鄭之俊 肖 偉 梁發(fā)俊 章顯寶 王 震

安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腦病六科，合肥 230061

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種與衰老密切相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，導(dǎo)致該病的因素較多，如遺傳因素、環(huán)境因素、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激[1]、興奮性氨基酸作用等，具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。其基本病理變化為黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元及其他含色素的神經(jīng)元大量變性丟失、殘留的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)嗜酸性包涵體即路易小體的形成，伴有紋狀體多巴胺含量顯著減少，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、肌張力增高等[2]。目前對(duì)于PD多首選藥物治療，也有以神經(jīng)核毀損術(shù)為代表的癥狀性治療，但均不能取得滿意遠(yuǎn)期療效。本課題組基于“腸腦軸”理論選取相應(yīng)穴位針刺治療PD模型大鼠，觀察其對(duì)中腦黑質(zhì)TH蛋白及相關(guān)炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響，旨在探討針刺對(duì)PD治療作用及其相應(yīng)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體(specefic pathogen free，SPF)級(jí)SD健康成年雄性大鼠40只，體重220～300 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(皖)2017-001，于安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房喂養(yǎng)。將大鼠隨機(jī)分為針刺組、模型組、假手術(shù)組、正常組，每組10只。

1.2 主要試劑與儀器

魚藤酮(Sigma公司)、DMSO(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、10%水合氯醛(1 g水合氯醛倒入9 g蒸餾水中配置)、兔抗鼠TH單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，BA1051)、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，BA1054)、β-actin抗體(Zsbio公司，18AV0311)、ECL底物液(Thermo公司，SF249607)、丙烯酞胺(Amresco公司，Exp201609)、甲叉雙丙烯酞胺(Amresco公司，Amresc00172)、RIPA裂解液(Beyotime公司，051018180717)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，P0010)、PVDF膜(Milipore公司，R8CA8257E)、一次性無(wú)菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，0.30 mm×13 mm)。

電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-7C)、垂直電泳槽(北京六一儀器廠，DYCZ-24DN)、電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠，DYCZ-40)。

1.3 造模方法

參照文獻(xiàn)[3]采用魚藤酮頸背部皮下注射法制備魚藤酮帕金森病大鼠模型，模型組和針刺組大鼠皮下注射魚藤酮溶液(1 mg/kg)，假手術(shù)組皮下注射1 mg/kg 0.9%氯化鈉注射液和DMSO混合液(0.9%氯化鈉注射液：DMSO=1：7)，1次/d，連續(xù)注射14 d，正常組不進(jìn)行特殊干預(yù)。

造模成功標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行判定：造模后大鼠出現(xiàn)典型的毛色變黃變臟，運(yùn)動(dòng)遲緩，弓背姿勢(shì)，反應(yīng)遲鈍，并出現(xiàn)肌強(qiáng)直伴震顫，癥狀呈進(jìn)行性加重等表現(xiàn)，即為造模成功。

1.4 干預(yù)方法

針刺組取穴為雙側(cè)“上巨虛”穴、雙側(cè)“天樞”穴及“大腸俞”穴，“上巨虛”取膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨頭下約10 mm處；“天樞”取大鼠的肚臍眼旁5 mm處；“大腸俞”取大鼠腰部第4腰椎棘突下旁開5 mm。造模成功后，將大鼠四肢固定于自制鼠板上，固定器固定大鼠頭部，在其清醒狀態(tài)下，常規(guī)消毒針刺部位后，針刺組大鼠采用0.3 mm×13 mm一次性無(wú)菌針灸針斜刺3 mm。每日上午進(jìn)行針刺治療，20 min/次，1次/d，7 d為一個(gè)療程，一個(gè)療程結(jié)束后休息1 d，共治療2個(gè)療程。其余各組大鼠自由進(jìn)食及飲水，抓取、固定時(shí)間同針刺組。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

各組大鼠均進(jìn)行行為學(xué)爬桿實(shí)驗(yàn)[5]，準(zhǔn)備一根長(zhǎng)60 cm、直徑3 cm的圓柱形木桿，外纏醫(yī)用膠布以保證足夠摩擦力。各組實(shí)驗(yàn)大鼠安靜環(huán)境適應(yīng)15 min后，實(shí)驗(yàn)人員手持大鼠尾巴，將大鼠頭朝下倒立放于木桿頂端，記錄大鼠從木桿頂端爬至木桿桿底時(shí)間。大鼠不能抓緊木桿，直接掉落，記為2.0分；大鼠滑行后掉落，記為1.5分；大鼠于木桿上間歇停頓數(shù)次爬至木桿桿底，尚可抱緊，記為1分；大鼠呈螺旋狀一步一步向下爬行，兼有后肢滑行，記為0.5分；大鼠四肢并用，一次性從木桿頂端爬至木桿桿底，記為0分。

比較各組大鼠黑質(zhì)區(qū)TH、p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達(dá)，采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。各組大鼠經(jīng)相應(yīng)處理結(jié)束后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速斷頭處理，取出大腦，冰面上迅速分離黑質(zhì)，于-80 ℃冰箱保存。將腦組織放于預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入裂解液冰浴勻漿，勻漿液于4 ℃條件下，15 000 r/min離心14 min后吸取上清液。根據(jù)蛋白分子量配置成12%的聚丙烯酞胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為IL-1β 200 mA，50 min；TNF-α、IFN-γ 200 mA，60 min；TH、p-c-Jun，200 mA，90 min；封閉，用封閉液稀釋對(duì)應(yīng)的一抗，將PVDF膜浸泡于一抗4 ℃溶液中孵育過(guò)夜。IL-1β、p-c-Jun、TH采用1：200的比例稀釋，TNF-α、IFN-γ采用1：800的比例稀釋；二抗，用封閉液稀釋后，用相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗按1：40 000的比例稀釋。將PVDF膜浸泡于稀釋后的二抗孵育液中，在37 ℃的溫度下?lián)u床孵育2 h；顯色曝光，放置在X線膠片中壓片，之后依次放入顯影液和定影液中顯影、定影。采用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，以目標(biāo)條帶的吸光度值與β-actin條帶吸光度值之比為TH、p-c-Jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)情況比較

針刺組、模型組大鼠在注射魚藤酮后出現(xiàn)四肢肌張力增高、震顫，毛色干枯稀疏、變黃變臟及拒捕行為減弱等表現(xiàn)，并逐漸加重。正常組及假手術(shù)組大鼠飲食如常，喜活動(dòng)，善打斗，皮毛光滑。

正常組和假手術(shù)組大鼠均能夠一次性順利、從木桿頂端爬到木桿底。模型組、針刺組大鼠在注射魚藤酮7天后，表現(xiàn)為抱桿不穩(wěn)，甚則墜落，14天后更明顯。針刺組大鼠治療后7天后，雖然爬桿實(shí)驗(yàn)仍表現(xiàn)為抱桿不穩(wěn)，但針刺組大鼠自發(fā)性活動(dòng)增多，較治療前改善；針刺治療14天后，針刺組大鼠雖容易滑落，但能夠抱桿，較前進(jìn)一步改善。

2.2 大鼠黑質(zhì)區(qū)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

與正常組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠TH蛋白表達(dá)明顯減少，p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，針刺組大鼠TH蛋白表達(dá)明顯增加，p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠黑質(zhì)區(qū)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

根據(jù)本病臨床表現(xiàn)，可將其歸類于“顫證”、“痙證”等范疇?！鹅`樞·經(jīng)脈》記載“胃足陽(yáng)明之脈，起于鼻之交頞中……循發(fā)際，至額顱”，《靈樞·動(dòng)輸》記載“胃氣上注于肺……入絡(luò)腦”，張仲景在《傷寒論》中多次提出陽(yáng)明腑實(shí)證致神志變化；由此可見(jiàn)，胃腸與腦在經(jīng)脈循行上密切相關(guān)，胃腸功能異?？蓪?dǎo)致神志疾病的發(fā)生。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腦神與胃腸功能密切相關(guān)，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中“腸腦軸”觀念不謀而合[6]。

“腸腦軸”為大腦與腸道之間功能整合的雙向信息交流系統(tǒng)，涉及神經(jīng)通路、免疫和內(nèi)分泌機(jī)制[7]。唐莉莉[8]、馬盈盈[9]等基于“腸腦軸”學(xué)說(shuō)采用相應(yīng)中醫(yī)藥手段治療PD患者，發(fā)現(xiàn)以腸道為靶點(diǎn)治療PD，可減輕患者臨床癥狀，改善腸道菌群，調(diào)節(jié)血液中腦腸肽水平。因此，本研究選取針刺大腸經(jīng)募穴天樞、大腸經(jīng)下合穴上巨虛、大腸經(jīng)背俞穴大腸俞治療PD模型大鼠，旨在基于“腸腦軸”理論，通過(guò)改善胃腸功能來(lái)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

PD的典型病理特征為黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元及其他含色素的神經(jīng)元大量變性丟失、殘留的神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體。越來(lái)越多研究[10-11]表明，神經(jīng)炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)毒性在PD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用；通過(guò)降低炎癥因子水平，可以對(duì)PD起到一定的治療作用。有學(xué)者[12-13]認(rèn)為，p-c-Jun是JNK信號(hào)通路的活性底物，與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，并與PD發(fā)病密切相關(guān)。TH是多巴胺合成的限速酶，能夠有效預(yù)防PD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，TH表達(dá)減少可導(dǎo)致多巴胺的損傷，從而導(dǎo)致PD的發(fā)生[14]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠TH蛋白表達(dá)明顯減少，p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達(dá)明顯增加；表明帕金森病大鼠造模成功后，大鼠黑質(zhì)區(qū)TH蛋白表達(dá)上調(diào)，p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達(dá)下調(diào)。與模型組比較，針刺組大鼠TH蛋白表達(dá)明顯增加，p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達(dá)明顯減少；表明針刺治療可能通過(guò)降低p-c-jun水平，減少炎癥介質(zhì)TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表達(dá)，增加帕金森大鼠黑質(zhì)區(qū)TH蛋白含量，從而改善魚藤酮對(duì)PD大鼠神經(jīng)元造成的損傷。與王述菊等[15]的研究結(jié)果相一致，表明針刺可能通過(guò)調(diào)節(jié)PD模型大鼠體內(nèi)MAPK/JNK信號(hào)通路，降低p-c-jun在黑質(zhì)區(qū)的表達(dá)，減少PD模型大鼠炎癥因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β的表達(dá)，從而對(duì)PD的發(fā)生發(fā)展可起到一定的治療作用。

綜上所述，針刺可下調(diào)PD模型大鼠黑質(zhì)區(qū)JNK表達(dá)，降低炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β水平，對(duì)PD有一定的調(diào)節(jié)作用。