林 蓁 楊文圣 尹可能

世界因肝癌致死的病例占惡性腫瘤死亡原發(fā)性的第3位，我國居第2位。每年約有25萬人死于此病，其中約40%發(fā)生在中國[1]。通過阻斷腫瘤細胞的免疫逃逸最終殺滅肝癌細胞的免疫治療，可能是目前已知最具臨床前景能較完全殺滅肝癌細胞的治療手段。本文通過PD-L1檢測探討其在原發(fā)性肝細胞肝癌表達情況及在免疫治療上意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院2017年10月至2019年10月間，經(jīng)病理診斷確診為原發(fā)性肝細胞肝癌病例95例做測試組，其中男性77例，女性18例，年齡26～84歲，平均年齡56歲。 經(jīng)病理診斷確診為肝臟良性腫瘤病例20例做對照組，其中男性9例，女性11例，年齡22～83歲，平均年齡45歲。扁桃體組織10例及試劑盒內(nèi)陽性、陰性細胞片做試劑內(nèi)對照組。

1.2 主要儀器

Dako公司 Autostainer Link 48自動免疫組織化學(xué)染色儀 、全自動免疫組化預(yù)處理儀(PT Link，PT200)。

1.3 主要試劑

Dako公司EnVinsion FLEX(PD-L1 IHC 22C3)套裝試劑盒：包括Linker Anti-Mouse、DAB Enhancer、VisualizationI Reagent-HRP、Monoclonal Mouseanti-PD-L1 Clone 22C3、Peroxidase-Blocking Reageagent、Negative Control Reagent、Target Retrieval Solution Low pH(50×)、DAB+Chromogen、DAB+Substrate Buffer、 Control Slides等試劑。

1.4 組織蠟塊切片

取上述測試組、對照組組織蠟塊，將蠟塊3 μm切片各兩張，裱在防脫載玻片上，所有蠟塊均分蠟塊檢測組、蠟塊陰性對照組，組織切片65 ℃烤片30 min，二甲苯脫蠟，經(jīng)梯度乙醇至水化后待用。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

1.5.1 免疫組織切片抗原修復(fù) 使用Dako 全自動免疫組化預(yù)處理儀，進行組織切片及細胞片抗原修復(fù)。程序：根據(jù)編輯程序打印相關(guān)條形碼，蠟塊測試及蠟塊陰性對照片各一張，每例病例分組貼好不同條形碼。將EDTA (pH 9.0，50×)組織修復(fù)液裝入自動免疫組化預(yù)處理儀中扣上儀器蓋，按啟動鍵將修復(fù)液加熱預(yù)溫到65 ℃后，打開儀器蓋將組織切片及細胞片浸沒入修復(fù)液中，繼續(xù)啟動預(yù)處理程序進行98 ℃ 20 min的抗原修復(fù)；程序結(jié)束后，將組織切片及細胞片pH 7.2～7.4 PBS緩沖液洗滌3 min，蒸餾水洗滌1 min。

1.5.2 免疫組化PD-L1(22C3)蛋白檢測 使用Dako Autostainer Link 48自動免疫組織化學(xué)染色儀，Dako EnVinsion FLEX(PD-L1 IHC 22C3)套裝試劑盒上機檢測(室溫22～25 ℃)，染色主要步驟：將已經(jīng)修復(fù)好的組織切片及細胞片上機掃描開始染色，內(nèi)源性過氧化物酶封閉5 min，pH 7.2～7.4 Buffer沖洗；一抗PD-L1(22C3)室溫孵育30 min(陰性對照片不需要加一抗)，pH 7.2～7.4 Buffer沖洗1 min；二抗室溫孵育30 min，pH 7.2～7.4 Buffer沖洗1 min；VisualizationI Reagent-HRP室溫孵育30 min，pH 7.2～7.4 Buffer沖洗1 min；DAB室溫顯色5 min×2；pH 7.2～7.4 Buffer沖洗1 min；擴大劑室溫5 min；pH 7.2～7.4 Buffer沖洗1 min；蘇木精復(fù)染 1 min，無水乙醇脫水，電吹風(fēng)微風(fēng)吹干，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析，比較肝臟良、惡性腫瘤檢測陽性百分率差異性，計數(shù)資料采用卡方χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

由2名高年資醫(yī)師共同判讀結(jié)果，PD-L1(22C3)免疫組化標(biāo)記陽性定位在腫瘤細胞膜，實驗根據(jù)腫瘤比例評分(TPS)為判讀標(biāo)準(zhǔn)，指部分或完整膜染色的腫瘤細胞占樣品中存在的所有活腫瘤細胞的百分比(PD-L1染色陽性腫本組瘤細胞數(shù)/總活腫瘤陰性和陽性細胞數(shù))，判讀中應(yīng)排除任何免疫細胞、基質(zhì)細胞、壞死細胞的陽性表達。判讀前，先對扁桃體組織、陽性、陰性細胞片及蠟塊陰性對照片等進行評估，符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)后，再繼續(xù)進行判讀。測試組cutoff值，TPS≥1%為陽性，有9例，其中PD-L1高表達，有2例；TPS：1%～49%低表達，有5例。cutoff值，TPS<1%或無腫瘤細胞表達PD-L1蛋白為陰性，有87例。 PD-L1蛋白陽性表達及表達強度，與腫瘤分化程度無明顯相關(guān)性。對照組：20例良性病例，cutoff值TPS<1%或無腫瘤細胞表達PD-L1蛋白，均為陰性。測試組與對照組，PD-L1蛋白檢測陽性表達差別顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

相關(guān)肝細胞肝癌PD-L1研究的文獻不少，免疫組化檢測PD-L1作為肝細胞肝癌的免疫治療生物學(xué)靶點是很有前景[2]。目前針對PD1/PD-L1通路阻斷劑在肝癌治療中的作用的臨床研究亦很多，研究編號有：NCT02576509、NCT02837029、NCT02702401、NCT0265-8019等[3]。有Truong等[4]有相關(guān)報道，一老年男性轉(zhuǎn)移性HCC患者，Sorafinib治療后失敗，接受6個周期Pembrolizumab治療后，腫瘤大小明顯減小，甲胎蛋白明顯下降，此類病例提示Pembrolizumab等免疫治療有望為晚期HCC患者帶來新的福音。

PD-L1表達水平目前是受到廣泛認可的PD1/PD-L1抑制劑療效預(yù)測標(biāo)志物，但PD-L1檢測存在缺乏一致性與檢測金標(biāo)準(zhǔn)的缺陷[5]。肝細胞肝癌PD-L1靶向治療的伴隨診斷判讀閾值等亦尚未達到比較統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，目前有文獻在肝細胞肝癌采用其它腫瘤的評判標(biāo)準(zhǔn)[2]。不同藥商廠家使用免疫治療藥物進行臨床試驗時，采用不同廠家PD-L1抗體，并在不同平臺上進行，沒有統(tǒng)一的抗體型號、統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的檢測平臺、統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒。由于PD-L1抗體類型的多樣性，國內(nèi)使用的PD-L1抗體有多個克隆號包括22C3、SP142、SP263、73-10等，染色方法和染色平臺也缺乏規(guī)范化和統(tǒng)一性。PD-L1的表達與免疫治療的療效顯著相關(guān)，可作為篩選免疫治療潛在獲益人群的一項指標(biāo)，由此獲得準(zhǔn)確、可靠的PD-L1檢測結(jié)果對免疫治療的選擇至關(guān)重要[6]。為了節(jié)約極為有限的腫瘤標(biāo)本，節(jié)約檢測費用與檢測次數(shù)，縮短無意義重復(fù)檢測所耗費的時間，臨床迫切希望得到各檢測抗體之間的相關(guān)性及一致性研究結(jié)果，從而使PD-L1檢測的臨床應(yīng)用及其治療決策的指導(dǎo)變得更為簡便[7]。

由于免疫治療抗PD-L1藥物需要應(yīng)用于臨床與治療主要依據(jù)免疫染色相關(guān)的PD-L1檢測結(jié)果，因此PD-L1檢測更需要提高其規(guī)范化和重復(fù)性。關(guān)于PD-L1檢測，需要專門的檢測平臺，專門克隆號的抗體及配套的試劑盒，專門的培訓(xùn)及規(guī)范的檢測流程。本次實驗我們選擇Dako North America 的“PD-L1”(22C3)檢測試劑盒(免疫組化法)，這也是目前在中國獲批的PD-L1檢測試劑盒。其中抗體22C3，常作為其它抗體的參照法[2]。同時我們使用與之配套的檢測平臺Dako Autostainer Link 48免疫組化染色儀，這也從最基礎(chǔ)前提上保證實驗檢測的可行性，結(jié)果準(zhǔn)確的基本保證。

22C3抗體染色腫瘤組織，以任意膜染色強度(≥1%)為陽性指標(biāo)，根據(jù)腫瘤比例評分(TPS)的3個等級(TPS<1%：PD-L1不表達；TPS 1%～49%：PD-L1低表達；TPS≥50%：PD-L1高表達)作為Pembrolizumab的用藥指標(biāo)[8]。不同醫(yī)師判讀結(jié)果可能導(dǎo)致不同的治療選擇，因此真實臨床實踐中應(yīng)加強規(guī)范化檢測、嚴(yán)謹(jǐn)統(tǒng)一的判讀標(biāo)準(zhǔn)及對病理醫(yī)師進行判讀標(biāo)準(zhǔn)的培訓(xùn)[6]。結(jié)果的判讀在光學(xué)顯微鏡下觀察，先確定陰性、陽性對照表達定位正確清晰易辨，才可對檢測標(biāo)本進行判讀，作為對照組的扁桃體組織PD-L1標(biāo)記要求不同程度中等強度的表達。對腫瘤細胞數(shù)量較少的穿刺標(biāo)本，判讀的腫瘤細胞必須不少于100個。對定位或顯色不正確的病例應(yīng)重新進行標(biāo)記，如周邊效應(yīng)。目前PD-L1檢測主要在組織標(biāo)本上進行，因其表達具有異質(zhì)性，檢測時應(yīng)優(yōu)先選擇手術(shù)標(biāo)本；如果患者不能進行手術(shù)切除，也可考慮穿刺組織標(biāo)本；當(dāng)腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的，選擇復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的標(biāo)本。實驗肝細胞肝癌PD-L1的檢測結(jié)果顯示，PD-L1表達于陽性病例中有高分化、中分化及低分化病例，PD-L1強度與腫瘤分化程度無明顯相關(guān)性，低分化病例PD-L1表達不一定強陽性，高分化PD-L1表達也不一定弱陽性。

為保證實驗質(zhì)量進行反復(fù)預(yù)試驗，需有經(jīng)過一定數(shù)量的組織檢測，優(yōu)化程序以探索最佳的染色方案。我們使用Autostainer Link 48自動免疫組織化學(xué)染色儀，及 Dako EnVinsion FLEX(PD-L1 IHC 22C3)套裝試劑盒，為實驗規(guī)范化提供最基礎(chǔ)的保障。全自動免疫組化預(yù)處理儀(PT Link，PT200)對組織切片進行98 ℃ 20 min組織抗體修復(fù)，效果較佳。免疫組化程序中DAB顯色進行2次重復(fù)顯色步驟，既保證顯色充分也防止DAB非特異性顆粒吸附，效果較單次DAB顯色佳。本文通過對原發(fā)性肝細胞肝癌進行PD-L1規(guī)范化免疫組化標(biāo)記，了解PD-L1在原發(fā)性肝細胞肝癌中表達的特征，這將對臨床在原發(fā)性肝細胞肝癌的免疫治療研究具有十分重要的意義。