歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)及其有效成分的測(cè)定

李文杰 宮 惠 李美陽(yáng)

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

歐洲纈草(ValerianaofficinalisL.)屬于敗醬科(Valerianaceae)纈草屬(Valeriana)多年生草本植物，以根和根莖入藥[1]，具有鎮(zhèn)靜安神、解痙止痛的功效，多用于治療神經(jīng)衰弱、失眠、癲癇等病癥[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，纈草三酯類(環(huán)烯醚萜酯類)成分是纈草鎮(zhèn)靜止痛的主要活性成分[3]，同時(shí)還具有抗腫瘤、抗氧化和舒張血管活性的作用[4]。近年來，人們對(duì)纈草提取物及其制劑的需求日益增加，纈草活性成分的開發(fā)前景十分廣闊。但該屬植物自然生長(zhǎng)十分緩慢，野生資源急劇下降，人工栽培緩慢，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的遺傳穩(wěn)定性難以保持[5]。另外，纈草活性成分含量很低，提取成本高，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成尚不成功[6]，極大限制了其市場(chǎng)開發(fā)與應(yīng)用。因此，解決纈草三酯類活性化合物的藥源問題十分必要。

國(guó)內(nèi)外研究表明，許多物種的不定根可以穩(wěn)定合成次生代謝物質(zhì)，且已在何首烏[5]等藥用植物中成功應(yīng)用。纈草三酯類有效成分主要存在于纈草根和根莖中，因此，采用組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合誘導(dǎo)調(diào)控手段大量繁殖纈草不定根，獲得大量有效成分，是解決纈草資源開發(fā)和纈草提取物及其制劑供應(yīng)不足等問題的有效手段。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后開展了纈草有效成分分析和組織培養(yǎng)方面的研究，但大多集中于纈草屬某品種的成分分析或纈草愈傷組織誘導(dǎo)和組培快繁類研究[7]，對(duì)纈草不定根培養(yǎng)的研究很少，需要纈草不定根培養(yǎng)和有效成分測(cè)定方面的研究。

前期已經(jīng)篩選得到不定根懸浮培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基為根培養(yǎng)基(root culture medium, RCM)以及理想生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度為0.5 mg·L-1萘乙酸(1-Naph thalene acetic acid, NAA)[8]。在此基礎(chǔ)上，本研究以歐洲纈草不定根為試驗(yàn)材料，進(jìn)一步分析pH值、碳源種類、糖濃度、鹽濃度、總氮(N)濃度、總磷(P)濃度等因素對(duì)不定根懸浮培養(yǎng)的影響，確定不定根懸浮培養(yǎng)條件，同時(shí)考察此條件下不定根的生長(zhǎng)情況以及正常不定根、褐化不定根和無菌苗根中纈草三酯、乙酰纈草三酯、纈草烯酸等成分的含量，以期為纈草有效成分的規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

歐洲纈草種子購(gòu)自美國(guó)猶他州立大學(xué)農(nóng)學(xué)院，其開花植株經(jīng)延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院全雪麗教授鑒定為敗醬科纈草屬歐洲纈草(V.officinalis)。懸浮培養(yǎng)試驗(yàn)材料為RCM+0.5 mg·L-1NAA培養(yǎng)液中多次懸浮繼代培養(yǎng)的不定根，不定根由歐洲纈草種子繁殖的無菌苗莖段誘導(dǎo)而來；有效成分含量測(cè)定的試驗(yàn)材料為經(jīng)低溫干燥的歐洲纈草正常不定根(培養(yǎng)28 d的不定根)、褐化不定根(培養(yǎng)70 d未繼代的不定根)和培養(yǎng)2個(gè)月的無菌苗根。

RCM培養(yǎng)基由實(shí)驗(yàn)室配制(見附表1)；纈草三酯標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：wkq19012404，純度≥98%)購(gòu)自四川維克奇生物；乙酰纈草三酯標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：wkq19012505，純度≥98%)購(gòu)自四川維克奇生物；纈草烯酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：Z12J10H78323，純度≥98%)購(gòu)自上海源葉生物；乙腈(色譜純)和甲醇(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Fisher公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；THZ-300恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Centrifuge 5804R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司；JYD-650L超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，上海之信儀器有限公司；KQ-300VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；PURELAB claffic 超純水器，英國(guó)埃爾格公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 pH值對(duì)歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的影響 以RCM為基本培養(yǎng)基，設(shè)置4種不同pH值，分別為4.5、5.0、5.7、6.5，并制作培養(yǎng)液(不加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)。每個(gè)50 mL三角瓶中加入30 mL培養(yǎng)液，121℃高溫高壓滅菌15 min備用。選取粗細(xì)均勻的不定根，將其從根尖部位切取1 cm，接種到含有配制好培養(yǎng)液的三角瓶中，每種處理設(shè)10次重復(fù)。接種前后稱量培養(yǎng)基總重量，計(jì)算接種量，接種后移至100 r·min-1搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2℃，暗培養(yǎng)30 d后收獲。收獲后分別稱量不定根的鮮重和干重，并計(jì)算干物率和增殖倍數(shù)：

接種量(g·L-1)=接種后培養(yǎng)基總重量-接種前培養(yǎng)基總重量

(1)

干物率=收獲干重/收獲鮮重×100%

(2)

(3)

收獲量：將培養(yǎng)的不定根取出，用濾紙吸干水分，置于分析天平稱重，即為收獲量。

1.3.2 碳源種類對(duì)歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的影響 在1.3.1試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，用果糖、麥芽糖、葡萄糖、半乳糖4種碳源分別取代蔗糖，添加量均為30 g·L-1，配制培養(yǎng)液，滅菌后備用。其他操作同1.3.1。

1.3.3 蔗糖濃度對(duì)歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的影響 在1.3.2試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，分別配制10、20、30、40、50、60 g·L-16種蔗糖濃度的培養(yǎng)液，滅菌后備用。其他操作同1.3.1。

1.3.4 鹽濃度培養(yǎng)對(duì)歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的影響 在1.3.3試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，設(shè)1/2X、3/4X、X、2X、3X(設(shè)原RCM大量元素的鹽濃度為X)5種鹽濃度，配制培養(yǎng)液，滅菌后備用。其他操作同1.3.1。

1.3.5 總N濃度對(duì)歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的影響 在1.3.4試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)0、16.15、32.31、48.46、64.61、96.93 mmol·L-16種總N濃度，配制培養(yǎng)液，滅菌后備用。其他操作同1.3.1。

1.3.6 總P濃度對(duì)歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的影響 在1.3.5試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，設(shè)0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mmol·L-17種總P濃度，配制培養(yǎng)液，滅菌后備用。其他操作同1.3.1。

1.3.7 懸浮培養(yǎng)條件下歐洲纈草不定根的生長(zhǎng)情況 以RCM為基本培養(yǎng)基，將上述篩選所得最優(yōu)培養(yǎng)條件綜合，并添加0.5 mg·L-1NAA，配制培養(yǎng)液，滅菌后備用。選取粗細(xì)均勻的不定根，接種于三角瓶中，保證每瓶接種量相同，每個(gè)處理設(shè)30次重復(fù)。接種后移至搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，培養(yǎng)溫度為25±2℃，暗培養(yǎng)，每隔7 d取樣一次，每次取樣5瓶。參照1.3.1測(cè)定收獲不定根的鮮重作為生物量，并繪制不定根的生長(zhǎng)曲線。

1.3.8 歐洲纈草不定根中有效成分的測(cè)定 供試品溶液制備：低溫干燥的歐洲纈草藥材粉碎過60目篩，分別稱量1.00 g正常不定根、0.23 g褐化不定根、0.27 g 2個(gè)月無菌苗根，然后依次加入25、10、10 mL甲醇，稱重后，分別超聲(500 W，25 kHz)處理40 min，再稱重，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻后離心20 min，保留上層清液。上層清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，作為供試品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：稱取20 mg纈草三酯標(biāo)準(zhǔn)品、10 mg纈草烯酸，分別加入80 mL甲醇制成濃度為0.250、0.125 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；稱取3 mg乙酰纈草三酯，加入20 mL甲醇，制成濃度為0.150 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

有效成分測(cè)定參考侯文慧等[9]的方法，并根據(jù)實(shí)際情況略作修改。

色譜條件：Agilent ZRBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫公司)；流動(dòng)相為乙腈-水(8∶2)，等度洗脫20 min，流速1 mL·min-1，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用WPS 2019整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)pH值的篩選

由表1可知，隨著pH值的升高，歐洲纈草不定根收獲鮮重先升高后降低，當(dāng)pH值為5.7時(shí)，歐洲纈草不定根生長(zhǎng)最旺盛，收獲鮮重達(dá)1.88 g·L-1，增殖倍數(shù)為7.91，收獲干重為0.27 g·L-1，干物率為14.31%，且其收獲鮮重、干重顯著高于其他pH值，說明適宜歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的pH值為5.7。

表1 懸浮培養(yǎng)下pH值對(duì)歐洲纈草不定根生長(zhǎng)的影響Table 1 Effect of pH on adventitious roots growth of V. officinalis under suspension culture

2.2 歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)碳源的篩選

由表2可知，碳源為蔗糖時(shí)，歐洲纈草不定根生長(zhǎng)最旺盛，收獲鮮重為4.32 g·L-1，收獲干重為0.89 g·L-1， 增殖倍數(shù)為12.64，干物率為19.00%，均顯著高于其他碳源。此外，以果糖和半乳糖為碳源的懸浮液中歐洲纈草不定根幾乎不生長(zhǎng)。綜合分析，蔗糖是歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的適宜碳源。

表2 懸浮培養(yǎng)下碳源對(duì)歐洲纈草不定根生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of carbon sources on adventitious roots growth of V. officinalis under suspension culture

2.3 歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)糖濃度的篩選

由表3可知，隨著蔗糖濃度的增加，歐洲纈草不定根的收獲鮮重先增加后減少，當(dāng)蔗糖濃度為40 g·L-1時(shí)，不定根生長(zhǎng)最旺盛，收獲鮮重為7.68 g·L-1，收獲干重為1.73 g·L-1，增殖倍數(shù)為26.72，干物率為22.69%，除干物率外，其他指標(biāo)均顯著高于其他蔗糖濃度。蔗糖濃度為50、60 g·L-1時(shí)，歐洲纈草不定根生長(zhǎng)次之。因此，歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的適宜蔗糖濃度為40 g·L-1。

表3 懸浮培養(yǎng)下蔗糖濃度對(duì)歐洲纈草不定根生長(zhǎng)的影響Table 3 Effect of sucrose concentration on adventitious roots growth of V. officinalis under suspension culture

2.4 歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)鹽濃度的篩選

由表4可知，隨著鹽濃度的增加，歐洲纈草不定根的鮮重呈先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)鹽濃度為2X時(shí)，歐洲纈草不定根生長(zhǎng)最旺盛，收獲鮮重為1.92 g·L-1， 收獲干重為0.30 g·L-1，增殖倍數(shù)為7.39，干物率為15.64%，其中收獲鮮重與干重均顯著高于其他鹽濃度。鹽濃度為X時(shí)，歐洲纈草不定根生長(zhǎng)次之。因此，歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的適宜鹽濃度為2倍RCM基礎(chǔ)大量元素。

表4 懸浮培養(yǎng)下鹽濃度對(duì)歐洲纈草不定根生長(zhǎng)的影響Table 4 Effect of salt concentration on adventitious roots growth of V. officinalis under suspension culture

2.5 歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)總N濃度的篩選

由表5可知，隨著總N濃度的增加，歐洲纈草不定根的鮮重呈先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)總N濃度為48.46 mmol·L-1時(shí)，歐洲纈草不定根生長(zhǎng)最旺盛，收獲鮮重為7.68 g·L-1，收獲干重為0.49 g·L-1，增殖倍數(shù)為7.52，干物率為22.03%，各指標(biāo)顯著高于其他總N濃度組。因此，適宜歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的總N濃度為48.46 mmol·L-1。

2.6 歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)總P濃度的篩選

不定根在不同總P濃度的培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)30 d后(表6)，隨著總P濃度的增加，不定根的鮮重先增加后降低，在總P濃度為1.5 mmol·L-1時(shí)，不定根生長(zhǎng)最旺盛，收獲鮮重為4.76 g·L-1， 收獲干重為0.89 g·L-1， 增殖倍數(shù)為18.37，干物率為18.74%，除干物率外，其他指標(biāo)物均顯著高于其他處理。因此，適于歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的總P濃度為1.5 mmol·L-1。

表5 懸浮培養(yǎng)下總N濃度對(duì)歐洲纈草不定根生長(zhǎng)的影響Table 5 Effect of total N concentration on adventitious roots growth of V. officinalis under suspension culture

表6 懸浮培養(yǎng)下總P濃度對(duì)歐洲纈草不定根生長(zhǎng)的影響Table 6 Effect of total P concentration on adventitious roots growth of Ⅴ. officinalis under suspension culture

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level.圖1 懸浮培養(yǎng)下歐洲纈草不定根生長(zhǎng)曲線Fig.1 Adventitious root growth curve of V. officinalis under suspension culture

2.7 懸浮培養(yǎng)條件下歐洲纈草不定根的生長(zhǎng)

由圖1可知，懸浮條件下歐洲纈草不定根的生長(zhǎng)曲線基本呈“S”型。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，歐洲纈草不定根生物量先增加后小幅度減少，在接種后0～7 d不定根生長(zhǎng)基本處于遲緩期，生物量增加緩慢(圖2-A)；接種后7 d，歐洲纈草不定根分化出小側(cè)根(圖2-B)，其生物量開始較快增長(zhǎng)；接種后7～21 d，歐洲纈草不定根增長(zhǎng)速度快，基本處于對(duì)數(shù)期(圖2-C、D)；接種后21～28 d，歐洲纈草不定根增長(zhǎng)速度下降，處于緩慢增長(zhǎng)期，接種后28 d，歐洲纈草不定根生長(zhǎng)量最大，處于基本穩(wěn)定期(圖2-E)；接種后28～35 d，歐洲纈草不定根生物量有小幅度下降，處于衰退期(圖2-F)。因此，接種后7～28 d為歐洲纈草不定根生物量增加的關(guān)鍵時(shí)期，接種28 d時(shí)歐洲纈草不定根生物量最大，此時(shí)適宜收獲。

2.8 歐洲纈草的有效成分測(cè)定

2.8.1 歐洲纈草不定根中有效成分的HPLC圖 根據(jù)1.3.8色譜條件測(cè)得3種標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間的先后順序?yàn)橐阴＠i草三酯、纈草三酯、纈草烯酸(圖3-A)，同時(shí)歐洲纈草不定根中纈草三酯、乙酰纈草三酯、纈草烯酸與其他組分均能達(dá)到較好分離(圖3-B)。

2.8.2 回歸方程 以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(x，μg)為橫坐標(biāo)，得到3種成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)(表7)，3種成分在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表7 歐洲纈草有效成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 7 Regression equations and correlation coefficients secondary metabolites of Ⅴ. officinalis

2.8.3 歐洲纈草有效成分含量分析 懸浮條件下培養(yǎng)的歐洲纈草3種類型根中有效成分的總含量表現(xiàn)為正常不定根>褐化不定根>無菌苗根，褐化現(xiàn)象顯著降低了不定根中有效成分的含量，其中，正常不定根中纈草三酯含量最高，為7.222 mg·g-1，無菌苗根中纈草三酯含量最低，為2.688 mg·g-1；正常不定根中乙酰纈草三酯含量最高，為0.355 mg·g-1，褐化不定根中乙酰纈草三酯含量最低，為0.036 mg·g-1；正常不定根中纈草烯酸含量最高，為4.016 mg·g-1，無菌苗根中纈草烯酸含量最低，為1.393 mg·g-1。歐洲纈草正常不定根中纈草三酯、乙酰纈草三酯、纈草烯酸含量均顯著高于褐化不定根和無菌苗根。綜上表明，在懸浮培養(yǎng)條件下大量培養(yǎng)正常不定根是高效繁殖歐洲纈草有效成分的有效手段。

表8 歐洲纈草三種根類型有效成分的含量Table 8 Content of active ingredients of three root types of V. officinalis /(mg·g-1)

3 討論

3.1 歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)體系

通過組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物時(shí)，如何提高培養(yǎng)物的增長(zhǎng)量和目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量是首要解決的問題[10]。不同的培養(yǎng)基中含有不同濃度的碳源、無機(jī)鹽、維生素和有機(jī)酸等物質(zhì)，這些因素會(huì)影響培養(yǎng)物生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的合成效果。

不同的植物、器官或組織對(duì)培養(yǎng)基pH值的要求也不盡相同。不同植物、器官或組織生長(zhǎng)都有其最適pH值。本研究中，歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的最適pH值為5.7。曲偉紅等[11]研究發(fā)現(xiàn)瓦松愈傷組織培養(yǎng)的適宜pH值為5.8，與本研究的結(jié)果相似。魏振園等[12]研究發(fā)現(xiàn)pH值為6.6左右時(shí)，國(guó)槐懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)狀況好，且細(xì)胞黃酮類化合物含量較高，這與本研究結(jié)果不同。

不同植物有不同的適合碳源，不同的碳源會(huì)對(duì)生長(zhǎng)效果產(chǎn)生不同影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，以蔗糖為碳源時(shí)，歐洲纈草不定根生長(zhǎng)效果最好，生物量最大，而歐洲纈草不定根在果糖和半乳糖中幾乎不生長(zhǎng)。類似的現(xiàn)象在雷公藤[13]、檉柳[14]和蕎麥[15]等植物中也存在，可能是不定根不能直接吸收果糖和半乳糖。一般認(rèn)為，蔗糖作為很好的碳源，是由于蔗糖更容易被植物細(xì)胞壁內(nèi)的蔗糖酶分解為葡萄糖和果糖，進(jìn)而被細(xì)胞吸收和利用[13]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度為40 g·L-1時(shí)，歐洲纈草不定根生長(zhǎng)效果最好，生物量最大。尹雙雙[16]研究發(fā)現(xiàn)在4%蔗糖濃度下，太子參不定根生長(zhǎng)最好；Lee等[17]研究發(fā)現(xiàn)在3%蔗糖濃度下，匙羹藤生物量最大；黃韜等[18]研究發(fā)現(xiàn)40 g·L-1的蔗糖濃度最有益于人參不定根的生長(zhǎng)，低于或者高于此蔗糖濃度對(duì)不定根的生長(zhǎng)差。這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。

鹽濃度對(duì)不定根生物量的增加及其次生代謝產(chǎn)物的合成具有很大的影響。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在鹽濃度為2X(即2倍的RCM大量元素)時(shí)，歐洲纈草不定根生長(zhǎng)效果最好，生物量最大。在低鹽濃度下，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不夠，導(dǎo)致了不定根生長(zhǎng)較差，生物量低，但鹽濃度超過2X時(shí)，會(huì)抑制不定根生長(zhǎng)，可能是滲透壓過高抑制了細(xì)胞對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收，影響了細(xì)胞生長(zhǎng)。尹雙雙[16]研究發(fā)現(xiàn)，太子參不定根在1 MS鹽強(qiáng)度下生物量最大；Baque等[19]發(fā)現(xiàn)低鹽濃度最適宜諾麗果不定根生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物積累；Zhang等[20]發(fā)現(xiàn)杠柳不定根在1/2 MS條件下不定根的生物量達(dá)到最大。這些研究均表明鹽濃度會(huì)影響不定根的生長(zhǎng)。

N不僅是植物體必需的營(yíng)養(yǎng)元素，還是構(gòu)成蛋白質(zhì)、核酸等多種具有重要生理功能物質(zhì)的主要成分。培養(yǎng)基中N不可缺少，但N濃度過高和過低都不利于其增殖生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的合成。本試驗(yàn)結(jié)果表明，總N濃度為48.46 mmol·L-1時(shí)，歐洲纈草不定根生長(zhǎng)效果最好，生物量最大。氮源濃度在細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物合成上起著關(guān)鍵的作用[21]。吳春華等[22]發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基氮濃度為45 mmol·L-1時(shí)，白色紫錐菊不定根生物量、酚和黃酮含量均達(dá)到最大值。李慧娟[23]發(fā)現(xiàn)東北刺人參不定根生長(zhǎng)的最適N濃度為60 mmol·L-1。

磷是植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，也是植物新陳代謝最重要的礦質(zhì)元素之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物積累中起著至關(guān)重要的作用[24]。本研究中，總P濃度為1.5 mmol·L-1時(shí)，歐洲纈草不定根生長(zhǎng)效果最好，生物量最大，顯著優(yōu)于其他總P濃度。李慧娟[23]發(fā)現(xiàn)1.5 mmol·L-1的P濃度可以使東北刺人參生物量達(dá)到最大值；王洪秋[25]發(fā)現(xiàn)1.88 mmol·L-1的P濃度最適宜白色紫雛菊不定根生物量積累。

本試驗(yàn)獲得的歐洲纈草理想懸浮培養(yǎng)體系：2倍大量元素濃度、48.46 mmol·L-1總N濃度、1.5 mmol·L-1總P濃度的RCM培養(yǎng)基，添加40 g·L-1蔗糖、0.5 mg·L-1NAA，pH值5.7，于25±2℃、100 r·min-1條件下暗培養(yǎng)時(shí)，歐洲纈草不定根的生長(zhǎng)曲線基本呈“S”型，接種后7～28 d為其生物量積累的關(guān)鍵時(shí)期，宜于接種后28 d收獲。這與尹雙雙[16]、史昆等[26]的研究結(jié)果相似。

3.2 歐洲纈草次生代謝產(chǎn)物含量

本研究利用HPLC測(cè)定了歐洲纈草理想懸浮培養(yǎng)條件下正常不定根、褐化不定根和無菌苗根中纈草三酯、乙酰纈草三酯、纈草烯酸的含量，發(fā)現(xiàn)正常不定根中3種有效成分含量最多，褐化不定根中成分含量嚴(yán)重降低，且顯著低于正常不定根，無菌苗根中成分含量最低。本研究中，接種后28 d，歐洲纈草不定根纈草烯酸含量為4.012 mg·g-1，高于梁朝鋒等[27]測(cè)得的黑龍江產(chǎn)黑水纈草根及根莖的中的含量，推斷對(duì)于歐洲纈草來說，給予充足的養(yǎng)分、適宜的條件，容易促進(jìn)纈草烯酸的合成和積累，這可能是由于液體培養(yǎng)中某種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)促進(jìn)纈草烯酸的合成，而土壤中具有促進(jìn)作用的物質(zhì)含量較低，導(dǎo)致纈草烯酸含量較低，養(yǎng)分充足生長(zhǎng)時(shí)間短的不定根中纈草烯酸含量高于兩年生根，養(yǎng)分充足生長(zhǎng)時(shí)間短的無菌苗根中纈草烯酸含量也接近于兩年生根，這也間接證明了此推斷；不定根中纈草三酯含量為7.222 mg·g-1，高于梁朝鋒等[27]測(cè)得的黑龍江產(chǎn)黑水纈草和侯文慧等[9]測(cè)得的云南師宗和大理等地產(chǎn)蜘蛛香中的含量，低于狄宏曄等[28]測(cè)得的云南師宗地產(chǎn)蜘蛛香藥材的含量，可見同一品種、同一產(chǎn)地因儲(chǔ)藏時(shí)間過長(zhǎng)而使得纈草三酯類成分含量大幅降低，纈草三酯成分的不穩(wěn)定和易降解特性顯現(xiàn)[29]；不定根乙酰纈草三酯含量為0.355 mg·g-1，高于侯文慧等[9]測(cè)得的云南永平、昆明、四川雅安、峨眉山等地產(chǎn)蜘蛛香藥材中的含量，低于云南師宗、大理和寶山等地產(chǎn)蜘蛛香藥材的含量。可見，產(chǎn)地、氣候環(huán)境、儲(chǔ)存時(shí)間、種間差異等因素會(huì)使纈草三酯、纈草烯酸、乙酰纈草三酯等成分的含量有所不同。此外，在本試驗(yàn)過程中甲醇根粉末溶液的超聲波細(xì)胞粉碎處理會(huì)使溶液溫度升高，有效成分降解，離心取上清液后的殘留物中也會(huì)存在一些有效成分，這些都會(huì)使得試驗(yàn)測(cè)量的有效成分含量值低于實(shí)際值。

4 結(jié)論

本研究篩選到的歐洲纈草理想懸浮培養(yǎng)條件為2倍RCM大量元素濃度、48.46 mmol·L-1總N濃度、1.5 mmol·L-1總P濃度的RCM培養(yǎng)基，添加40 g·L-1蔗糖、0.5 mg·L-1NAA，pH值5.7，此條件下接種后培養(yǎng)28 d，收獲得到的歐洲纈草不定根中纈草三酯、乙酰纈草三酯分別為7.222、0.355 mg·g-1，2種有效成分總含量為7.577 mg·g-1，約占不定根總干重的0.76%，與2010版中國(guó)藥典規(guī)定的蜘蛛香藥材干燥品中纈草三酯和乙酰纈草三酯的總含量不得少于0.80%的要求相差不大[30]。此外，在本研究篩選得到的懸浮培養(yǎng)條件下，歐洲纈草不定根繁殖速度快，為歐洲纈草不定根和有效成分的規(guī)?；a(chǎn)提供了依據(jù)。

附表1 RCM培養(yǎng)基成分及濃度 Schedule 1 Composition and concentration of RCM

成分Composition濃度Concentration/(mg·L-1)蔗糖Sucrose30 000KNO380Ca(NO3)2·4H2O288MgSO4·7H2O370NaH2PO412Na2SO499ZnSO4·7H2O2.65H3BO31.5KCl65KI0.75Na2MoO4·2H2O0.25CuSO4·5H2O0.02MnCl2·4H2O6Na2EDTA7.4FeCl33.2甘氨酸Glycine3煙酸Nicotinic acid0.5鹽酸吡哆醇Pyridoxine hydrochloride0.1鹽酸硫胺素Thiamine hydrochloride0.1

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