具有透明質(zhì)酸酶抑制活性益生菌的體外篩選及鑒定

雷文平，周 輝，陳 綺，周杏榮，吳 坤，汪家琦，劉成國,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.澳優(yōu)乳業(yè)（中國）有限公司，湖南 長沙 410200）

近年來，過敏性疾病日益增加，誘發(fā)過敏反應(yīng)的因素也持續(xù)增多，其已屬于常見的多發(fā)性病癥[1-2]。過敏是由于外源物質(zhì)進(jìn)入人體，機(jī)體的免疫系統(tǒng)將此類物質(zhì)識別為異物，致使免疫系統(tǒng)紊亂，引起過敏、炎癥等癥狀[3]。過敏反應(yīng)根據(jù)其機(jī)理可分為I、II、III和IV型，絕大部分過敏疾病是與體內(nèi)透明質(zhì)酸酶活性相關(guān)的I型過敏反應(yīng)；透明質(zhì)酸酶是降解透明質(zhì)酸的水解酶，是機(jī)體結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，與大多數(shù)由IgE介導(dǎo)的I型和T細(xì)胞介導(dǎo)的IV型過敏反應(yīng)有關(guān)，因此，透明質(zhì)酸酶體外抑制實驗是體外快速篩選抗過敏藥物的有效方法[4-5]。目前，過敏疾病主要以藥物治療為主或避免接觸環(huán)境和食物中過敏原；由于藥物毒副作用大，且致使過敏反應(yīng)的過敏原難以確定，無法根本解決過敏癥狀[6]。

益生菌作為人體腸道中的有益微生物，能夠預(yù)防多種疾?。òㄎ改c道感染、血壓或血清膽固醇升高、腫瘤和過敏等疾?。7]。Yang Bo等[8]研究表明益生菌能夠降低通過雞卵白蛋白（ovalbumin，OVA）致敏小鼠血清中OVA-IgE和OVA-IgG1含量，減少脾臟Th2相關(guān)細(xì)胞因子的釋放以及緩解腹瀉癥狀。已有研究表明乳酸菌菌株可誘導(dǎo)T細(xì)胞參與的一般免疫抑制，并產(chǎn)生可調(diào)節(jié)T細(xì)胞，從而控制過敏性炎癥[9-10]。此外，Charalambos等[11]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌DC 2035和2012的細(xì)胞表面特性，具備潛在的免疫調(diào)節(jié)能力，表明菌株的細(xì)胞表面特性能夠作為抗過敏益生菌篩選的指標(biāo)之一。因此，本研究通過體外抗逆性、黏附性、抑菌性、體外安全性4 個指標(biāo)對菌株益生特性進(jìn)行評價；然后以透明質(zhì)酸酶體外抑制實驗篩選具有高透明質(zhì)酸酶抑制活性的益生菌并進(jìn)行鑒定，旨在為菌種資源的綜合利用和益生菌抗過敏活性的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶來自南山牧業(yè)有限公司-南山牧場；金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、單核細(xì)胞性李斯特菌（ATCC 19115）、大腸桿菌（CGMCC 9181）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院實驗室提供。

血平板、生物胺試劑盒、MRS（Man Rogosa Sharpe）肉湯、瓊脂、革蘭氏染色試劑盒、牛膽鹽 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胃蛋白酶（3 000～3 500 U/g）、?；悄扄} 北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（≥50 000 U/g） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗生素試劑盒（20 種） 杭州微生物試劑有限公司；透明質(zhì)酸酶（≥300 U/g）、透明質(zhì)酸鈉 上海瑞永生物科技有限公司；DNA細(xì)菌提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GZ-400-S恒溫培養(yǎng)箱 韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺 蘇州凈化有限公司；BKQ-B50II全自動高壓蒸汽滅菌鍋 山東博科科學(xué)儀器有限公司；HH-601超級恒溫水浴鍋 常州市萬豐儀器制造有限公司；TG16-WS臺式高速離心機(jī)湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離及菌懸液的制備

乳酸菌的分離：將從湖南山區(qū)高海拔牧場（南山牧場，平均海拔＞1 760 m）所采集的牛奶樣品以10 倍系列梯度進(jìn)行稀釋，并涂布于MRS固體（含0.5 g/100 mL CaCO3）平板上，于37 ℃培養(yǎng)48 h。選取具有乳酸菌典型菌落形態(tài)、溶鈣圈和革蘭氏染色呈現(xiàn)陽性的菌株進(jìn)行劃線純化，并編號保存。

菌懸液的制備：將分離保藏的菌株用MRS液體培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)24 h，活化2 代，在4 ℃、9 800×g條件下離心3 min；并用無菌生理鹽水洗滌2 次，重懸，使菌懸液OD600nm值為0.8。

1.3.2 耐酸和耐膽鹽實驗

將菌懸液以3%接種量分別接種于pH 2和含3.0 g/L牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀測菌液是否渾濁，選出培養(yǎng)基均渾濁的菌株[12]。

1.3.3 模擬胃腸液實驗

分別向4.5 mL的無菌模擬胃液和腸液中加入0.5 mL的菌懸液，混合均勻，于37 ℃孵育3 h，并采用平板計數(shù)法分別計算0 h和3 h的活菌數(shù)。其中人工胃液和腸液參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行配制，并以LGG作為對照。菌株存活率計算如式（1）所示：

1.3.4 膽鹽水解酶活性和抗菌活性

膽鹽水解酶活性：將牛津杯放置于含有3 g/L?；悄扄}的MRS固體培養(yǎng)基上，并加入200 μL的菌懸液，于37 ℃培養(yǎng)72 h，觀察是否具有透明圈產(chǎn)生，根據(jù)圈透明度大小及透明度判定其膽鹽水解酶活性；并以植物乳桿菌WCFS1為陽性對照菌株。

抗菌活性采用牛津杯法[14]進(jìn)行測定，以大腸桿菌和單核細(xì)胞性李斯特菌為指示菌株。

1.3.5 菌株表面特性

1.3.5.1 自聚集

將1 mL菌懸液用旋渦混合儀渦旋10 s，并在37 ℃孵育5 h，輕取200 μL上層懸液，測定600 nm波長處的吸光度，以LGG為對照菌株。其自聚集計算如式（2）所示：

式中：A1為處理5 h的吸光度；A0為初始菌懸液的吸光度。

1.3.5.2 共聚集

分別以單核細(xì)胞性李斯特菌和大腸桿菌對分離菌株的共聚集能力進(jìn)行評價；將等體積的篩選菌株和致病菌菌懸液混合，渦旋混合儀振蕩10 s，在37 ℃孵育5 h后，輕取200 μL上層懸液，測定600 nm波長處的吸光度（A混），以LGG為對照菌株。其共聚集能力計算如式（3）所示：

式中：A2和A3分別為受試菌與致病菌菌懸液單獨處理5 h的吸光度。

1.3.5.3 疏水性

參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行測定，其中有機(jī)試劑為十六烷和乙酸乙酯。

1.3.6 Caco-2細(xì)胞黏附

細(xì)胞培養(yǎng)：將液氮保存的Caco-2細(xì)胞快速解凍，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的伯克改良伊格爾（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）高糖培養(yǎng)基，并于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液，當(dāng)細(xì)胞的融合度達(dá)到80%～90%時傳代培養(yǎng)，3 次傳代進(jìn)行實驗。

黏附實驗[16]：向6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)入1 mL傳代培養(yǎng)3 次的Caco-2細(xì)胞懸液（5×104cells/mL），并于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至細(xì)胞長至單層。將培養(yǎng)基吸出，用無菌磷酸鹽緩沖液洗2 次，加入菌懸液于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育2 h；然后除去培養(yǎng)板各孔的懸液，無菌磷酸鹽緩沖液洗3 次以除去未黏附的菌體，細(xì)胞刮獲取細(xì)胞，采用血球計數(shù)板測定每孔的Caco-2細(xì)胞數(shù)和平板計數(shù)法計算黏附細(xì)菌數(shù)。黏附能力計算如式（4）所示：

1.3.7 安全性評價

溶血性：將受試菌株菌懸液點種于血瓊脂平板上，并在37 ℃孵育48 h，然后觀察菌株的溶血現(xiàn)象。

抗生素敏感性和產(chǎn)生物胺：使用含有20 種抗生素的藥物敏感性片劑試劑盒確定分離株的抗生素敏感性；通過賴氨酸脫羧酶試劑盒測試菌株產(chǎn)生生物胺的潛力。

1.3.8 透明質(zhì)酸酶體外抑制分析

參照Elson-Morgan法[17]稍作修改，向試管中加入0.1 mL 2.5 mmol/L的CaCl2和0.5 mL 600 U/mL的透明質(zhì)酸酶，37 ℃處理20 min；加菌懸液0.5 mL，37 ℃處理20 min；加入0.5 mL 0.5 mg/mL的透明質(zhì)酸鈉溶液，37 ℃處理30 min；常溫靜置5 min，將入0.5 mL乙酰丙酮溶液（1.4 mL乙酰丙酮溶于20 mL 1.0 mol/L的Na2CO3溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配）和0.1 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，沸水浴15 min，立即冰浴5 min；加入1 mL埃爾利希試劑（稱取0.8 g的對二甲氨基苯甲醛溶于15 mL的濃鹽酸和15 mL無水乙醇中，現(xiàn)用現(xiàn)配），常溫顯色20 min，于530 nm波長處測定其吸光度，以LGG為對照菌株。抑制率計算如式（5）所示：

式中：A為對照組吸光度（醋酸緩沖液取代菌懸液）；B為空白組吸光度（醋酸緩沖液取代酶溶液和菌懸液）；C為實驗組吸光度；D為試樣空白組吸光度（醋酸緩沖液取代酶溶液）。

1.3.9 16S rDNA菌株鑒定

將過夜培養(yǎng)的受試菌株用TIANmp細(xì)菌DNA提取試劑盒提取總DNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系為：2 μL Taq緩沖液，0.4 μL Taq酶，0.5 μL上引物（27f/1512r），2 μL樣品DNA，1.6 μL dNTPs和13 μL雙蒸餾水。PCR產(chǎn)物由華大基因進(jìn)行測序。然后使用BLAST算法在GenBank數(shù)據(jù)庫中對序列進(jìn)行匹配，并利用MEGA 5軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，以SPSS Statistics 21進(jìn)行方差分析（ANOVA）和最小顯著差異多重比較，P＜0.05，差異顯著；使用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離及耐酸耐膽鹽結(jié)果

通過MRS培養(yǎng)基分離和革蘭氏染色，從3 個牛奶樣品中分離出50 株革蘭氏陽性菌株，其中菌株L02、L08、L10、L11和L15在酸和高膽鹽環(huán)境中表現(xiàn)出良好耐受性，將該5 株菌進(jìn)行下一步研究。部分菌株菌落圖和鏡檢圖見圖1。

圖1 菌株菌落圖和顯微鏡檢圖Fig. 1 Colony morphology and micrographs of isolates

2.2 菌株對模擬胃腸液的耐受性結(jié)果

圖2 分離菌株對模擬胃腸液的耐受性Fig. 2 Resistance of isolates to simulated gastrointestinal fluids

益生菌在經(jīng)受模擬胃腸液后能夠存活足夠數(shù)量的能力是菌株進(jìn)入人體定植必要條件[18]。由圖2可知，所有菌株在模擬胃腸液中表現(xiàn)出較高存活率，均大于60%，其中菌株L15在模擬胃液和腸液中的存活率最高分別為（103.884±2.722）%和（92.785±1.122）%，顯著高于其他菌株（P＜0.05）；與對照菌株LGG相比，菌株L02和L10也具有較好耐受性。同時，研究表明由于菌株或物種的特異性，不同菌株對胃腸液的耐受性存在顯著差異（P＜0.05），并且在胃腸道中的存活濃度高于107CFU/g（糞便質(zhì)量計），才能夠發(fā)揮對宿主的益生效果；因此，通過體外模擬胃腸道環(huán)境篩選高存活率益生菌具有重要意義[19]。

2.3 菌株膽鹽水解酶活性和抗菌活性

表1 菌株膽鹽水解酶活性Table 1 Bile salt hydrolase activity of isolates

由表1可知，所有菌株具有膽鹽水解酶活性，且與對照菌株WCFS1相比，具有相近的活性，而菌株L08并未表現(xiàn)出膽鹽水解酶活性；雖然膽鹽水解酶活性與益生菌耐受腸道膽鹽有一定相關(guān)性，但有研究表明并不是菌株耐受膽鹽的唯一指標(biāo)，需要研究其耐受機(jī)制[20]；同時，也有研究表明膽鹽水解活性與益生菌的膽固醇清除有關(guān)[21]；因此，可作為篩選具有降膽固醇潛力的益生菌參照指標(biāo)。

表2 分離菌株抗菌活性Table 2 Antibacterial activities of isolates

益生菌抗菌活性是預(yù)防宿主被病原菌感染的基礎(chǔ)。由表2可知，所有菌株對大腸桿菌和單核細(xì)胞性李斯特菌均有抑制作用，表明所篩選菌株可能能夠抑制大部分革蘭氏陽性和陰性病原菌；其中菌株L02、L08和L15對2 株致病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)抑菌活性，其抑菌圈直徑均大于11.000 mm。雖然所有菌株具有抑菌活性，但菌株的抗菌能力主要是由于自產(chǎn)有機(jī)酸、細(xì)菌素和過氧化氫等物質(zhì)，具體抗菌物質(zhì)的性質(zhì)仍然未知。因此，有必要進(jìn)一步研究其具體組成[22]。

2.4 菌株表面特性

圖3 分離菌株的聚集能力Fig. 3 Aggregation abilities of isolates

從圖3 可以看出，由于菌株表面特異性，不同菌株間的自聚集能力差異顯著（P＜0.05），其值在（21.521±5.472）%～（89.298±1.636）%之間，表明這些菌株在人腸道中具有潛在的黏附和定植能力。其中菌株L15具有最高自聚集能力（（89.298±1.636）%），這一結(jié)果與Gómez等[23]報道一致。與對照菌株LGG相比，所有受試菌株對大腸桿菌和單核細(xì)胞性李斯特菌2 株致病菌表現(xiàn)出接近或高于LGG的共聚集能力，表明菌株對不同致病菌具有較強(qiáng)的共聚集能力，研究表明具有高共聚集能力的益生菌可以通過競爭腸上皮細(xì)胞上的結(jié)合位點來防止不同的病原體黏附[24]。因此，益生菌可能是減少病原菌定植并預(yù)防感染的候選者。

圖4 分離菌株的疏水性Fig. 4 Hydrophobicity of isolates

疏水性是益生菌細(xì)胞黏附腸道上皮細(xì)胞的重要指標(biāo)之一。由圖4可知，通過十六烷和乙酸乙酯兩種有機(jī)試劑處理，不同菌株間的疏水性差異顯著（P＜0.05），菌株L02和L15在兩種有機(jī)試劑中的疏水性均顯著（P＜0.05）高于其他菌株，均高于60%；并且與LGG相比，菌株L11也具有較好疏水性。其中菌株L08僅對十六烷表現(xiàn)出較高疏水性，而對乙酸乙酯表現(xiàn)出最低疏水能力；因十六烷是菌株表面疏水性的表現(xiàn)，而乙酸乙酯反映菌株的表面Lewis酸堿性，表明菌株表面呈現(xiàn)堿性[25]；相關(guān)研究指出疏水性受菌株的年齡、表面化學(xué)成分以及培養(yǎng)物組成的影響，所以疏水性并無標(biāo)準(zhǔn)值；但高疏水性是益生菌黏附特性的一個積極特征[26]。

2.5 菌株對Caco-2細(xì)胞黏附結(jié)果

圖5 分離菌株的黏附能力Fig. 5 Adhesion abilities of isolates

益生菌對腸道表面的黏附和人胃腸道的定植是其發(fā)揮益生作用的至關(guān)重要條件。由圖5可知，菌株L10、L02和L15表現(xiàn)出良好的黏附特性，均高于對照益生菌LGG（（2.660±0.751）CFU/cell）；其中菌株L10具有最高黏附能力（（46.001±17.962）CFU/cell）；但是菌株L11表現(xiàn)出較低黏附力，僅為（1.416±0.101）CFU/cell，可能取決于不同表面決定因素（包括疏水、靜電相互作用、空間力和表面分子）[27]。同時，不同研究結(jié)果表現(xiàn)出不同的細(xì)胞黏附性能，可能歸因于Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境和用于分析的方法[28-29]。 此外，高黏附力的益生菌菌株可能在人類胃腸道中持續(xù)更長的時間；并且與非黏附微生物相比，它們具有更好的代謝和免疫調(diào)節(jié)作用。

2.6 菌株安全性評價

表3 菌株溶血性和產(chǎn)生物胺分析Table 3 Hemolytic potential and biogenic amine-producing abilities of isolates

表4 菌株抗生素敏感性Table 4 Antibiotic sensitivities of isolates

為了能夠保證所篩選菌株能安全地應(yīng)用于食品加工，進(jìn)一步從溶血性、產(chǎn)生物胺和抗生素敏感性等方面評價菌株的安全性。由表3可知，受試菌對并未表現(xiàn)出α和β溶血作用，產(chǎn)生物胺呈現(xiàn)陰性；通常益生菌中應(yīng)避免在致病細(xì)菌（如鏈球菌和葡萄球菌等）中出現(xiàn)的此特征。由表4可知，菌株對20 種抗生素的敏感性存在差異性，所有菌株對卡那霉素均不敏感，且對丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素和新霉素敏感性較弱，可能是因為此類抗生素僅對革蘭氏陰性菌株具有抑制作用；而大部分菌株對其他抗生素較敏感；本實驗結(jié)果與之前相關(guān)學(xué)者報道較一致[30-32]。此外，菌株抗耐藥性可以是固有或獲得性的，這使得細(xì)菌耐藥性可能在相關(guān)動物中發(fā)生耐藥性基因的遷移[33]。因此，所篩選菌株能初步確定在使用上無致病性。

2.7 菌株透明質(zhì)酸酶體外抑制分析

圖6 分離菌株透明質(zhì)酸酶抑制活性Fig. 6 Hyaluronidase inhibitory activities of isolates

研究表明透明質(zhì)酸酶能明顯促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖，也會參與到部分惡性腫瘤細(xì)胞的繁殖，其與炎癥、過敏較強(qiáng)相關(guān)性，是體外篩選抗過敏藥物的有效方法[34]。由圖6可知，所篩選菌株具有較高的透明質(zhì)酸酶抑制活性，且存在顯著差異（P＜0.05）；其抑制率在（49.261±1.262）%～（80.404±1.262）%之間，菌株L08表現(xiàn)出最高抑制活性；并且相比陽性菌株LGG，菌株L02和L11呈現(xiàn)相近的抑制率，分別為（68.974±0.808）%和（71.54±1.654）%；表明所篩選菌株具有潛在抗過敏活性。這可能與細(xì)胞表面特性（如共聚集、疏水性和細(xì)胞黏附性等）有一定相關(guān)性，并且研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌L67的糖蛋白可抑制BPA刺激的RBL-2H3細(xì)胞的脫粒和組胺的釋放以及細(xì)胞中TNF-α和IL-4的表達(dá)[11,35]。因此，有必要結(jié)合益生菌表面特性進(jìn)一步證明菌株的抗過敏能力。

2.8 菌株16S rDNA鑒定結(jié)果

圖7 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 7 Phylogenetic tree of isolates

將所篩選菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送至華大基因進(jìn)行測序；測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，所有菌株與植物乳桿菌同源性高于98%，表明上述菌株均為植物乳桿菌；并且從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出（圖7），所篩選菌株與植物乳桿菌在同一分支上；因此，可進(jìn)一步確定篩選菌株均為植物乳桿菌。

3 結(jié) 論

本研究通過菌株益生特性體外評價和透明質(zhì)酸酶體外抑制實驗，快速篩選具有抗過敏潛能的益生菌。分離出的50 株菌中5 株表現(xiàn)出對酸和膽鹽耐受；相比較對照菌株LGG，這5 株菌均具備良好的體外抗逆性和高黏附性，并初步判定為安全菌株，能有效地在人體內(nèi)發(fā)揮其功能特性；同時，5 株菌株的透明質(zhì)酸酶抑制活性高于40%，在抗過敏方面具有潛在功效；其中菌株L02和L15各方面均相對突出，且鑒定結(jié)果均為植物乳桿菌。由于受試樣品均為菌株菌體，且相關(guān)研究表明其表面特性與菌株抗過敏活性有關(guān)，因此，菌株表面性質(zhì)與治療過敏疾病的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。