田艷杰,宋兆祥,馬振武,王朝陽,徐 佳,周晨妍(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南省合成生物學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室,河南新鄉(xiāng) 453003)

自然界中的可再生資源來源廣泛,含量豐富,種類多樣,木聚糖在可再生資源中歸屬于半纖維素,而半纖維素在可再生資源中僅次于纖維素,位居第二。木聚糖是異質(zhì)多糖,存在于植物細(xì)胞壁中[1-3],其結(jié)構(gòu)復(fù)雜,是一種多聚五碳糖,因此利用木聚糖首先需要將其降解為低聚木糖或者小分子的單糖形式,而這些能夠降解木聚糖的酶則被稱為木聚糖酶。木聚糖酶的種類很多,對(duì)木聚糖的降解發(fā)揮不同的作用,其中有一種酶能將木聚糖的主鏈結(jié)構(gòu)降解,這種酶被稱為β-1,4-內(nèi)切-D-木聚糖酶(endo-β-1,4-D-xylanase)[EC3.2.1.8][4-6]。目前,木聚糖酶主要被運(yùn)用于包括工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品以及飼料加工等多種領(lǐng)域,但是國(guó)內(nèi)木聚糖酶的產(chǎn)量還不夠高,木聚糖酶的價(jià)格還比較高昂,因此采用多種手段提高木聚糖酶產(chǎn)量,顯得尤為重要[7-9]。

微生物來源的木聚糖酶種類繁多,應(yīng)用廣泛,其主要利用細(xì)菌和真菌的發(fā)酵生產(chǎn),因此構(gòu)建產(chǎn)木聚糖酶工程菌有望使木聚糖酶在工業(yè)生產(chǎn)中有更廣泛的應(yīng)用。在構(gòu)建木聚糖酶工程菌的研究中,大多以大腸桿菌和畢赤酵母為宿主菌,但大腸桿菌和畢赤酵母的次級(jí)代謝產(chǎn)物均不能用于食品工業(yè)[10]。枯草芽孢桿菌具有生長(zhǎng)速度較快,對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較低,對(duì)農(nóng)作物安全,人畜無害,對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),屬于食品級(jí)安全微生物[11-12],并且枯草芽孢桿菌有完善的分泌系統(tǒng),可以分泌胞外酶。由于枯草芽孢桿菌的多種優(yōu)點(diǎn),近些年,很多研究者將其作為模式生物運(yùn)用到生物研究中[13-15]。向亞萍等[16]將耐熱木聚糖酶基因xynB與質(zhì)粒載體pXYNB2連接,構(gòu)建重組載體并將其導(dǎo)入枯草芽孢桿菌Bs916中,獲得重組工程菌Bs916/pXYNB2,該工程菌能分泌表達(dá)極耐熱的木聚糖酶。Gimenez等[17]從Bacillusfirmusstrain 37中克隆得到環(huán)糖苷葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(CGTase)基因,以pWB980作為載體,將其轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌WB800中,獲得重組工程菌。Wang等[18]構(gòu)建新型鏈霉菌胰蛋白酶GM2938重組質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌SCK6,獲得GM2938的異源表達(dá)。Song等[19]將支鏈淀粉酶基因PUL在啟動(dòng)子PHpall作用下通過穿梭載體pMA0911在枯草芽孢桿菌WB800中表達(dá)。Chen等[20]將從解淀粉芽孢桿菌中獲得的α-淀粉酶基因amy1通過載體pP43X異源表達(dá)獲得WB800重組菌,得到的重組菌比野生菌產(chǎn)α-淀粉酶能力提高1.4倍。通過國(guó)內(nèi)外研究可以看出枯草芽孢桿菌作為宿主菌能夠獲得表達(dá)目的基因的重組工程菌,但是對(duì)枯草芽孢桿菌作為宿主菌的研究較大腸桿菌和畢赤酵母少,因此本研究利用枯草芽孢桿菌作為宿主,探索表達(dá)木聚糖酶基因的新方法。

本研究利用枯草芽孢桿菌WB600作為宿主菌,以期獲得能夠穩(wěn)定產(chǎn)生木聚糖酶的枯草芽孢桿菌重組工程菌?？莶菅挎邨U菌作為微生物研究中的模式生物,是一種可以分泌胞外酶的菌株,屬于食品級(jí)安全微生物,將實(shí)驗(yàn)室獲得的木聚糖酶基因xynZF-318通過與高表達(dá)載體pWB980相連,并將其電擊轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌WB600中,獲得枯草芽孢桿菌重組工程菌,并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化有利于木聚糖酶在工業(yè)中的獲取與應(yīng)用。本研究有望為木聚糖酶的工業(yè)應(yīng)用尤其是食品工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)WB600、pWB980表達(dá)載體 北京天恩澤生物科技有限公司;質(zhì)粒pET28a-xynZF-318 作者所在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建;DNA 質(zhì)粒小量抽提試劑盒、卡那霉素(Kan)、DNA 膠回收試劑盒 上海生工生物工程有限公司;DNA聚合酶、T4DNA Ligase和限制性內(nèi)切酶等 TaKaRa公司;DNA Marker MBI公司;蛋白質(zhì)標(biāo)椎分子量 索萊寶生物科技有限公司;樺木木聚糖 Sigma 公司;蛋白胨、酵母提取物 賽默飛世爾科技公司;瓊脂粉 北京奧博星生物科技有限公司;其余生化試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

C1000梯度PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)Bio-Rad公司;振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;DYY-2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠;DC-0506fE溫恒槽 上海比朗儀器有限公司;HZQ-F160A恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Neofuge 23R高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)作者所在實(shí)驗(yàn)室從黑曲霉中克隆獲得的木聚糖酶xynZF-318基因序列(Genbank:JQ700383)及pWB980高表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn),設(shè)計(jì)出兩條引物:

xyn318-KCF:5′-CCCAAGCTTTTAATCCCGT CTTCCCCGGCT-3′(HindⅢ酶切位點(diǎn))

xyn318-KCR:5′-ACGCGTCGACCTACGATAAA GTCCTCC-3′(SalI酶切位點(diǎn)),由金唯智生物公司負(fù)責(zé)合成。

1.2.2 目的基因xynZF-318表達(dá)載體構(gòu)建 將上下游引物xyn318-KCF和xyn318-KCR以重組質(zhì)粒pET28a-xynZF-318為模板,進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。其擴(kuò)增條件[21]:先預(yù)變性,條件為94 ℃,2 min;然后進(jìn)行變性,條件為94 ℃,30 s;退火,條件為52 ℃,45 s;延伸,條件為72 ℃,1 min;該過程進(jìn)行35個(gè)循環(huán),之后再延伸,條件為72 ℃,10 min。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,對(duì)目的條帶割膠回收,將回收后的產(chǎn)物和pWB980質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和SalⅠ,在37 ℃條件下進(jìn)行雙酶切反應(yīng),并將雙酶切反應(yīng)后的pWB980表達(dá)載體和目的基因分別用膠回收試劑盒進(jìn)行割膠回收,然后用T4DNA Ligase在16 ℃條件下過夜連接。將連接后的pWB980/xynZF-318轉(zhuǎn)入WB600感受態(tài)細(xì)胞中,獲得轉(zhuǎn)化子,該過程通過電轉(zhuǎn)儀用電擊轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行,電擊轉(zhuǎn)化的條件:2.5 ms,1.5 kV。轉(zhuǎn)化子經(jīng)Kan抗性平板篩選后獲得重組菌WB600/pWB980/xynZF-318。(本實(shí)驗(yàn)所加Kan抗性的終濃度為100 μg/mL)。

1.2.3 重組木聚糖酶陽性克隆子驗(yàn)證 提取工程菌WB600/pWB980/xynZF-318質(zhì)粒,并將其作為模板,Xyn318-KCF和Xyn318-KCR作為上下游引物,對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

1.2.4 重組木聚糖酶陽性克隆子篩選 將陽性克隆子接種于LB小試管中,過夜培養(yǎng),并取少量種子液接種于木聚糖固體平板上,37 ℃培養(yǎng)3～5 d,將其用剛果紅溶液染色1 h,用1 mol/L NaOH溶液脫色,觀察培養(yǎng)基產(chǎn)生透明圈情況。

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè) 將工程菌WB600/pWB980/xynZF-318種子液轉(zhuǎn)入30 mL/250 mL的LB錐形瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)6 d后,將酶液收集,5000 r/min離心20 min,取其上清,在-20 ℃凍存后,利用冷凍真空干燥機(jī)進(jìn)行干燥,使上清濃縮至1 mL,濃縮后的蛋白樣品通過SDS-PAGE電泳后,用考馬斯R-250染色,脫色后檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6 木聚糖酶活力測(cè)定 采用DNS法,即3,5-dinitrosalicylic acid測(cè)定木聚糖酶活力[22]。以1 min產(chǎn)生1 μmol的還原性木糖所需要的酶量作為一個(gè)酶活力單位,即U/ml。

1.2.7 重組木聚糖酶搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化 對(duì)枯草芽孢桿菌重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318進(jìn)行搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化。以培養(yǎng)溫度37 ℃、接種量1%、裝液量30 mL、種齡10 h、轉(zhuǎn)速220 r/min、發(fā)酵時(shí)間120 h為基礎(chǔ)培養(yǎng)條件,首先采用單因素的方法優(yōu)化重組菌產(chǎn)酶條件。依次對(duì)菌種的接種量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、250 mL錐形瓶的裝液量(25、30、40、50、60、70 mL)、菌種的種齡(10、12、14、16、18 h)、培養(yǎng)溫度(30、32、35、37、39 ℃)、搖床轉(zhuǎn)速(120、140、160、180 r/min)以及發(fā)酵時(shí)間(48、72、96、120、144、168、192 h)進(jìn)行優(yōu)化,每次均以獲取的最佳條件作為定量值,以所要優(yōu)化的單因素條件作為變量,獲得單因素優(yōu)化的最適條件。

在單因素優(yōu)化最佳結(jié)果的基礎(chǔ)上,以接種量(%)、裝液量(mL)和種齡(h)為自變量,以酶活力(U/mL)為響應(yīng)值,對(duì)枯草芽孢桿菌重組工程菌進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[23-24],確定其搖瓶的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Experimental factors and levels

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn),使用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)影響酶活力表達(dá)量的各項(xiàng)組合實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組工程菌的構(gòu)建

按1.2.2方法PCR擴(kuò)增的目的條帶位置如圖1所示。然后將其割膠回收,與高表達(dá)載體pWB980一起雙酶切,條帶如圖2所示。酶切產(chǎn)物連接液經(jīng)電轉(zhuǎn)儀電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細(xì)胞,用含有Kan抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子,獲得枯草芽孢桿菌重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318。

圖1 基因xynZF-318的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of xynZF-318 gene注：M：DNA Marker；1：PCR擴(kuò)增得到的xynZF-318。

圖2 pWB980質(zhì)粒與xynZF-318基因雙酶切Fig.2 Double digestion of pWB980 vector and xynZF-318注：M：DNA Marker； 1、2、3：質(zhì)粒pWB980；4、5：基因xynZF-318片段。

2.2 重組工程菌基因表達(dá)驗(yàn)證

重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318質(zhì)粒提取如圖3所示。以從工程菌中提取的質(zhì)粒為模板,Xyn318-KCF和Xyn318-KCR作為上下游引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得條帶如圖4所示。圖3、圖4說明重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318基因構(gòu)建成功。

圖3 重組質(zhì)粒提取Fig.3 Extraction of the recombinant plasmid注：1：pWB980質(zhì)粒；2：pWB980/xynZF-318。

圖4 基因xynZF-318的PCR擴(kuò)增驗(yàn)證Fig.4 PCR validation of xynZF-318 gene注：M：DNA Marker；1：PCR擴(kuò)增得到的xynZF-318。

2.3 重組工程菌陽性克隆子篩選

重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318經(jīng)木聚糖固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d之后,用剛果紅溶液染色,由圖5可知,WB600/pWB980/xynZF-318菌落經(jīng)剛果紅染色時(shí),出現(xiàn)明顯透明圈,而同步培養(yǎng)的WB600菌落則沒有出現(xiàn),說明該重組工程菌能產(chǎn)生木聚糖酶。

圖5 剛果紅染色篩選重組工程菌Fig.5 Congo red staining for screening recombinant engineering bacteria注：1：WB600/pWB980/xynZF-318菌落；2：WB600菌落。

2.4 SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)

通過SDS-PAGE凝膠電泳圖片觀察XynZF-318目的基因條帶,由圖6可知,在33 kDa處有明顯的條帶,該條帶位置與XynZF-318的蛋白分子質(zhì)量相同[25]。

圖6 重組XynZF-318的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of XynZF-318注：M: Pageruler prestained protein ladder；1:WB600蛋白條帶；2:WB600/xynZF-318條帶。

2.5 重組菌木聚糖酶活力測(cè)定

由表2可知,本研究成功獲得產(chǎn)木聚糖酶枯草芽孢桿菌重組工程菌,重組菌粗酶液酶活力較野生菌WB600提高了1.91倍。粗酶液測(cè)定時(shí)重組菌WB600/pWB980/xynZF-318的顏色比WB600 粗酶液的顏色明顯加深,說明重組菌的木聚糖酶表達(dá)較好。

表2 重組菌酶活測(cè)定Table 2 Enzyme activity determination of recombinant bacteria

2.6 重組菌WB600/pWB980/xynZF-318搖瓶發(fā)酵工藝研究

2.6.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318進(jìn)行單因素發(fā)酵條件優(yōu)化,獲得最適條件如圖7所示。圖7a所示,接種量為1.5%時(shí)相對(duì)酶活力最高,當(dāng)接種量小于1.5%時(shí),重組菌的相對(duì)酶活力僅為最高酶活力的40%,當(dāng)接種量大于1.5%時(shí),相對(duì)酶活力呈遞減趨勢(shì)。圖7b所示,裝液量為30 mL時(shí)相對(duì)酶活力最高,隨著裝液量的逐漸增加,菌體的溶氧量逐漸減少,因此產(chǎn)酶活力呈下降趨勢(shì)。圖7c所示,種齡為12 h 時(shí)相對(duì)酶活力最高,當(dāng)種齡小于12 h時(shí)相對(duì)酶活力增加較快,當(dāng)種齡大于12 h時(shí),其相對(duì)酶活力逐漸減少但減少幅度較小,說明種齡增加對(duì)重組菌產(chǎn)酶活力影響較小。圖7d所示,培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí),相對(duì)酶活力最高,當(dāng)溫度低于37 ℃時(shí),重組菌的相對(duì)酶活力較低,說明溫度低于37 ℃時(shí)重組菌幾乎沒有酶活力。圖7e所示,轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)相對(duì)酶活力最高,當(dāng)轉(zhuǎn)速小于或大于160 r/min時(shí),相對(duì)酶活力均下降,但總體下降趨勢(shì)較小,說明轉(zhuǎn)速對(duì)重組菌產(chǎn)酶影響不大。圖7f所示,最佳發(fā)酵時(shí)間為168 h,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),重組菌酶活力逐漸增加,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為168 h時(shí)酶活力達(dá)到最大。

圖7 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Single factors experiments results

2.6.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 在前期單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)搖瓶發(fā)酵單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)可以確定,重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318的最佳的搖瓶發(fā)酵條件為:接種量1.5%;裝液量30 mL;種齡12 h;轉(zhuǎn)速160 r/min;培養(yǎng)溫度37 ℃;發(fā)酵時(shí)間168 h。根據(jù)單因素?cái)?shù)據(jù)分析,培養(yǎng)溫度較低時(shí)重組菌幾乎沒有酶活力,而轉(zhuǎn)速對(duì)酶活力的影響較小,本研究以接種量、裝液量、種齡為自變量設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表,進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)操作,以木聚糖酶活力作為該實(shí)驗(yàn)因變量,對(duì)該工程菌進(jìn)行測(cè)定,如表3所示。運(yùn)用Design Expert 8.0進(jìn)行分析,如圖8所示,對(duì)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,通過最小二乘法回歸方程式分析得到枯草芽孢桿菌重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318產(chǎn)木聚糖酶活力R與接種量A、裝液量B、種齡C的二次多項(xiàng)回歸模型:酶活力(R)=0.24-0.01A-0.091B-0.01C+0.007AB+0.01AC+0.007BC-0.018A2+0.045B2-0.006C2。對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析,由表4可知,模型的P<0.01,說明該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著;失擬項(xiàng)不顯著(P=0.1262>0.05),決定系數(shù)R2=96.02%,說明該回歸方程的擬合度良好,該模型成立。方程的一次項(xiàng)中B(P<0.0001)極顯著,說明裝液量對(duì)工程菌產(chǎn)酶活力影響極顯著,根據(jù)F值大小可以判斷本實(shí)驗(yàn)所采用的3個(gè)因素對(duì)工程菌產(chǎn)酶活力影響的主次順序?yàn)锽(裝液量)>A(接種量)>C(種齡);二次項(xiàng)B2極顯著(P<0.01)。

表3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of response surface analysis

圖8 兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagram of the inflnence of the interaction of two factors on the response value

表4 響應(yīng)面模型方差分析Table 4 Variance analysis of response surface model

由圖8可知,A、B、C三個(gè)影響因素對(duì)酶活力的影響均不同,根據(jù)二次多項(xiàng)回歸方程、單因素優(yōu)化結(jié)果可以得出預(yù)測(cè)最優(yōu)水平:接種量:1.23%、裝液量:20.05 mL、種齡:10.93 h培養(yǎng)溫度為37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min、發(fā)酵時(shí)間為168 h,在此條件下重組菌酶活力預(yù)測(cè)值可達(dá)0.382 U/mL,由于實(shí)際操作可行性選取最優(yōu)的發(fā)酵條件為:接種量為1.2%、裝液量為20 mL、種齡為11 h、培養(yǎng)溫度為37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min、發(fā)酵時(shí)間為168 h。經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后,得到實(shí)際酶活力為0.359 U/mL,比預(yù)測(cè)值(0.382 U/mL)小6.0%,說明此回歸方程較好地反應(yīng)了實(shí)際情況。但是本研究與向亞萍等[16]研究相比也存在表達(dá)過程中質(zhì)?？截悢?shù)較低,以及酶穩(wěn)定性較差等問題,針對(duì)現(xiàn)存的問題,作者后續(xù)將積極尋找解決方案。

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建枯草芽孢桿菌重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318,該工程菌能有效產(chǎn)生木聚糖酶。由單因素和響應(yīng)面結(jié)果分析最優(yōu)的發(fā)酵條件為:接種量1.2%、裝液量20 mL、種齡11 h、培養(yǎng)溫度37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵時(shí)間168 h。經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后,得到實(shí)際酶活力為0.359 U/mL。本研究成功獲得產(chǎn)木聚糖酶枯草芽孢桿菌重組工程菌,菌株的產(chǎn)酶活力較野生菌WB600(0.098 U/mL)提高了2.66倍。

本研究成功獲得產(chǎn)木聚糖酶枯草芽孢桿菌重組工程菌,菌株的產(chǎn)酶活力較野生菌有明顯提高,并且枯草芽孢桿菌能直接將木聚糖酶分泌到胞外,有利于木聚糖酶的分離與提取,為木聚糖酶在枯草芽孢桿菌宿主菌中獲得表達(dá)提供思路,有望為木聚糖酶的工業(yè)應(yīng)用尤其是食品工業(yè)應(yīng)用拓寬道路。