龔美亮，鄒琳，劉云霞

(解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心：1檢驗科，2保健科，北京 100853)

銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa，PA)為醫(yī)院常見條件致病菌，常分離自患者的痰液、尿液、血液、腦脊液以及其他分泌物中，是導(dǎo)致感染性疾病的重要因素。銅綠假單胞菌耐藥機制復(fù)雜，包括天然耐藥及獲得性耐藥。隨著廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，多重耐藥銅綠假單胞菌(multidrug resistantpseudomonasaeruginosa，MDRPA)的檢出率逐年攀升，如何針對這些MDRPA所致感染進行有效治療，已成為廣大醫(yī)務(wù)工作者面臨的棘手問題。老年患者作為一個特殊群體，具有氣管切開及管路留置率高、基礎(chǔ)疾病多、免疫力低下及反復(fù)住院率高的特點，這些會增加老年患者感染PA的風(fēng)險，且有研究表明假單胞菌在老年病房內(nèi)檢出率占首位[1,2]。本研究對老年病房分離的MDRPA 菌株進行體外聯(lián)合藥物敏感試驗，以期為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年1月至2016年12月解放軍總醫(yī)院老年病房分離的MDRPA共58株。對同一患者相同部位分離的菌株不重復(fù)計算，所有菌株均經(jīng)VITEK-2 Cpmpact全自動微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)鑒定。MDRPA是指對三類或三類以上抗菌藥物中的每一類抗菌藥物至少一種藥物獲得性不敏感的PA[3]。患者年齡81～96(88.52±3.65)歲。質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853，大腸埃希菌ATCC35218，大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 儀器及試劑

恒溫培養(yǎng)箱、低溫冰箱(賽默飛世爾，美國)；比濁儀(生物梅里埃，法國里昂)；電子天平(賽多利斯，德國)；無菌96孔平板(康寧公司，紐約)；無菌瓶(浙江拱東醫(yī)療科技有限公司，臺州)；半自動多點接種儀(佐久間制作所，日本)；MH瓊脂干粉(賽默飛世爾，美國)；一次性使用培養(yǎng)皿(金典生化器材有限公司，青島)；美羅培南(meropenem，MEM)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)及頭孢吡肟(cefepime,FEP)標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，北京)。

1.3 菌懸液配置

菌株分純并37 ℃過夜培養(yǎng)，從MH 瓊脂平板上挑取3～5個菌落，在滅菌生理鹽水中制作菌懸液。菌液用比濁儀校正至0.5 MacFarland。

1.4 瓊脂平板稀釋法

將FEP、MEM及CIP分別倍比稀釋成12個濃度值，三種藥物濃度均為2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg/ml。其中FEP稀釋液為磷酸鹽緩沖液，pH 6.0，0.1 mol/L；MEM和CIP稀釋液均為無菌水。

單藥平板制備：每個濃度抗生素溶液取2 ml加入18 ml MH瓊脂溶液(約50 ℃)。聯(lián)合抗生素平板制備：將FEP分別與MEM及CIP按棋盤法設(shè)計兩兩組合加入無菌瓶中，每種抗菌藥物1 ml，再將聯(lián)合藥物加入融化并冷至50 ℃左右的18 ml MH瓊脂中制成藥平板。將配置好的菌液取200 μl加入96孔板中，用半自動多點接種儀接種至藥平板。37 ℃過夜培養(yǎng)。觀察指標(biāo)，記錄單獨應(yīng)用各藥的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)，包括MIC甲藥單用和MIC 乙藥單用，并選擇最佳組合效應(yīng)兩藥聯(lián)用時各自MIC(MIC甲藥聯(lián)用和MIC乙藥聯(lián)用)，以計算分級抑菌濃度(fractional inhibitory concentration, FIC)指數(shù)。

1.5 FIC 指數(shù)計算和判讀標(biāo)準(zhǔn)[4]

FIC 指數(shù)=MIC 甲藥聯(lián)用/MIC 甲藥單用+MIC 乙藥聯(lián)用/MIC 乙藥單用。FIC 指數(shù)≤0.5，協(xié)同作用；0.52.0，拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 藥物聯(lián)用前后對MDRPA 的MIC 比較

FEP與MEM聯(lián)用后，F(xiàn)EP的MIC50與MIC90均為單藥的1/4；MEM的MIC50為單藥的1/2，MIC90為單藥的1/4。FEP與CIP聯(lián)用后，F(xiàn)EP的MIC50與MIC90均為單藥的1/2；CIP的MIC50與MIC90均為單藥的1/4；表明各藥物組合聯(lián)用后有聯(lián)合效應(yīng)。詳見表1。

表1 頭孢吡肟與美羅培南及環(huán)丙沙星單用及聯(lián)用對MDRPA 的MICTable 1 MIC of FEP，MEM，CIP alone or combined for MDRPA (n=58, μg/ml)

2.2 濃度-累積抑菌率曲線

FEP與MEM，CIP聯(lián)用后，三種藥物的濃度-累積抑菌率曲線均表現(xiàn)為左移，表明聯(lián)用藥物組合具有聯(lián)合效應(yīng)(圖1，2)。

圖1 頭孢吡肟與美羅培南聯(lián)用的濃度-累積抑菌率曲線Figure 1 Concentration-accumulative inhibition rate curves for FEP combined with MEMFEP：cefepime；MEM：meropenem.

圖2 頭孢吡肟與環(huán)丙沙星聯(lián)用的濃度-累積抑菌率曲線Figure 2 Concentration-accumulative inhibition rate curves for FEP combined with CIPFEP：cefepime；CIP：ciprofloxacin.

2.3 FIC分布情況

FEP與MEM聯(lián)用時，表現(xiàn)為協(xié)同作用32.8%，相加作用46.6%；FEP與CIP聯(lián)用時，表現(xiàn)為協(xié)同作用20.7%，相加作用51.7%。表明上述兩種組合均有一定的聯(lián)合效應(yīng)。各組藥物聯(lián)用對MDRPA 的FIC 指數(shù)分布詳見表2。

表2 頭孢吡肟分別與美羅培南、環(huán)丙沙星聯(lián)用對MDRPA的FIC指數(shù)Table 2 FIC indices of FEP combined with MEM or CIP [n=58, n(%)]

3 討 論

PA廣泛存在于自然界和醫(yī)院環(huán)境內(nèi)，環(huán)境適應(yīng)力極強，為重要的院內(nèi)條件致病菌，老年病房內(nèi)更為普遍。PA耐藥機制復(fù)雜，幾乎具有目前所知細菌的主要耐藥機制。老年患者在PA感染率高的同時，大劑量和高頻率的應(yīng)用廣譜抗生素，更易選擇出多重耐藥菌株[5]。隨著PA的耐藥率逐年升高，傳統(tǒng)的單藥治療模式已經(jīng)很難收到良好效果，聯(lián)合用藥可降低單一用藥劑量，從而減少不良反應(yīng)[6]，兩種甚至更多種抗生素聯(lián)合應(yīng)用已成為趨勢。

FEP為第四代頭孢菌素，與第三代頭孢菌素相比，抗菌譜更廣，可更快速穿透革蘭陰性桿菌細胞膜，結(jié)合多種青霉素結(jié)合蛋白發(fā)揮作用；對細菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶具有更高穩(wěn)定性以及更低誘導(dǎo)作用，且對可分解第三代頭孢菌素的AmpC 酶有良好作用。FEP因其高效性成為研究的熱點，有研究表明其治療老年呼吸道感染有效性高[7]。MEM屬于碳青霉烯類抗生素，曾是治療PA感染的殺手锏，能夠通過抑制細菌細胞壁的合成而對PA產(chǎn)生抗菌作用，故本研究選取上述兩種藥物作為聯(lián)合藥敏組合。上述兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用后，MIC50及MIC90均較單藥應(yīng)用明顯下降，濃度-累積抑菌百分率曲線左移，相加及協(xié)同作用達到79.4%，證明兩種藥物適合聯(lián)合應(yīng)用。亓芳等[8]認(rèn)為MEM與其他藥物聯(lián)合治療MDRPA效果較好，與本研究結(jié)論一致。在安全性方面，張巧趁[9]曾報道MEM聯(lián)合頭孢類抗生素治療臨床效果確切，不良反應(yīng)小，安全性較高。而本研究隨著濃度-累積抑菌百分率曲線左移，兩種藥物治療濃度均相應(yīng)下降，也保證了聯(lián)合用藥的安全性。

喹諾酮類藥物作用的靶酶為細菌的DNA回旋酶及拓撲異構(gòu)酶Ⅳ，抑制細菌的DNA復(fù)制而導(dǎo)致細菌死亡[10]。但隨著喹諾酮類藥物使用的增加，耐藥率也隨之升高。因為細菌DNA 螺旋酶gyrA 基因和拓撲異構(gòu)酶IV parC 基因中某些保守區(qū)域的單個基因突變可造成氟喹諾酮類藥物耐藥。有研究表明[11]gyrA 和parC 基因突變都與細菌對CIP高水平耐藥(MIC≥16 μg/ml)相關(guān)，本研究所選的部分MDRPA對CIP高水平耐藥，可能與此機制相關(guān)。FEP與CIP聯(lián)合后，相加及協(xié)同作用共為72.4%，取得了很好的效果，并且在聯(lián)合用藥后，MIC50及MIC90明顯下降。而在劉春都等[12]研究中上述兩種藥物聯(lián)合后主要表現(xiàn)為無關(guān)作用?？赡苡捎谒x菌株雖同為MDRPA，但具體耐藥機制仍有差異。亦有研究表明在我國不同地區(qū)用藥不同，細菌耐藥性亦存在較大差異[13]。

綜上，本研究將FEP分別與MEM和CIP聯(lián)合對臨床分離的MDRPA進行體外藥物敏感試驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EP分別與二者聯(lián)合用藥后主要表現(xiàn)為協(xié)同及相加作用，比單獨應(yīng)用時MIC50和MIC90明顯下降，相加及協(xié)同作用均在70%以上，表明上述藥物組合對MDRPA具有很好的體外抗菌活性，可作為參考。但由于不同地區(qū)細菌耐藥性存在差異，故應(yīng)重視臨床藥敏結(jié)果。目前多種抗生素聯(lián)合應(yīng)用已成為應(yīng)對MDRPA感染的一個有效手段，愿老年患者能在我們的不斷探索中獲益。