五子衍宗丸對少精癥小鼠睪丸基因表達譜的影響

孟雪丹 趙崇軍 趙霞 張文婷 王昭懿 顧念念 馮丹 吳怡青 鄒迪新 林瑞超

不育不孕在全球的患病率約為9%[1-2]，少精癥是男性不育的主要臨床表型，發(fā)病機制復(fù)雜(基因突變、環(huán)境污染、性激素內(nèi)分泌紊亂等)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無有效的藥物治療方案[3]。

五子衍宗丸是中醫(yī)治療少弱精癥的經(jīng)典名方，由五味子、枸杞子、覆盆子、菟絲子、車前子組成，臨床上對于少精子癥治療效果顯著[4]。大量臨床觀察和實驗研究不斷拓展了對五子衍宗丸藥理性質(zhì)的認識，但多數(shù)評價仍停留在某個或某幾個角度或水平進行研究，缺乏五子衍宗丸作用機制的系統(tǒng)研究，限制了該方的進一步開發(fā)和臨床應(yīng)用[5]。白消安可造成睪丸生精細胞的損傷，是誘導(dǎo)少精癥動物模型的常見方法[6]。為了從整體上探討五子衍宗丸治療少精癥的分子機制，本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)，分析經(jīng)五子衍宗丸治療后的少精癥小鼠睪丸組織基因表達譜的變化，應(yīng)用生物信息學(xué)從藥物調(diào)控基因的功能、信號通路等方面，為全面系統(tǒng)地探討五子衍宗丸治療少精癥的分子機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

Balb/c雄性小鼠，(20±2)g，10周齡，SPF級，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(中國，北京)[許可證號：SCXK(京) 2018-0010]。動物飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)中，溫度為 ( 25±1) °C，相對濕度為50%～60%，自由飲水及進食。動物實驗與操作遵照北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會的要求進行。將36只Balb/c小鼠隨機分成少精癥組、五子衍宗丸治療組和正常對照組，共3組，每組各12只。少精癥組給藥方法：小鼠腹腔注射白消安的DMSO溶液(1 mg/mL)，給藥劑量為20 mg/kg，建造白消安致小鼠少精癥模型。小鼠自白消安腹腔注射第2天，口服灌胃生理鹽水(14 mL/kg/d)，每日1次，連續(xù)14天。五子衍宗丸治療組給藥方法：小鼠自白消安腹腔注射第2天，口服灌胃給予五子衍宗丸 (1.56 g/kg/d)，每日1次，連續(xù)14天。正常對照組給藥方法：小鼠腹腔注射DMSO(1 mL/kg)，作為正常對照組。小鼠自DMSO腔注射第2天，口服灌胃給予生理鹽水溶液(14 mL/kg/d)，每日1次，連續(xù)14天。

1.2 藥物與試劑

五子衍宗丸：枸杞子、五味子、覆盆子、菟絲子、車前子購于同仁堂藥業(yè)有限公司(中國北京)，制備標準參照2015版《中華人民共國藥典》，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥品質(zhì)評價中心(北京市重點實驗室)制備成大蜜丸，4°C保存?zhèn)溆?。白消安購于麥克林生物化學(xué)公司 (中國上海)，二甲基亞砜( DMSO)購于國藥集團化學(xué)試劑公司 (中國北京) ，牛血清白蛋白購自索萊寶公司(中國北京)，胎牛血清( BI) 、DMED/F12 培養(yǎng)基購于Sigma 公司(美國密蘇里州)，70 μm細胞篩購于Corning公司(美國紐約州)，Trizol試劑購于Invitrogen公司(美國加利福尼亞州)，QIAGEN RNeasy Mini Kit購于Qiagen公司(德國杜塞爾多夫)，GeneChip WT PLUS Kit、GeneChip IVT Labeling Kit、Affymetrix Mouse Clariom?S Array購于Affymetrix公司(美國加利福尼亞州)。

1.3 實驗儀器

CIOC-XSI-G型生物顯微鏡(重慶光電儀器有限公司，中國)；BP-D精密電子天平(北京賽多利斯天平有限公司，中國)；RJ-TGL-16G臺式高速離心機(無錫市瑞江分析儀器有限公司，中國)；FACSCalibur單激光流式細胞儀(BD公司，美國)；Thremo Nanodrop 2000(Thermo公司，美國)；Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent公司，美國)，Affymetrix Fluidics Station 450(Agilent公司，美國)，GeneChip Scanner 3000(Agilent公司，美國)。

1.4 小鼠睪丸病理分析

末次給藥24小時后，稱取小鼠體重，乙醚麻醉，剖開腹腔取出睪丸，頸椎脫臼法處死小鼠。取右側(cè)睪丸置于體積分數(shù)4%的甲醛溶液中固定后，制成HE染色石蠟切片，顯微鏡下觀察并分析記錄組織形態(tài)。

1.5 睪丸單細胞懸液的制備

左側(cè)睪丸置于1%雙抗的PBS中清洗，手術(shù)剪刀剪開睪丸白膜，暴露生精小管，移生精小管入含I型膠原酶(120 U/mL)的PBS中，于32℃水浴搖床上，溫和震搖5分鐘。隨后加入適量0.25%Trypsin和DNaseI，至DNaseI 終濃度為300 μg/mL，消化5～7分鐘后，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，用PBS預(yù)潤的細胞篩(70 μm)過濾去除未消化的組織，將濾液移入離心管中，4℃，500×g，離心5分鐘，棄上清，重懸細胞，吹打混勻，制成睪丸單細胞懸液(濃度≥106個細胞/mL)。

1.6 睪丸中不同倍體精子細胞比例測定

取上述正常對照組、少精癥組和五子衍宗丸治療組的睪丸單細胞懸液樣品，每組6份，置冰上避光暫存，進行流式細胞測定。應(yīng)用Cell Quest軟件，根據(jù)DNA 含量確定單倍體(精子細胞)、二倍體(G1期精原細胞和次級精母細胞)和四倍體(G2期精原細胞和初級精母細胞)的細胞群比例。

1.7 睪丸細胞的基因芯片檢測

取正常對照組、少精癥組和五子衍宗丸治療組的睪丸單細胞懸液樣品，每組6份，提取各組的總RNA，經(jīng)純化、雜交等過程處理后，應(yīng)用基因芯片進行基因表達強度的檢測，獲得各基因的表達強度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

將處理后的標準數(shù)據(jù)導(dǎo)入Significance Analysis of Microarrays (SAM) 軟件，計算兩兩實驗組間的基因表達值的變化倍數(shù)(Fold Change，F(xiàn)C)和顯著性差異值(P-value)。以|FC|>1.5且P-value<0.05為標準條件，篩選組間差異基因。將篩選出的差異基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(https：//David.ncifcrf.gov/)進行GO功能分析、KEGG信號通路分析。采用SPSS 20.0軟件對流式細胞術(shù)檢測結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理。計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)的形式，經(jīng)正態(tài)性、方差齊性檢驗，結(jié)果顯示檢驗數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布且方差齊。對空白對照組、少精癥組和五子衍宗丸治療組使用單因素方差分析進行組間比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 睪丸組織病理分析

與正常對照組相比，少精癥組小鼠睪丸組織病理切片出現(xiàn)明顯的少精癥的睪丸損傷病理改變，如生精小管萎縮、生精小管上皮變薄、管腔內(nèi)生精細胞層級減少，排列紊亂，生精細胞間隙變寬，生精細胞發(fā)育阻滯在精母細胞階段。與少精癥組相比，五子衍宗丸治療組小鼠睪丸組織病理切片的生精小管排列整齊，結(jié)構(gòu)完整；管腔內(nèi)生精細胞排列緊密、層次清晰。見圖1。

2.2 睪丸精子細胞比例

與正常對照組相比，少精癥組的睪丸精子細胞比例顯著下降，與文獻報道的少精癥睪丸精子細胞比例相近[7]。與少精癥組相比，五子衍宗丸治療組的睪丸精子細胞比例顯著增加。見圖2和表1。

表1 正常對照組、少精癥組、五子衍宗丸治療組小鼠睪丸組織精子細胞比例比較(n=6)

注：A1、A2為正常對照組；B1、B2為少精癥組；C1、C2為五子衍宗丸治療組。

2.3 睪丸基因表達譜分析

2.3.1 差異基因篩選 應(yīng)用SAM 軟件對基因芯片表達數(shù)據(jù)進行組間差異基因的篩選，結(jié)果顯示，五子衍宗丸治療組與少精癥組相比，五子衍宗丸治療組共有839個差異表達基因，其中426個基因上調(diào)(差異基因集1)，613個基因下調(diào)(差異基因集2)，見圖3A；正常對照組與少精癥組相比，正常對照組共有1791個差異表達基因，其中915 個基因上調(diào)(差異基因集3)，876個基因下調(diào)(差異基因集4)，見圖3B。為篩選與少精癥組相比，五子衍宗丸治療組和正常對照組同時上調(diào)的基因，對差異基因集1和差異基因集3作交集(五子衍宗丸上調(diào)的差異基因)，結(jié)果表明五子衍宗丸上調(diào)的差異基因共有55個。見圖4A。進一步篩選與少精癥組相比，五子衍宗丸治療組和正常對照組同時下調(diào)的基因，對差異基因集2和差異基因集5作交集(五子衍宗丸下調(diào)的差異基因)，結(jié)果顯示，五子衍宗丸下調(diào)的差異基因有542個，見圖4B。

注：A為正常對照組；B為少精癥組；C為五子衍宗丸治療組；圖中 “1C”表示睪丸組織中的精子細胞(DNA含量為單倍體的細胞)；“2C”表示睪丸組織中的G1期精原細胞和次級精母細胞(DNA含量為二倍體的細胞)；“4C”表示睪丸組織中的G2期精原細胞和初級精母細胞(DNA含量為四倍體的細胞)。

注：A 為五子衍宗丸治療組與少精癥組之間的差異表達基因火山圖； B 為正常對照組與少精癥組之間的差異表達基因火山圖；圖中藍色代表下調(diào)基因；紅色代表上調(diào)基因；灰色代表無顯著表達變化基因。

注：A為五子衍宗丸組與少精癥組相比上調(diào)的基因及正常對照組與少精癥組相比上調(diào)的基因，交集部分為五子衍宗丸治療組和正常對照組共同上調(diào)的基因；B為五子衍宗丸組與少精癥組相比下調(diào)的基因和正常對照組與少精癥組相比下調(diào)的基因，交集部分為五子衍宗丸治療組和正常對照組共同下調(diào)的基因。

2.3.2 GO功能分析 對五子衍宗丸上調(diào)的差異基因進行GO生物過程分析，結(jié)果顯示，藥物上調(diào)基因共顯著富集到68條GO條目(P<0.05)，以P值對其進行顯著性差異的排序，上調(diào)排名前10名的GO條目見圖5A和表2，其中與調(diào)節(jié)男性生殖有直接聯(lián)系的GO條目為對精子生成的調(diào)控、對生精細胞減數(shù)分裂周期的調(diào)控、對精子細胞分化的調(diào)控、對生精細胞減數(shù)分裂過程中非姐妹染色單體交叉點形成的調(diào)節(jié)、對生精細胞減數(shù)分裂過程中聯(lián)會復(fù)合體形成的調(diào)節(jié)、對生精細胞減數(shù)分裂中的同源染色體配對的調(diào)控。五子衍宗丸下調(diào)的差異基因進行GO生物過程分析后，顯著富集到1042條GO條目(P<0.05)，按照P值排序，下調(diào)排名前10名的GO條目見圖5B和表2，涉及氧化還原過程、酶原活化、脂質(zhì)代謝過程、 全身動脈血壓的調(diào)節(jié)、 脂肪酸代謝過程 、 甾體生物合成過程、 對有機環(huán)狀化合物的響應(yīng)、老化、免疫系統(tǒng)過程和谷胱甘肽代謝過程。

2.3.3 信號通路分析 對五子衍宗丸上調(diào)的差異基因進行KEGG 信號通路分析，結(jié)果顯示，藥物上調(diào)基因顯著富集到3條信號通路(P<0.05)，見圖6A和表3，包括同源重組通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路和蛋白質(zhì)輸出通路，這三條通路均與生命體的遺傳信息處理密切相關(guān)。對五子衍宗丸下調(diào)的差異基因進行KEGG 信號通路分析后，共顯著富集到53條信號通路(P<0.05)，以P值對其進行顯著性差異的排序，下調(diào)排名前10名的信號通路見圖6B和表3，主要涉及腎素-血管緊張素系統(tǒng)、膽固醇代謝、藥物代謝-細胞色素P450通路、 脂肪酸代謝、內(nèi)分泌和其他因素調(diào)節(jié)的鈣再吸收等信號通路。

注：A為五子衍宗丸上調(diào)的差異基因(55個)高度富集的前10條GO生物過程條目；B為五子衍宗丸下調(diào)的差異基因(542個)高度富集的前10條GO生物過程條目

表2 五子衍宗丸調(diào)控睪丸差異基因高度富集的GO生物過程條目注釋

注：A為五子衍宗丸上調(diào)的差異基因(55個)顯著富集的KEGG信號通路； B為五子衍宗丸下調(diào)的差異基因(542)高度富集的前10條KEGG信號通路。

表3 五子衍宗丸調(diào)控睪丸差異基因高度富集的KEGG信號通路注釋

3 討論

本研究以白消安致少精癥小鼠為陰性對照，以五子衍宗丸口服給藥為實驗對照，以正常動物為空白對照，從睪丸病理和睪丸精子細胞比例兩個方面考察了五子衍宗丸口服給藥治療少精癥的效應(yīng)，研究結(jié)果顯示五子衍宗丸能明顯修復(fù)少精癥小鼠睪丸組織病理損傷，提高睪丸組織內(nèi)精子細胞比例，治療實驗性少精癥療效顯著。在此基礎(chǔ)上，為了進一步探討五子衍宗丸治療少精癥的分子機制，應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析了睪丸組織基因表達譜，系統(tǒng)地篩選出五子衍宗丸調(diào)控的少精癥小鼠睪丸基因有597個，其中55個上調(diào)，542個下調(diào)。五子衍宗丸調(diào)控的睪丸基因主要參與的GO 條目有精子生成、生精細胞減數(shù)分裂的周期、精子細胞分化、生精細胞減數(shù)分裂中的同源染色體配對、聯(lián)會復(fù)合體形成、非姐妹染色單體交叉點形成、氧化還原過程、酶原活化、脂質(zhì)代謝等生物過程；參與的信號通路主要有同源重組、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、蛋白質(zhì)輸出、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、膽固醇代謝、細胞色素P450對藥物的代謝等。

五子衍宗丸治療后，少精癥小鼠睪丸組織中調(diào)控精子生成的基因Rnf17、Trip13、Sohlh2 等表達上調(diào)，Rnf17在睪丸組織中特異性表達，是編碼精子生成的關(guān)鍵調(diào)控因子，該基因突變可導(dǎo)致雄性成年小鼠不育[8]。Trip13基因的表達可調(diào)節(jié)精母細胞減數(shù)分裂重組和DNA雙鏈斷裂修復(fù)，Trip13突變無法完成小鼠精母細胞的減數(shù)分裂重組，出現(xiàn)重組缺陷，觸發(fā)精母細胞階段阻滯，精子生成停滯[9-10]。Sohlh2是精子生成的特異性轉(zhuǎn)錄因子，僅在減數(shù)分裂前的精原細胞中表達，可通過調(diào)節(jié)A型精原細胞分化為B型精原細胞，影響分化精原細胞的活力，缺少Sohlh2的雄性小鼠由于精子生成的早期阻滯而無法生育[11]。Sycp1是編碼減數(shù)分裂橫絲蛋白的基因，調(diào)節(jié)精母細胞減數(shù)分裂重組、突觸復(fù)合體組裝和XY染色體形成，是維持男性生育力所必需的基因，Sycp1突變小鼠的精母細胞不形成XY染色體，且不能完成減數(shù)分裂重組的修復(fù)，觸發(fā)精子生成的中斷[12]。Gasz是僅在生殖細胞中表達的進化保守基因，編碼具有四個錨蛋白重復(fù)序列，不育α基序和亮氨酸拉鏈的蛋白，可抑制雄性生殖細胞中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達，并影響雄性生殖細胞的減數(shù)分裂，Gasz功能的喪失會導(dǎo)致男性不育，并具有成核和piRNA生物合成方面的缺陷[13]。另外，Gasz可與生殖細胞關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑Dazl相互作用，以協(xié)同方式促進胚胎干細胞衍生的生殖細胞，Gasz缺乏導(dǎo)致胚胎干細胞分化過程中生殖細胞明顯減少[14]。由上可知，五子衍宗丸可調(diào)節(jié)少精癥小鼠睪丸精子生成過程中多個基因的表達，提示這些基因的改變可能與該方有效治療少精癥的分子機制高度關(guān)聯(lián)。

同源重組(homologous recombination，HR)信號通路不僅在生精細胞減數(shù)分裂的同源染色體配對、聯(lián)會、交換等具有重要的調(diào)節(jié)作用，而且參與修復(fù)DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂和鏈間交聯(lián)等損傷，該通路抑制后，會導(dǎo)致生精細胞的減數(shù)分裂受阻，造成雄性不育缺陷[15]。本研究中，五子衍宗丸顯著上調(diào)了少精癥小鼠睪丸組織中的HR信號通路，提示藥物修復(fù)的HR信號通路可能與五子衍宗丸對少精癥小鼠睪丸精子生成的調(diào)節(jié)作用高度關(guān)聯(lián)。五子衍宗丸顯著下調(diào)少精癥小鼠睪丸組織中的信號通路主要有腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin-system，RAS)和膽固醇代謝。在男性生殖系統(tǒng)中，RAS信號通路的成分在睪丸Leydig細胞、附睪上皮細胞、附睪脂肪墊和前列腺腺上皮中表達，以旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌方式參與精子成熟，精漿維持電解質(zhì)和睪丸類固醇生成[16]，有研究表明抑制該信號通路有助于睪丸類固醇(睪丸酮、雌二醇和促黃體生成素)的生成，進而影響睪丸生精功能[17]，提示五子衍宗丸下調(diào)少精癥小鼠睪丸組織中的RAS信號通路可能影響了睪丸類固醇的生成。膽固醇穩(wěn)態(tài)與男性生育力密切相關(guān)，一方面膽固醇是睪丸雄激素的合成前體，另一方面其是生殖細胞細胞膜的主要成分，對膜的流動性、離子通道功能和信號傳導(dǎo)途徑的激活具有重要的調(diào)節(jié)作用[18]，有文獻報道睪丸組織生精障礙會引起膽固醇代謝異常，可能直接影響生殖細胞的膽固醇穩(wěn)態(tài)[19]。 本研究中，少精癥小鼠睪丸組織的膽固醇代謝途徑異常上調(diào)，五子衍宗丸治療后下調(diào)了該信號通路，提示五子衍宗丸可能通過干預(yù)膽固醇代謝途徑，維持生殖細胞的膽固醇穩(wěn)態(tài)，進而發(fā)揮藥物效應(yīng)。

本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)系統(tǒng)分析了五子衍宗丸對少精癥小鼠睪丸組織基因表達譜的影響，從基因?qū)用姹碚髁宋遄友茏谕柚委熒倬Y的分子機制。結(jié)果顯示，少精癥小鼠經(jīng)五子衍宗丸治療后睪丸組織中與精子生成相關(guān)的多個基因和多條信號通路發(fā)生了顯著變化，通過生物信息學(xué)挖掘，發(fā)現(xiàn)五子衍宗丸主要是通過調(diào)節(jié)生精細胞的減數(shù)分裂、睪丸HR信號通路、睪丸RAS信號通路、睪丸膽固醇代謝等影響精子生成及睪丸生精功能，從而對少精癥起到治療作用，同時，為闡明五子衍宗丸治療少精癥的藥理作用機制、進一步實驗研究及臨床應(yīng)用提供了一定的參考。