賀晶 楊月明 劉伶 王東

（1.大連醫(yī)科大學研究生院，遼寧大連 116000；2.大連市婦女兒童醫(yī)療中心血液腫瘤科，遼寧大連 116000）

臍血（umbilical cord blood, UCB）富含造血干/祖細胞（hematopoietic stem and progenitor cell,HSPC），在臨床應(yīng)用中，已證明移植輸注的有核細胞總數(shù)（total nucleated cell, TNC）和CD34+細胞數(shù)量是快速植入和延長生存期的主要預(yù)測指標[1]，且與中性粒細胞恢復(fù)明顯相關(guān)[2]。因此，UCB 庫傾向于選擇TNC 和CD34+細胞數(shù)量較高的UCB，具體數(shù)值規(guī)定因臍血庫而異。但單份UCB 中TNC和CD34+細胞數(shù)量有限，更適用于治療低出生體重兒[3]。本研究通過分析除胎齡外其他圍生期因素與UCB 中TNC、CD34+細胞計數(shù)的關(guān)系，作為UCB 庫合理選擇UCB 的參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究納入2019 年6 月至2020 年1 月大連市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)科無先天性疾病的健康孕婦，經(jīng)孕婦或家屬知情同意后，采集其分娩新生兒的UCB 用作科學研究。排除娩出的死亡/畸形新生兒。

1.2 一般資料收集

采用醫(yī)院信息采集系統(tǒng)調(diào)查和收集圍生期的相關(guān)信息，內(nèi)容主要包括：孕母年齡、孕母血型（A/B/AB/O 型）、妊娠糖尿?。℅DM）（無/有）、妊娠高血壓（PIH）（無/有）、受孕方式（自然妊娠/輔助生殖）、分娩方式（順產(chǎn)/剖宮產(chǎn)）、單胎/雙胎，新生兒體重、性別、生后Apgar 評分（正常/異常），以及胎盤（正常/異常）、羊水胎糞污染（無/有）、臍帶繞頸或身體其他部位（無/有）。所獲得的調(diào)查資料雙份錄入自行創(chuàng)建的Excel 表格。

孕期疾病包括GDM、PIH，由我院產(chǎn)科醫(yī)師于妊娠期間診斷，GDM 診斷標準參考第9 版《婦產(chǎn)科學》[4]及《妊娠合并糖尿病診治指南（2014）》[5]，PIH 診斷標準參考第9 版《婦產(chǎn)科學》[4]及《妊娠期高血壓疾?。簢H妊娠期高血壓研究學會分類、診斷和管理指南（2018）》解讀[6]。羊水胎糞污染、臍帶繞頸、Apgar 評分在胎兒分娩后由我院產(chǎn)科及新生兒科醫(yī)師共同評估。

1.3 UCB 采集

在大連市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)房或手術(shù)室收集新生兒UCB 130 份（2～3 mL/份）。新生兒斷臍后10 s 內(nèi)行UCB 采集：選擇距離胎盤斷端約5～8 cm，用碘伏消毒兩遍，消毒范圍4～5 cm，穿刺針頭斜面朝下或側(cè)面小角度刺入，見血后沿血管壁順行1～2 cm，采UCB 2～3 mL，止血鉗夾閉穿刺點上端血管，取下針頭，邊采邊混勻，填寫標本信息，4℃冰箱暫時存放，并于24 h 內(nèi)檢測。

本課題獲得產(chǎn)婦及家屬知情同意，并經(jīng)大連市婦女兒童醫(yī)療中心倫理委員會批準（2019015）。

1.4 TNC 計數(shù)

采用XN-350 全自動血液分析儀計數(shù)UCB 標本中的TNC。

1.5 流式細胞儀檢測CD34+細胞占TNC 比例

根據(jù)細胞計數(shù)計算UCB 所需標本量（加入細胞數(shù)約2×106個），樣品管中加入10 μL CD45 PercP 和20 μL CD34PE，震蕩，混勻，室溫避光孵育20 min，加1～3 mL 裂解液，震蕩混勻，避光裂解10 min。以1 500 r/min 離心5 min，棄上清。各管加3～5 滴PBS 重懸，標記細胞用CantoII 流式細胞儀上機檢測。通過質(zhì)控品檢測保證儀器運行狀態(tài)正常。應(yīng)用Diva 軟件進行數(shù)據(jù)分析，取CD45弱陽、CD34 陽性、前向角散射較淋巴細胞大的細胞占CD45+細胞的比例，為CD34+細胞占TNC比例。

1.6 計算CD34+細胞數(shù)量

CD34+細胞數(shù)量=TNC×CD34+細胞占TNC比例。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標準差（±s,）表示，兩組間比較采用成組t檢驗；非正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）] 表示，組間比較采用U檢驗或Kruskal-WallisH檢驗。Pearson 相關(guān)性分析描述兩個連續(xù)變量之間的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

采集到的130 例UCB 標本中，早產(chǎn)兒57 例（42.5%），足月兒73 例（57.5%）；單胎118例（90.8%），雙胎12 例（9.2%）；順產(chǎn)116 例（89.2%），剖宮產(chǎn)14 例（10.8%）；自然妊娠112 例（86.2%），輔助生殖18 例（13.8%）；男65 例，女65 例，男女比例為1 : 1；早產(chǎn)兒的平均出生體重為（2 488±560）g，足月兒平均出生體重為（3 354±395）g，其中包括5 個極低出生體重兒（＜1 500 g）。

2.2 母嬰因素對UCB 中TNC 及CD34+ HSPC的影響

孕母情況：孕母平均年齡為（30±4）歲，相關(guān)性分析提示孕母年齡與UCB 中TNC 無明顯相關(guān)性（r=0.132，P=0.134），與CD34+細胞計數(shù)呈正相關(guān)（r=0.262，P=0.003）。本研究納入130 例新生兒母親的血型均為Rh 陽性，A 型36 例（27.7%），B 型37 例（28.5%），AB 型15 例（11.5%），O 型42 例（32.3%），不同孕母血型的UCB 中TNC、CD34+細胞計數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

妊娠期疾?。?7 例（28.5%）孕母患有GDM，有無GDM 孕母的UCB 中TNC、CD34+細胞計數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。GDM孕母分娩新生兒體重為（2 973±699）g，無GDM孕母分娩新生兒體重為（2 975±619）g，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.018，P=0.986）。16例（12.3%）孕母患有PIH，有無PIH 孕母的UCB中TNC 及CD34+細胞計數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

受孕方式及分娩方式：受孕方式中，112 例（86.2%）為自然妊娠，18 例（13.8%）為輔助生殖；分娩方式中，116 例（89.2%）為順產(chǎn)，14 例（10.8%）為剖宮產(chǎn)。不同受孕方式及分娩方式下，UCB 中TNC、CD34+細胞計數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

單胎/雙胎：12 例（9.4%）新生兒為6 對異卵雙胞胎，無同卵雙胞胎標本，無三胎及以上新生兒UCB，單胎與雙胎UCB 中，TNC、CD34+細胞計數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

新生兒情況：男65 例（50.0%），女65 例（50.0%），不同性別新生兒的UCB 中TNC、CD34+細胞計數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。新生兒平均出生體重為（2 974±640）g，出生體重與TNC、CD34+細胞計數(shù)無明顯相關(guān)性（分別r=-0.113，P=0.201；r=-0.159，P=0.070）。126例（96.9%）新生兒生后Apgar 評分正常（8～10分），其中117 例（90.0%）生后1、5、10 min Apgar 評分均為10 分，4 例Apgar 評分（3.1%）異常，Apgar 評分正常及異常新生兒UCB 中TNC及CD34+細胞計數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

其他：130 例UCB 標本中，102 例（78.5%）胎盤形態(tài)正常，28 例（21.5%）胎盤形態(tài)異常（如球拍狀胎盤、副胎盤等），胎盤正常與異常組間UCB 的TNC、CD34+細胞計數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。53 例（40.8%）有臍帶繞頸或身體其他部位，有無臍帶繞頸或身體其他部位組間UCB 的TNC 及CD34+細胞計數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。5 例（3.8%）有羊水胎糞污染情況，有無胎糞污染組間UCB 的TNC 及CD34+細胞計數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 母嬰因素與UCB 中TNC 及CD34+細胞計數(shù)的關(guān)系 [M（P25，P75）]

續(xù)表1

3 討論

自1988 年Gluckman 等[7]對一名范科尼貧血患兒首次成功進行UCB 移植以來，UCB 移植治愈了數(shù)百例血液系統(tǒng)惡性腫瘤或影響造血系統(tǒng)的遺傳疾病[8]。與其他來源相比，UCB 具有許多優(yōu)勢：病毒污染的發(fā)生率少；可快速獲得、長期保存；移植物抗宿主發(fā)生率較低，患者生存質(zhì)量高；免疫原性較弱，可耐受非血緣 HLA1-2/6 個位點不合的移植等[9-11]。

本文采集母嬰因素并分析各因素對UCB 中TNC、CD34+細胞計數(shù)的影響，以優(yōu)化UCB 獻血者的選擇。迄今為止，產(chǎn)婦年齡對UCB HSPC 的影響爭議比較大。Bielec-Berek 等[12]（n=50）研究結(jié)果證明產(chǎn)婦年齡與CD34+細胞計數(shù)無明顯相關(guān)性。另外有報告產(chǎn)婦年齡是HSPC 濃度的影響因素[13]。本研究提示孕母年齡與UCB 的CD34+細胞計數(shù)呈正相關(guān)。分析原因為：本研究中孕母年齡分布在21～40 歲，大多數(shù)（93.8%）分布在25 歲以上，而女性25歲以后皮膚及身體各項機能開始慢慢變老，體內(nèi)會產(chǎn)生過多的自由基，從而導(dǎo)致造血細胞增加。

孕期疾病：有研究發(fā)現(xiàn)GDM 不是影響UCB中TNC 的 因 素[14]，Hadarits 等[15]證 明GDM 產(chǎn)婦UCB 中CD34+細胞含量較多，Kong 等[16]報道GDM 母親的UCB 膠質(zhì)干細胞的分化潛能、氧化應(yīng)激能力降低。本研究發(fā)現(xiàn)患GDM 產(chǎn)婦的UCB中TNC 及CD34+細胞計數(shù)與未患GDM 相當，與Hadarits 等[15]的研究存在差異，可能與本研究納入的GDM 產(chǎn)婦飲食及運動血糖控制良好有關(guān)。有研究[17-18]（n=5 713）提示患有PIH 不會影響UCB中TNC 及CD34+細胞計數(shù)，而Nordin 等[19]（n=70）及Ahmed 等[20]（n=50）研究發(fā)現(xiàn)先兆子癇組的造血干細胞中CD34+細胞計數(shù)低于對照組。本研究結(jié)果為患PIH 母親的UCB 中TNC 及CD34+細胞計數(shù)與未患PIH 相當。

目前關(guān)于分娩方式對UCB 影響的研究較多，但結(jié)果不盡相同。有研究發(fā)現(xiàn)陰道分娩UCB 質(zhì)量優(yōu)于剖宮產(chǎn)[21]，另有研究證明剖宮產(chǎn)UCB 中CD34+細胞數(shù)量較陰道分娩高[22]，而一些研究發(fā)現(xiàn)分娩方式不影響CD34+細胞的含量[23-25]。這些差異可能與種族、民族及地域相關(guān)[26]。本研究提示順產(chǎn)與剖宮產(chǎn)的UCB 中TNC 及CD34+細胞計數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義；此外，本研究發(fā)現(xiàn)受孕方式、雙胎、產(chǎn)婦血型、胎盤形態(tài)、羊水胎糞污染均不影響UCB中HSPC數(shù)量，與早期結(jié)果一致[27]。

有研究提示新生兒體重與UCB 中TNC、CD34+細胞計數(shù)無相關(guān)性[28]，而Nguyen 等[29]發(fā)現(xiàn)呈正相關(guān)。本研究提示新生兒體重與UCB 中TNC、CD34+細胞計數(shù)無相關(guān)性。大多數(shù)研究表明新生兒性別不影響UCB 質(zhì)量[29-30]，但Bijou 等[31]在校正出生體重后發(fā)現(xiàn)男性新生兒UCB 中CD34+細胞含量較高。本研究結(jié)果為不同性別新生兒的UCB 中TNC 及CD34+細胞計數(shù)無差異，因此新生兒性別對UCB 中CD34+細胞計數(shù)不產(chǎn)生影響。Mazzoccoli 等[24]（n=17 936）研究提示新生兒Apgar 評分與UCB 質(zhì)量呈負相關(guān)，可能與Apgar 評分異常增加新生兒呼吸窘迫發(fā)生率[32]有關(guān)。本研究提示Apgar 評分不影響CD34+細胞數(shù)量，可能與本研究中大多數(shù)（96.9%）Apgar 評分正常有關(guān)。

Al-Sweedan 等[27]（n=200）發(fā)現(xiàn)臍帶繞頸新生兒UCB 中CD34+細胞計數(shù)增加。本研究發(fā)現(xiàn)臍帶繞頸不影響TNC 及CD34+計數(shù)，分析原因可能與本研究中53 例臍帶繞頸新生兒，大多數(shù)為繞頸1 周，較少引起臍帶壓迫及UCB 動力學改變有關(guān)。

當然，本研究仍然存在一些不足：（1）除課題研究的因素外，仍存在許多影響因素，例如孕母煙酒史、產(chǎn)次、分娩時間等均對胚胎發(fā)育有影響。（2）新生兒生后Apgar 評分、臍帶繞頸兩個因素，因樣本分布不均、組間樣本差異較大等原因，可能存在統(tǒng)計學誤差。

本課題發(fā)現(xiàn)孕母年齡在25～40 歲時，UCB 中CD34+細胞數(shù)量隨孕母年齡增大而增多。故臍血庫在選擇UCB 前，可以根據(jù)孕母年齡進行權(quán)衡和選擇，旨在：（1）避免UCB 的CD34+細胞消耗；（2）增加TNC。而其余所研究圍生期因素均不影響UCB 中CD34+細胞數(shù)量，因此，臍血庫在篩選UCB 干細胞供者時，本研究結(jié)果可為擴大UCB 干細胞的采集范圍提供參考。