王淑玲，顏 令，徐蘭蘭，張 震，李 甜，廖 璞

中國科學院大學重慶醫(yī)院/重慶市人民醫(yī)院檢驗科，重慶 400014

盡管目前病原微生物檢測發(fā)展到高通量測序階段，但涂片檢查仍然是病原學最直接、最經(jīng)濟的手段。為提高重慶市臨床微生物實驗室形態(tài)學顯微鏡檢查(簡稱鏡檢)能力，重慶市臨床檢驗中心于2016年開展了細菌學涂片革蘭染色項目室間質(zhì)評，至2019年度已開展了8次細菌學涂片革蘭染色項目，為了更好地發(fā)現(xiàn)問題，提高鏡檢水平，本研究對2016-2019年重慶市細菌學涂片革蘭染色項目室間質(zhì)評結(jié)果進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 準備潔凈、干燥玻片備用，配制一定濃度生長期為對數(shù)期的細菌；取5 μL標本在玻片偏右側(cè)中央涂抹一橢圓形菌膜，自然干燥；紫外燈照射30 min；酒精燈火焰上方固定；貼標本標簽，將貼好的玻片放入標本盒中，標本盒外貼上項目標簽，并用膠布封住盒口。于室溫下避光干燥保存[1]。

1.2質(zhì)評方法 室間質(zhì)評標本發(fā)放由重慶市臨床檢驗中心統(tǒng)一發(fā)放，每年發(fā)放2次室間質(zhì)評標本，每次5個標本。實驗室在收到信息后按照通知立即檢測或放置室溫保存，在規(guī)定日期前檢測和上報。檢測時按照實驗室臨床標本處理流程進行。

1.3評價方法 依據(jù)2018能力驗證結(jié)果的統(tǒng)計處理和能力評價指南：CNAS-GL002[2]，統(tǒng)計參評實驗室對質(zhì)評標本的測定結(jié)果與預期結(jié)果的符合程度。參照臨床檢驗室間質(zhì)量評價：WS/T644-2018[3]對于定性測定能力評價要求參評實驗室對質(zhì)評標本的測定結(jié)果與預期結(jié)果的符合程度，根據(jù)符合率來判斷參評實驗室的能力是否合格。對每一個檢測項目的評價：本次某項目測定得分=某項目測定結(jié)果可接受標本數(shù)/某項目標本總數(shù)×100。對于所有檢測項目的評價：本次所有項目測定得分=所有項目測定結(jié)果可接受標本數(shù)/標本總數(shù)×100。得分≥80分為合格。

2 結(jié) 果

2.1參加細菌學涂片革蘭染色并上報數(shù)據(jù)實驗室數(shù)及合格率 細菌學涂片革蘭染色項目室間質(zhì)評的醫(yī)院數(shù)從2016年的52家增加至2019年的105家，合格率從2016年的84.6%增加到2019年的93.3%。見表1。

表1 2016-2019年參加細菌學涂片并上報數(shù)據(jù)實驗室數(shù)和合格率

2.2參加細菌學涂片革蘭染色實驗室構(gòu)成及合格率 2016-2019年參加細菌學涂片的實驗室主要是綜合性二、三級醫(yī)院和中醫(yī)院實驗室，民營醫(yī)院實驗室和獨立實驗室也逐步加入，合格率整體呈上升趨勢。見表2。

2.32016-2019年涂片革蘭染色鏡檢結(jié)果 2016-2019年涂片革蘭染色鏡檢總體結(jié)果：革蘭陽性球菌合格率為98.9%，革蘭陰性桿菌合格率為95.0%，未發(fā)現(xiàn)細菌、真菌的革蘭陰性球菌合格率為94.7%，革蘭陽性桿菌合格率為94.8%，真菌合格率為95.0%，未發(fā)現(xiàn)細菌、真菌的陰性標本合格率稍低，為87.8%。2016-2019年涂片革蘭染色鏡檢結(jié)果見表3。

2.4涂片革蘭染色儀器使用情況 使用全自動染片儀的實驗室占6.7%，手工染色仍是主力，占93.3%。

表2 2016-2019年參加細菌學涂片實驗室構(gòu)成和合格率

續(xù)表3 2016-2019年涂片革蘭染色鏡檢結(jié)果

3 討 論

世界衛(wèi)生組織(WHO)對臨床微生物實驗室提出的指導性方針之一是鏡檢對建立快速的初步診斷具有很大價值。即便在高通量測序、基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜及PCR技術等手段發(fā)展的當前，細菌涂片仍不可取代[4]。微生物檢驗一定要堅持原始標本的直接涂片，注意導致感染的病原菌和人體免疫反應間的相關性[5-7]。革蘭染色監(jiān)測不僅是實驗室必不可少的質(zhì)量控制工具，而且對于建立跨實驗室的質(zhì)量控制非常必要[8]。全國各醫(yī)院檢驗科ISO 15189認可實驗室評審和各級醫(yī)院評審均對細菌學涂片提出要進行實驗室間比對等要求。

隨著實驗室規(guī)范化建設的進展，質(zhì)控意識日益增強，重慶市各級醫(yī)學實驗室積極參加，由2016年最初的52家增加到2019年的105家，綜合三級醫(yī)院實驗室由20家增加到30家，綜合二級醫(yī)院實驗室由22家增加到41家，中醫(yī)院實驗室由8家增加到18家，婦幼保健院實驗室由1家增加到7家，民營醫(yī)院由0家增加到5家。經(jīng)過8次項目開展，實驗室合格率逐年升高，由2016年的84.6%提升到2019年的93.3%，細菌形態(tài)學鏡檢正確率明顯提高。在一項新德里印度醫(yī)學微生物學協(xié)會舉辦的室間質(zhì)評活動中，革蘭染色正確率分別為29.6%～79.9%，77.0%的參與實驗室在測試中總分>80%[9]，較重慶市的正確率低，究其原因為其發(fā)放的是臨床標本，重慶市發(fā)放的是培養(yǎng)物模擬標本。西非布基納法索舉辦的室間質(zhì)評活動中，革蘭染色正確率為87.0%[10]。GUARNER等[11]報道了由參考微生物學實驗室從培養(yǎng)物制備的5個標本，革蘭染色正確率為73%～96%。

隨著項目的開展，筆者發(fā)現(xiàn)了一些問題，也針對問題進行強化，同時也加大形態(tài)學檢驗難度。2016年165223號標本為肺炎克雷伯菌模擬血培養(yǎng)制備的涂片，鏡下為革蘭陰性桿菌，單個或成對排列，因為肺炎克雷伯菌在血培養(yǎng)瓶里營養(yǎng)豐富，生長良好，形態(tài)比固體培養(yǎng)基上要圓，80.0%實驗室報告正確，部分實驗室報告為革蘭陰性球菌。隨著侵襲性真菌在臨床檢測的重要性越來越高，筆者對2017年201715號標本進行絲狀真菌的染色鏡檢，鏡下為絲狀真菌菌絲，但有20家實驗室未觀察到真菌菌絲。因為絲狀真菌菌絲較大，染色鏡檢需低倍鏡瀏覽全片，待找到視野后再用油鏡觀察，若直接油鏡觀察會造成絲狀真菌漏檢。為了降低對絲狀真菌的漏檢，2019年又進行了此類標本發(fā)放，201915號標本鏡下為曲霉菌絲，此次有7家實驗室漏檢，正確率由73.2%逐步提高到91.3%。2018年201812號標本是第1次發(fā)放的陰性標本，正確結(jié)果為未發(fā)現(xiàn)細菌、真菌。但有16家實驗室報告發(fā)現(xiàn)了細菌，可能把染料殘渣看成了細菌，需要加強實驗室革蘭染色的室內(nèi)質(zhì)控，減少錯誤的判斷。筆者針對出現(xiàn)的問題進行分析，細菌形態(tài)學鏡檢正確率逐步提高。

革蘭染色顯微鏡鏡檢對染色過程和顯微鏡鏡檢均有要求。目前，重慶市實驗室革蘭染色使用染片儀有7家，絕大多數(shù)是手工染色。而手工染色更需要做好室內(nèi)質(zhì)控，保證試劑的有效和操作過程的正確。顯微鏡鏡檢與一般檢測不同，要求人員具有豐富的形態(tài)學檢驗工作經(jīng)驗，具備一定的臨床知識和綜合分析能力。在實際工作中，由于標本性質(zhì)、細菌本身對染液的親和力及細菌受到藥物影響后形態(tài)的變異等因素，往往給細菌的識別帶來很大的困難，這需要依靠開展培訓和不斷實踐來提高。

綜上所述，開展細菌學涂片革蘭染色項目可以檢驗實驗室結(jié)果準確性，及時發(fā)現(xiàn)實驗室存在問題，并針對出現(xiàn)的問題進行總結(jié)，從而為臨床診療提供快速、可靠的微生物形態(tài)學鏡檢結(jié)果。