TRPC6基因新發(fā)變異致兒童終末期腎病1例報告并文獻復(fù)習(xí)

樊姣姣 付 榮 和俊杰 劉雪杰 陳 沖 王淑靜 同少峰

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬濮陽市油田總醫(yī)院兒科（河南濮陽 457001）

終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）是各種因素所致慢性腎臟病的最嚴(yán)重階段，腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）＜15 mL/(min·1.73 m2)，需要透析或腎移植等替代治療維持生命[1]。遺傳學(xué)研究表明，編碼足細(xì)胞相關(guān)蛋白基因發(fā)生變異可破壞腎小球正常的濾過膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生和進行性腎功能衰竭，如NPHS1，NPHS2，PLCE1，ADCK4，WT1等[2]?，F(xiàn)回顧性分析濮陽市油田總醫(yī)院診治的1例由于TRPC 6基因新發(fā)變異導(dǎo)致臨床表現(xiàn)嚴(yán)重且短時間內(nèi)進展至ESRD患兒的臨床資料，并對相關(guān)文獻進行復(fù)習(xí)。

1 臨床資料

先證者，女，9歲，因發(fā)現(xiàn)顏面水腫20天就診于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院，尿常規(guī)蛋白+++，24小時尿蛋白總量2 677 mg/L；血白蛋白15.7 g/L，三酰甘油4.59 mmol/L，總膽固醇10.66 mmol/L，尿素氮5.94 mmol/L，肌酐68 μmol/L，GFR 86 mL/(min·1.73 m2)，乙肝病毒相關(guān)抗體及抗核抗體譜均陰性?；純焊改阁w健，非近親婚配；有一姐姐，體健；否認(rèn)家族性腎臟疾病及其他遺傳性疾病史。外院診斷為原發(fā)性腎病綜合征，曾采用中藥制劑、激素及呋塞米利尿消腫及白蛋白提高膠體滲透壓等治療，患兒水腫無好轉(zhuǎn)，遂至上級醫(yī)院就診。入院體格檢查：顏面部浮腫，腹部叩診移動性濁音陽性，雙下肢凹陷性水腫，外陰水腫。實驗室檢查：24小時尿蛋白總量4201 mg/L；血白蛋白16.1 g/L，總膽固醇20.52 mmol/L，三酰甘油4.44 mmol/L，尿素氮 19.39 mmol/L，肌酐95.8 μmol/L，GFR 62 mL/(min 1.73 m2)；腹部B超示左腎102 mm×54 mm×53 mm，右腎108 mm×43 mm×42 mm，雙腎實質(zhì)彌漫性回聲改變，腹腔大量腹水。予中藥制劑，激素沖擊治療，口服免疫抑制劑（他克莫司/環(huán)孢素A），輸注白蛋白、血漿等治療，但是患兒治療反應(yīng)差，全身高度水腫，尿量減少至300～400 mL/d，體質(zhì)量自入院22 kg增加至32 kg。2周后復(fù)查尿常規(guī)蛋白+++；血尿素氮47.97 μmol/L，肌酐247.0 μmol/L，GFR 23 mL/ (min·1.73 m2)，提示腎功能持續(xù)進行性惡化。行血液透析治療后，患兒水腫逐漸消退，出院后規(guī)律血液透 析。

5個月后患兒因呼吸急促3小時第1次入油田總醫(yī)院兒科。入院體格檢查：精神差，貧血貌，呼吸急促，三凹征陽性，全身皮膚黏膜暗黃，雙眼瞼水腫，雙肺呼吸音粗，左肺可聞及細(xì)濕啰音，肝肋下2 cm，質(zhì)軟，移動性濁音陰性，雙下肢凹陷性水腫。實驗室檢查：尿常規(guī)蛋白+++；外周血白細(xì)胞22.63×109/L，血紅蛋白78 g/L，白蛋白25.6 g/L，血鉀6.53 mmol/L，尿素氮18.55 mmol/L，血肌酐797.8 μmol/L，GFR 7.5 mL/(min·1.73 m2)，B型尿鈉肽＞5 000.0 ng/L；心臟彩超示心包積液，右側(cè)胸腔積液，肺實變。診斷：慢性腎臟病5期、心力衰竭、肺部感染、腎性貧血、高鉀血癥，予抗感染、輸血、床旁血液透析等對癥支持治療。治療18天后患兒病情好轉(zhuǎn)，回當(dāng)?shù)蒯t(yī)院繼續(xù)規(guī)律透析。

因頻繁抽搐，呈全身強直陣攣發(fā)作，再次入總醫(yī)院兒科。入院體格檢查：精神差，嗜睡，肝肋下3 cm，質(zhì)軟，雙側(cè)巴氏征弱陽性。實驗室檢查：血白蛋白31.5 g/L，尿素氮16.32 mmol/L，肌酐628.5 μmol/L，GFR 9.7 mL/(min· 1.73 m2)，血鈣2.23 mmol/L，血鉀3.80 mmol/L；頭顱核磁共振（MRI）示大腦半球?qū)ΨQ，腦實質(zhì)未見明顯異常信號，腦室系統(tǒng)擴大，中線結(jié)構(gòu)居中，腦溝、腦池稍增寬，余未見異常。視頻腦電圖：廣泛性棘慢波、多棘慢波、棘波節(jié)律發(fā)放。診斷：慢性腎臟病5期、癲癇，予血液透析，口服丙戊酸鈉和左乙拉西坦等。經(jīng)治療后，患兒病情趨于平穩(wěn)，自動出院后電話隨訪，未再出現(xiàn)癇樣發(fā)作。

考慮患兒臨床治療效果差，進展至ESRD速度快，出現(xiàn)心力衰竭和癲癇原因不明，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒父母簽署知情同意書后，采集患兒外周血2 mL提取基因組DNA進行全外顯子基因測序（whole exon gene sequencing，WES），然后取患兒及父母外周血進行Sanger測序，驗證WES篩選出的致病基因是否存在常染色體隱性或顯性遺傳的可能。測序?qū)嶒炍斜本┲且驏|方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心有限公司完成?；驒z測結(jié)果顯示，患兒TRPC6基因第2個外顯子發(fā)現(xiàn)c.395T＞C（編碼區(qū)第395位堿基胸腺嘧啶轉(zhuǎn)換為胞嘧啶），導(dǎo)致蛋白質(zhì)第132位蛋氨酸轉(zhuǎn)換成蘇氨酸（p.Met132Thr），為錯義變異（圖1）。該氨基酸在物種進化過程中高度保守，變異后可能影響蛋白質(zhì)的功能和表達，先證者父母經(jīng)Sanger測序驗證均未見異常，為新發(fā)（de novo）變異。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳與基因組學(xué)會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南進行生物學(xué)致病等級分析，保守性及蛋白結(jié)構(gòu)（SIFT、Polyphen2_HDIV、Mutation_Taster）兩種統(tǒng)計方法預(yù)測變異有害，可能致??；該變異的次要等位基因頻率（MAF）＜0.005，屬于低頻變異，dpSNP、千人基因組、ExAC等數(shù)據(jù)庫未見收錄，且該變異位點的致病性已有文獻報道，但為國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)[9,13]。

圖1 患兒及父母TRPC6 基因測序圖

2 討論

TRPC 6基因編碼瞬時受體電位陽離子通道 6蛋白（transient receptor potential channel 6，TRPC6），是一個非選擇性陽離子通道，位于染色體 11q21～q22，包含 13個外顯子，共 132 365個堿基。TRPC6表達增加會導(dǎo)致足細(xì)胞鈣離子分布異常，改變足突的收縮功能，破壞濾過屏障的動態(tài)平衡，導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生；也可導(dǎo)致足細(xì)胞肌動蛋白骨架結(jié)構(gòu)異常，引起腎小球的硬化[3-5]。2005年研究者在常染色體顯性遺傳的家族性局灶節(jié)段性腎小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS）中檢出并證實TRPC6為致病基因，且60%患者在約10年間進展至ESRD[6]。同年，研究者通過大鼠腎臟切片發(fā)現(xiàn)TRPC 6在腎小管和腎小球廣泛表達，多數(shù)分布于足細(xì)胞，尤其是裂孔隔膜，并對71個FSGS家系進行TRPC6篩查，變異檢出率約為7%，發(fā)病年齡較晚（17～57歲）[7]。2009年首次在1例9歲FSGS患兒中檢出TRPC6基因（c.2339T＞C）變異，并認(rèn)為TRPC6基因也可導(dǎo)致散發(fā)性的早發(fā)型FSGS。

迄今為止，已報道兒童TRPC6基因的致病位點變異16例，包括錯義變異14例、無義變異1例和移碼變異1例，無明顯的熱點變異位點。但在對伊朗26例＜16歲的FSGS患兒的TRPC6基因篩查中，新發(fā)現(xiàn)4種變異位點，其中3例錯義變異位于外顯子2，并認(rèn)為第2外顯子應(yīng)該作為熱點篩查區(qū)域[8]?；仡櫸墨I報道的18例患兒[8-15]，加上本例患兒共19例，發(fā)病年齡最小4月齡，最大14歲，平均年齡（5.48±3.92）歲。18例報道患兒中，3例未報道病理類型，12例是FSGS。本例患兒由于大量腹水和全身高度水腫，未能行腎穿刺活檢術(shù)，因而其病理類型未知；18例報道患兒中5例出現(xiàn)腎衰竭，進展至ESRD時間最短為1年，最長13.8年，且均無腎外表現(xiàn)[8-15]。

本例患兒的臨床表現(xiàn)嚴(yán)重，在病程2月余出現(xiàn)少尿，全身高度水腫，尿素氮和血肌酐迅速增高，應(yīng)用Schwartz公式估算的GFR從86 mL/(min·1.73 m2)下降至23 mL/(min·1.73 m2)，說明腎功能急劇惡化[16]，并且對激素、利尿劑、免疫抑制劑等治療反應(yīng)差，需進行血液透析。國外已有2篇文獻報道TRPC6基因錯義變異c.395T＞C（p.Met132Thr）導(dǎo)致兒童FSGS，與本例患兒臨床表現(xiàn)的相同之處是均進展至ESRD[9,13]，推測該變異位點導(dǎo)致兒童腎衰竭的頻率較高，需引起臨床醫(yī)生的高度重視；不同之處是進展至ESRD的時間分別是9.5年和1年，且未見腎外表現(xiàn)受累的描述，然而本例患兒進展至ESRD的時間約為6個月，并出現(xiàn)循環(huán)和神經(jīng)等腎外系統(tǒng)受累的表現(xiàn)，表明TRPC6基因同一變異位點的臨床表現(xiàn)異質(zhì)性較大，提示臨床治療需個體化并注意監(jiān)測腎功能[10,13]。

本例患兒在病程7月余出現(xiàn)心力衰竭，分析原因認(rèn)為除了與貧血（血紅蛋白78 g/L）、感染（外周血白細(xì)胞22.63×109/L）、高鉀血癥（血鉀6.53 mmol/L）、水鈉潴留、透析不充分等與多種導(dǎo)致ESRD可并發(fā)心力衰竭的危險因素相關(guān)以外，還可能與TRPC6基因變異相關(guān)[17-19]。研究發(fā)現(xiàn)，TRPC6在小鼠心肌中特異性過表達導(dǎo)致胞內(nèi)鈣超載，可誘發(fā)心肌肥大和心力衰竭[20]；另有研究證實，TRPC6在心室肌細(xì)胞的蛋白表達增加，可促進心肌細(xì)胞的凋亡[21]。研究記錄細(xì)胞電流顯示，M132T變異體的內(nèi)向Ca2+電流幅度是野生型的10倍，并且與其他突變體相比，M132T變異體的離子通道在100 s內(nèi)沒有任何失活現(xiàn)象，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的鈣內(nèi)流[10]。本例患兒同樣攜帶M132T變異，故推測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的大幅增加是導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷和心力衰竭的發(fā)生的重要因素。

本例患兒在病程8月余出現(xiàn)繼發(fā)性癲癇，呈全身強直-陣攣發(fā)作，持續(xù)時間長，次數(shù)頻繁，考慮原因也與TRPC6基因變異有關(guān)。TRPC6基因在腦組織對神經(jīng)元的正常發(fā)育、樹突的生長和樹突棘的形成等神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建十分重要，該通道的穩(wěn)定表達可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性，而細(xì)胞內(nèi)過度Ca2+超載，會導(dǎo)致神經(jīng)元的異常放電和功能紊亂，提示TRPC6蛋白的異常表達可能與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)[22]。TRPC6基因致癇的分子機制尚不明確，但研究表明，在難治性顳葉癲癇患者的腦皮質(zhì)和毛果蕓香堿誘導(dǎo)的癲癇狀態(tài)的模型小鼠海馬中發(fā)現(xiàn)，TRPC6蛋白的表達明顯升高，然而在腦室注射TRPC 6抗體可降低樹突分支的數(shù)量和樹突棘的密度，從而引發(fā)突觸網(wǎng)絡(luò)的重建，TRPC6通道可能是癲癇相關(guān)突觸重構(gòu)的致病因素[23]；在導(dǎo)致頑固性癲癇病因之一的局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良患者皮質(zhì)組織中發(fā)現(xiàn)TRPC6的蛋白表達明顯升高，促進樹突細(xì)胞的生長和樹突棘及興奮性突觸的發(fā)育，提示與癲癇的發(fā)生有關(guān)[24]；在結(jié)節(jié)性硬化癥癲癇患者病灶皮層腦組織中TRPC6表達上調(diào)，提示異構(gòu)神經(jīng)元的特異性分布模式參與了致癇機制[25]。本例患兒攜帶M132T變異可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度過度升高，且通過口服丙戊酸鈉和左乙拉西坦兩種鈣通道阻滯劑的抗癲癇藥物后癇性發(fā)作得到有效控制。故推測，TRPC6基因變異可能是本例患兒出現(xiàn)癲癇發(fā)作的主要原因。

近年來研究者先后在中國激素耐藥型腎病綜合征患兒檢測到TRPC6基因變異，但患兒在隨訪過程中腎功能均未進展至ESRD[11,15]。通過WES測序技術(shù)明確本例臨床表現(xiàn)嚴(yán)重、腎功能快速惡化、進展至ESRD時間短、出現(xiàn)循環(huán)和神經(jīng)等腎外系統(tǒng)受累患兒的致病原因是TRPC 6基因新發(fā)變異c.395 T＞C（p.Met132Thr），國內(nèi)未見報道，豐富了TRPC6基因型與臨床表型。