高親和力大豆凝集素單抗制備及免疫學特性鑒定

胡驍飛 李燕虹 邢云瑞 胡思宇 孫亞寧 邢廣旭 鄧瑞廣 張改平,4,*

(1 河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；2 河南科技大學食品與生物工程學院， 河南 洛陽 471003； 3河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南 鄭州 450002；4河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002)

大豆及其制品含有豐富的蛋白質(zhì)資源，且營養(yǎng)成分利用效率高，是人類和動物的重要食品原料及飼料加工原料。但大豆中含有多種致敏蛋白和抗營養(yǎng)因子，這些物質(zhì)的存在會影響大豆的有效利用[1]。大豆凝集素(soybean agglutinin，SBA)就是其中一種重要的抗營養(yǎng)因子[2]。SBA是一種能與N-乙?；鵇-半乳糖胺/D-半乳糖特異性結合、分子量約為120 kDa的糖蛋白[3-4]。SBA具有凝集紅細胞和促分裂的生物學活性，通過小腸上皮刷狀緣進入循環(huán)系統(tǒng)誘發(fā)免疫反應[5-6]，引起動物小腸黏膜損傷、絨毛萎縮，胰腺增生，致使動物體蛋白分解增強，內(nèi)源氮損失增加[7-9]。日糧中的SBA可以引起動物腹瀉，導致生長速度下降，體重減輕，甚至導致動物死亡，嚴重威脅動物尤其是幼齡動物的健康生長與生命安全[10-11]。

為監(jiān)控SBA的存在，減少其對動物的危害，科研人員建立了多種SBA的測定方法，如紅細胞凝集試驗[12]、免疫火箭電泳[13]及酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)等方法[14-15]。紅細胞凝集試驗中紅細胞來源會影響試驗的靈敏性，若紅細胞選擇不合理則檢測靈敏性較低，而且紅細胞來源不同可能導致檢測結果重復性較差[16-17]。免疫火箭電泳法操作比較復雜，且需要特殊的儀器設備，不能進行現(xiàn)場實時監(jiān)測，難以推廣。與其他方法相比，ELISA檢測方法[14]縮短了檢測時間，但由于SBA是大分子蛋白質(zhì)，含有多個抗原決定簇，因此更適合采用雙抗體夾心ELISA方法進行測定。另外，多克隆抗體的成分不均一，采用多抗血清建立SBA間接競爭ELISA檢測方法，其準確性與重復性較低；而單克隆抗體成分比較均一，且性能比多克隆抗體穩(wěn)定，利用兩種單克隆抗體或至少一種單克隆抗體與一種多克隆抗體進行配對建立雙抗體夾心ELISA檢測方法，其性能較穩(wěn)定，且準確性及重復性較好[18-19]。張海全[15]制備出了SBA單克隆抗體，利用紅細胞膜對SBA特異性吸附的性能，結合所制備的單抗建立了相當于雙抗夾心ELISA的SBA檢測方法，比間接競爭ELISA試劑盒檢測結果更準確。但由于紅細胞膜來源及制備時的純凈度不確定，且易受試驗中試劑性質(zhì)的影響，這種試劑盒檢測的穩(wěn)定性及重復性相對較差。ELISA檢測耗時通常在2 h以上，還需酶標儀來讀值，不能實現(xiàn)現(xiàn)場實時監(jiān)測。廣大食品生產(chǎn)及飼料加工、動物養(yǎng)殖企業(yè)迫切需要更簡單快速的SBA檢測方法?；谀z體金標記技術及免疫測流層析技術建立的快速檢測試紙是目前食品飼料安全監(jiān)控檢測領域的研究熱點，由于其簡單快速，且符合我國食品安全快速篩查的要求，已廣泛應用于農(nóng)藥[20]、獸藥[21]、霉菌毒素[22]、細菌病毒[23]及過敏原等的檢測[19]。試紙制備過程中由于需要抗體與膠體金或量子點結合，影響抗體生物活性，因此同一種抗體試紙目測靈敏性應遠低于試劑盒靈敏性[24]。通常情況下，抗體親和力越高，則靈敏性越好。為了研制準確率高、重復性好、靈敏性高的SBA免疫學檢測試紙，必須研制高靈敏、高親和力的SBA單克隆抗體。

本試驗擬采用低劑量、多次免疫的方法，通過免疫小鼠、細胞融合及陽性雜交瘤篩選技術，篩選制備出親和力高、靈敏性好、特異性強的SBA單克隆抗體，以期為建立穩(wěn)定靈敏的SBA免疫學檢測方法提供可靠的抗體保障，為大豆及其制品中SBA的監(jiān)測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SBA，大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子(kunitz trypsin inhibitor，KTI)，大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子(bowman-birk trypsin inhibitor，BBI)，大豆球蛋白(glycinin)，β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)，弗氏完全佐劑(freund’s complete adjuvant， FCA)，弗氏不完全佐劑(freund’s incomplete adjuvant，F(xiàn)IC)，mAb分型試劑，購自美國Sigma-Aldrich公司。HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine)培養(yǎng)基，HT(hypoxanthine-thymidine)培養(yǎng)基，RPMI-1640，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)蛋白Marker，酶標羊抗鼠IgG抗體(GaMIgG-HRP)，硝酸纖維(nitrocellulose，NC)膜，購自索萊寶(北京)生物科技公司。ELISA包被液[0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液(carbonate buffer solution，CBS)]，稀釋液[0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)]，封閉液[含5%脫脂奶的PBST(含0.05% Tween-20的PBS)溶液]，顯色液[磷酸-檸檬酸緩沖液(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB)]，終止包被液(2 mol·L-1的H2SO4溶液)等溶液均由實驗室配置。其他試劑均為市售分析級試劑。

6～8周齡潔凈級雌性BALB/c小鼠，購自鄭州大學醫(yī)學院動物實驗中心。小鼠NS0骨髓瘤細胞由英國國家動物健康研究院惠贈。

1.2 主要儀器與設備

TMQC型臺式高壓蒸汽滅菌器，新華醫(yī)療器械有限公司；iMark 450/550酶標儀、Trans-Blot轉膜系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；BCM-1000A型生物潔凈工作臺，AIRTECH蘇凈安泰有限公司；DMI 3000型倒置生物顯微鏡，德國Leica光學儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小鼠免疫 取4只健康雌性BALB/c小鼠，以50 μg SBA蛋白/200 μL乳化液/只的劑量免疫小鼠，共免疫4次，免疫間隔21 d。首次免疫，取500 mg·L-1SBA溶液600 μL，加入等體積的FCA(考慮乳化過程免疫原的損失，因此增加50%的量)，完全乳化后背部皮下4～6點注射。后3次強化免疫，用FIA替代FCA，其他條件不變。

1.3.2 多抗血清鑒定 第4次免疫10 d后，小鼠斷尾采血，制備多抗血清，采用ELISA方法對血清效價及靈敏性進行測定[18]。間接ELISA測定效價時，以滿足P≥0.2且P/N值≥2.1條件時，最小P值對應的血清稀釋倍數(shù)為血清效價，其中P為陽性孔OD450值，N為陰性孔(陰性孔中加入未經(jīng)SBA免疫的小鼠血清)OD450值。間接競爭ELISA與間接ELISA步驟有所不同，首先將含2 500、2 000、1 500、1 000、500、250、125和0 μg·L-1的SBA標準液各50 μL分別加入包被有SBA的酶標板孔中，然后每孔加入50 μL效價測定時OD450值為1.0左右的血清稀釋液，其余步驟與間接ELISA一致，根據(jù)酶標儀讀值，以B/B0(B為不同濃度SBA對應的OD450值，B0為0 μg·L-1SBA對應的OD450值)為縱坐標，SBA濃度對數(shù)為橫坐標建立抑制曲線，計算半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration, IC50)，以此衡量血清靈敏性。選取血清效價高，靈敏性好的小鼠作為細胞融合小鼠。

1.3.3 雜交瘤細胞株的建立 細胞融合前3 d，對篩選用來融合的小鼠進行超強免疫1次，腹腔注射200 μL含50 μg SBA滅菌PBS溶液。抻頸處死超免小鼠，70%酒精浸泡5 min，超凈臺無菌取出小鼠脾臟，并與提前復蘇培養(yǎng)的NS0細胞進行融合，將融合后的細胞加入96孔細胞培養(yǎng)板進行培養(yǎng)，7～10 d(根據(jù)細胞生長情況)后取上清液，進行陽性雜交瘤篩選。具體細胞融合步驟及陽性雜交瘤細胞篩選過程參照文獻[25-26]的方法進行。

1.3.4 SBA mAb大量制備 采用體內(nèi)誘生腹水法大量制備SBA mAb。將0.5 mL/只滅菌液體石蠟注射到小鼠腹腔中，7 d后，用RMPI-1640稀釋陽性雜交瘤細胞至1×106個·mL-1，以0.5 mL/只的劑量注射入上述小鼠腹腔內(nèi)。觀察小鼠腹部腫脹情況，待腹部腫脹明顯時采集腹水，將腹水5 000 r·min-1離心10 min，棄沉淀留上清，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 SBA mAb免疫學特性鑒定

效價測定：間接ELISA方法測定SBA mAb效價。

亞型鑒定：按照Sigma鼠源mAb分型試劑盒說明書測定。

親和力常數(shù)(Ka)測定：ELISA飽和法測定[24]，根據(jù)公式進行計算：

Ka=(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)

(1)

式中，n為[Ag]t與[Ag’]t的比值；[Ag]t、[Ag’]t為不同包被濃度；[Ab]t、[Ab’]t為2個不同包被濃度下抗體50%半飽和對應的濃度。

特異性鑒定：交叉反應率測定，將glycinin、β-conglycinin、BBI、KTI作為抑制劑，通過間接競爭ELISA測定IC50，計算交叉反應率[(cross reaction rate, CR)CR=SBA的IC50/其他競爭物的IC50×100%][27]。Western blot鑒定，將glycinin、β-conglycinin、BBI、KTI分別以相同的濃度及體積加入SDS-PAGE凝膠泳道中(每個樣品2個重復)，電泳結束后一部分用于考馬斯亮藍染色并脫色觀察；另一部分轉膜后，加入抗體于37℃條件下孵育2 h，經(jīng)PBST洗滌30 min，再于室溫下與酶標二抗GaMIgG-HRP結合2 h，經(jīng)PBST洗滌后超免ECL化學發(fā)光顯色液顯色，將顯色結果與SDS-PAGE結果進行比對，判斷SBA mAb的特異性[19]。

2 結果與分析

2.1 小鼠多抗血清的鑒定

由表1可知，經(jīng)過4次免疫， 4只小鼠免疫效果良好，均產(chǎn)生了SBA抗體，效價均在1∶6 400 以上，其中1、2、3號小鼠效價均達到1∶12 800以上。

表1 多抗血清效價的間接ELISA測定結果Table 1 Titer of mouse antiserum detected by indirect ELISA

4只免疫小鼠產(chǎn)生的抗體，均可以被SBA抑制，其中1號小鼠抑制效果最好(圖1)。根據(jù)1號小鼠多抗血清抑制曲線計算其IC50為571.4 μg·L-1。說明本研究采用的SBA免疫劑量、免疫方式是成功的。

2.2 SBA mAb的制備及特性鑒定

根據(jù)免疫小鼠多抗血清效價及靈敏性鑒定結果，選擇血清效價高、靈敏性好的1號小鼠進行細胞融合。經(jīng)過有限稀釋亞克隆，最終得到1株能穩(wěn)定分泌抗SBA單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞株，命名為5B4E10。通過小鼠體內(nèi)誘生腹水法批量制備出SBA單克隆抗體。

2.2.1 SBA mAb效價 由表2可知，所制備的SBA單抗抗體效價比較高，達到1∶409 600以上。

圖1 1號小鼠血清的抑制曲線Fig.1 Serum inhibitive curve of No.1 mouse

表2 SBA mAb效價測定Table 2 Determination of the titer of SBA mAb

2.2.2 SBA mAb亞型 SBA mAb亞型鑒定結果見圖2。結果表明，制備的SBA mAb亞型為IgG1型。

2.2.3 SBA mAb親和力 SBA mAb的親和力曲線見圖3。經(jīng)計算，與5 和2.5 mg·L-1濃度的SBA抗原結合并達到50%飽和狀態(tài)時所對應SBA mAb濃度分別為739.55 和415.40 μg·L-1，根據(jù)公式計算Ka為1.83×109L·mol-1，而一般認為Ka介于107～1012L·mol-1時屬于高親和力抗體[28]，親和力越高，說明以此抗體制備的檢測產(chǎn)品靈敏性越好。

圖2 SBA mAb亞型鑒定Fig.2 Identification of subtype of SBA mAb

圖3 SBA mAb親和力曲線Fig.3 Affinity curve of SBA mAb

2.2.4 SBA mAb靈敏性 SBA mAb靈敏性測定結果見圖4。抑制回歸曲線方程為y=-0.329 8x+1.131 2，R2=0.979 5，由回歸曲線計算IC50為82.04 μg·L-1。說明SBA mAb具有很高的靈敏性。這可能是由于抗體的親和力比較高，更易與靶標物質(zhì)結合。

圖4 SBA mAb的抑制曲線Fig.4 Inhibitive curve of SBA mAb

2.2.5 SBA mAb特異性 由表3可知，SB mAb與glycinin、β-conglycinin、BBI、KTI的CR均小于1%，說明4種競爭物與SBA mAb無交叉反應性，SBA mAb的特異性比較強。

表3 SBA mAb的交叉反應結果Table 3 The cross-reactivity of SBA mAb

由圖5-A可知，SDS凝膠電泳時，大豆過敏原glycinin及β-conglycinin，抗營養(yǎng)物質(zhì)SBA、BBI、KTI均有條帶出現(xiàn)，說明膠片上有該種物質(zhì)存在。由圖5-B可知，SDS凝膠電泳膠片轉膜到NC膜上與SBA mAb反應時，只有SBA條帶還存在，而glycinin、β-conglycinin、BBI及KTI的條帶均消失，說明SBA mAb只能與SBA結合，不與其他4種物質(zhì)結合，進一步證明了SBA mAb的特異性較強。

Note: 1: Marker. 2: glycinin. 3: β-conglycinin. 4: BSA. 5: BBI. 6: KTI.圖5 SBA mAb Western blot鑒定Fig.5 Western blot identification of SBA mAb

3 討論

SBA分子量約120 kDa，屬于大分子抗原物質(zhì)，與農(nóng)藥、獸藥、霉菌毒素等小分子半抗原物質(zhì)不同，小分子半抗原必需與載體蛋白偶聯(lián)形成人工完全抗原才能夠刺激動物機體產(chǎn)生抗體[21, 29-30]。 而SBA不需要與載體蛋白偶聯(lián)就可以直接刺激動物機體產(chǎn)生抗體，因此本試驗直接將SBA經(jīng)過乳化后免疫動物用來制備抗體。有研究用大豆球蛋白glycinnin和β-conglycinin直接免疫小鼠和兔子成功制備出了二者的單克隆抗體和多克隆抗體[25]。

抗原免疫劑量并非越高越好，大劑量免疫不但浪費抗原增加成本，而且所制備抗體的效價及靈敏性并不一定比低劑量組高[31-32]。王耀[25]以50 μg SBA蛋白劑量用glycinin和β-conglycinin免疫小鼠，取得了良好的免疫效果；本研究同樣用50 μg SBA蛋白的劑量對小鼠進行免疫，所用劑量比張海全[15]研究選用劑量低60%，但本研究制備的單抗親和力常數(shù)(Ka)比張海全[15]制備的單克隆抗體高出近兩個數(shù)量級(109∶107)，這可能是由于本研究采用4次免疫，而張海全[15]的研究選用的是3次免疫，表明低劑量、多頻次免疫可能更利于高親和力抗體形成。親和力高的抗體，其靈敏性也較好，本研究中所制備單抗敏感性較好，其IC50為82.04 μg·L-1，而張海全[15]報道中未提及抗體靈敏性，如果從抗體的親和力來推算，本研究制備抗體的靈敏性更好一些，而親和力高、靈敏性好的單抗更易于制備出高靈敏的免疫學檢測產(chǎn)品。本研究制備的抗體亞型為IgG1型，張海全[15]制備的SBA單克隆抗體亞型是IgG2型，二者之所以不同，可能是由SBA免疫劑量、免疫次數(shù)及免疫間隔不同引起的，張海全[15]所用SBA免疫劑量為80 μg蛋白，免疫間隔為28 d，免疫3次；而本研究所用SBA免疫劑量為50 μg蛋白，免疫間隔21 d，免疫4次。本研究制備的SBA抗體亞型與王耀[25]制備的glycinin 和β-conglycinin抗體亞型一致，均為IgG1型，而兩項研究除了靶標不同外，所采用的免疫劑量、免疫間隔及免疫次數(shù)均相同。

4 結論

本試驗通過將純化的SBA免疫BALB/c小鼠，在鑒定小鼠多抗血清效價和靈敏性的基礎上，選擇效價和靈敏性較優(yōu)的小鼠進行細胞融合，陽性雜交瘤篩選，有限稀釋亞克隆成功，從而得到1株能分泌抗SBA單克隆抗體的穩(wěn)定雜交瘤細胞株5B4E10，其分泌的SBA mAb效價達到1∶409 600以上，亞型為IgG1型，Ka為1.83×109L·mol-1，且只與SBA特異性結合，而不與其他大豆過敏原或抗營養(yǎng)因子結合。本試驗制備出了免疫學特性良好的SBA單克隆抗體，為建立大豆及其制品中SBA的高靈敏免疫學檢測方法奠定了良好的基礎。