenize, E3)模型：厭氧古細(xì)菌宿主與一種硫酸鹽還原細(xì)菌共生，共生細(xì)菌是宿主氨基酸代謝產(chǎn)生的脂肪酸和氫氣的受體，隨后宿主與另一好氧細(xì)菌內(nèi)共生形成線粒體，共涉及3種原核生物。這與此前僅涉及兩個(gè)原核生物的“逆流模型”[145]存在不同(圖8)。逆流模型認(rèn)為古細(xì)菌代謝產(chǎn)生的氫氣直接被線粒體祖先消耗，無需引入假設(shè)的另一個(gè)共生伴侶(圖8A)，而E3模型中的線粒體起源是處于共生關(guān)系下的厭氧宿主古細(xì)菌對環(huán)境中氧氣濃度增加的適應(yīng)行為(圖8B)。

在未來，有關(guān)古細(xì)菌宿主的研究無疑將借鑒Imachi等的經(jīng)驗(yàn)，從環(huán)境中發(fā)現(xiàn)并在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)研究與真核生物進(jìn)化距離更近的微生物。

3 結(jié)語與展望

近幾十年來對真核生物起源的研究積累了大量數(shù)據(jù)、模型和觀點(diǎn)，這是一個(gè)涉及進(jìn)化生物學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和古生物學(xué)等多領(lǐng)域的宏大問題。新技術(shù)的發(fā)明(如16S/18S rRNA測序、基因組測序、宏基因組測序和單細(xì)胞全基因組測序)、新物種的發(fā)現(xiàn)(如古細(xì)菌域、TACK超門和Asgard超門)以及分析方法的改進(jìn)不斷推動(dòng)我們對于真核生物起源的認(rèn)知。

然而爭論依然存在，主流觀點(diǎn)將生命之樹上的真核生物分支放在古細(xì)菌域內(nèi)，從Asgard超門內(nèi)發(fā)出或是Asgard超門的姐妹群，對應(yīng)二域系統(tǒng)生命之樹；真核生物的始祖是一個(gè)類似Asgard超門的古細(xì)菌，在與一種α-變形菌綱細(xì)菌內(nèi)共生形成線粒體后促進(jìn)其他細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的進(jìn)化。

未來的研究重點(diǎn)，一方面在于改進(jìn)系統(tǒng)發(fā)育分析方法，并延續(xù)環(huán)境微生物的宏基因組重建分析工作。在確定古細(xì)菌宿主的角度上，發(fā)現(xiàn)新的Asgard古細(xì)菌，甚至是其他與真核生物更接近的古細(xì)菌新門類。在確定線粒體祖先的角度上，亟需理清α-變形菌綱的譜系關(guān)系。目前可獲取到基因組數(shù)據(jù)的α-變形菌綱物種大多與醫(yī)學(xué)與農(nóng)業(yè)相關(guān)，或者是部分可在實(shí)驗(yàn)室條件下分離培養(yǎng)的菌種[120,130]，可能存在一定的取樣偏差，不一定能完全代表現(xiàn)存α-變形菌的多樣性。因此，在海水、地下水和土壤等環(huán)境中發(fā)現(xiàn)未培養(yǎng)微生物，擴(kuò)展α-變形菌綱物種數(shù)的工作可能仍是重中之重。此外，發(fā)展基因樹–物種樹(gene tree-species tree)綜合分析[149]等更加復(fù)雜的計(jì)算方法也有望為線粒體的祖先提供更加精確的定位。另一方面，實(shí)驗(yàn)室中的細(xì)胞生物學(xué)研究亟需跟進(jìn)。在確定古細(xì)菌宿主的角度上，借鑒Imachi等[13]的工作，實(shí)驗(yàn)室條件下直接培養(yǎng)Asgard古細(xì)菌進(jìn)行基因組測序可以避免宏基因組重建時(shí)的誤差，直接觀察細(xì)胞形態(tài)和代謝過程。但這面臨兩個(gè)問題，一是需要改進(jìn)生物反應(yīng)器系統(tǒng)，縮短Asgard古細(xì)菌的分離提純時(shí)間；二是需要研究自然條件下Asgard古細(xì)菌的生活環(huán)境和共生細(xì)菌等，摸索其在實(shí)驗(yàn)室中的最適培養(yǎng)條件，加快繁殖速度以供實(shí)驗(yàn)需求。在確定線粒體祖先的角度上，Hu[150]通過冷凍電鏡發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞線粒體存在與許多現(xiàn)存α-變形菌綱生物相似的出芽增殖方式，不同于傳統(tǒng)主流觀點(diǎn)所描述的二分裂增殖方式，而這一現(xiàn)象難以在常用的熒光顯微鏡下觀察到。此結(jié)果說明或許可以將新一代顯微成像技術(shù)應(yīng)用于線粒體祖先的研究中，從形態(tài)學(xué)層面比較線粒體與立克次氏體等現(xiàn)存α-變形菌的異同，為系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析提供必要補(bǔ)充。此外，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對真核細(xì)胞進(jìn)化某些步驟的直接模擬實(shí)驗(yàn)也有利于我們還原真核生物始祖的內(nèi)共生效應(yīng)和細(xì)胞器的進(jìn)化歷程。相關(guān)研究工作已在開展之中，例如2018年Mehta等[151]報(bào)道的在酵母胞質(zhì)內(nèi)培養(yǎng)大腸桿菌多達(dá)120天的工作。

最后，值得提出的一點(diǎn)是，現(xiàn)在采用的Asgard古細(xì)菌等研究對象并不古老，也同真核生物一樣走過了十幾億年的輻射進(jìn)化歷程?，F(xiàn)存代謝方式豐富多樣的Asgard古細(xì)菌不可能完全代表原始的真核生物。未來的目標(biāo)將是通過分析大量現(xiàn)存與即將涌現(xiàn)的數(shù)據(jù)，提出一個(gè)適用于所有真核生物特征的真核生物起源模型。

致謝

本文在撰稿及寫作過程中得到南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊四海教授的悉心指導(dǎo)，特此表示由衷的感謝。

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Progress in elucidating the origin of eukaryotes

Zhiwei Gao1, Long Wang2

Knowledge of the origin of eukaryotes is key to broadening our understanding of the eukaryotic genome and the relationship among internal structures within a eukaryotic cell. Since the discovery of archaea in 1977 and the proposal of three-domain tree of life by the American microbiologist Carl Woese, the intimate relationship in evolution between eukaryotes and archaea has been demonstrated by considerable experiments and analyses. From the beginning of the 21st century, with the development of phylogenetic methods and the discovery of new archaeal phyla more related to eukaryotes, increasing evidence has shown that Eukarya and Archaea should be merged into one domain, leading to a two-domain tree of life. Nowadays, the Asgard superphylum discovered via metagenomic analysis is regarded as the closest prokaryotes to eukaryotes. Nevertheless, several key questions are still under debate, such as what the ancestors of the eukaryotes were and when mitochondria emerged. Here, we review the current research progress regarding the changes of the tree of life and the detailed eukaryotic evolutionary mechanism. We show that the recent findings have greatly improved our knowledge on the origin of eukaryotes, which will pave the way for future studies.

eukaryogenesis; tree of life; archaea; three domains; two domains; endosymbiosis; mitochondria; Asgard superphylum

2020-04-18;

2020-05-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：31970236)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31970236)]

高志偉，在讀本科生，專業(yè)方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: 171240503@smail.nju.edu.cn

王龍，博士，副教授，研究方向：分子遺傳與進(jìn)化。E-mail: wanglong@nju.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-107

2020/6/5 10:08:53

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200604.1524.001.html

(責(zé)任編委: 劉鋼)