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      蘋果梨酵素發(fā)酵過程中香氣成分的變化

      2021-01-20 08:17:16范昊安沙如意崔艷麗毛建衛(wèi)
      食品科學(xué) 2021年2期
      關(guān)鍵詞:蘋果梨丁香酚醛類

      范昊安,沙如意,*,杜 檸,戴 靜,方 晟,崔艷麗,毛建衛(wèi),4,*

      (1.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江 杭州 310023;2.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院,浙江 紹興 312000;3.浙江大學(xué)理學(xué)部,浙江 杭州 310027;4.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江 紹興 312000)

      食用酵素是以一種或多種新鮮蔬菜、水果和谷豆類、海藻類、食藥兩用本草類、菌菇類等食材為原料,加(或不加)糖類物質(zhì),經(jīng)多種有益菌通過較長時(shí)間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品,擁有豐富的次生代謝產(chǎn)物、原料本身營養(yǎng)成分和益生菌等功能性成分,特別是富含小分子功能成分[1-4]。

      蘋果梨是薔薇科(Rosaceae)梨屬果樹的果實(shí),是吉林省延邊地區(qū)的特產(chǎn)水果[5-6]。蘋果梨可食率高,營養(yǎng)豐富,富含氨基酸、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)[7-8],具有健脾和胃、祛火清心、消痰驅(qū)熱、止嘔止瀉、軟化血管等保健功效[9]。目前,市場上的蘋果梨以鮮食和果脯干等初級加工產(chǎn)品為主,尚且缺乏蘋果梨的精深加工產(chǎn)品。

      果蔬經(jīng)微生物發(fā)酵制備食用植物酵素,不僅可以保留原料的特有風(fēng)味,而且還能賦予酵素特殊的發(fā)酵香氣。劉加友[10]研究表明,葛根發(fā)酵成酵素后,風(fēng)味物質(zhì)更為豐富,醛類、醇類和酯類化合物含量顯著提高,確定苯乙醇、葵酸、辛酸乙酯為葛根酵素主要風(fēng)味物質(zhì)。郭紅蓮等[11]對比發(fā)酵前后枸杞酵素風(fēng)味物質(zhì)的變化,發(fā)現(xiàn)在有益菌微生物轉(zhuǎn)化下共生成了20 種酯類、9 種醛類、6 種酮類、23 種醇類、3 種酸類、3 種芳香雜環(huán)類化合物。陳英等[12]對植物酵素發(fā)酵前后的揮發(fā)性成分進(jìn)行研究,結(jié)果表明,中藥液經(jīng)發(fā)酵后酯類和酸類的種類和含量明顯升高,酚類的含量明顯提高。植物酵素風(fēng)味物質(zhì)和香氣成分與原料、菌種等多種因素有關(guān)。因此,研究植物酵素發(fā)酵過程中香氣成分的變化,對酵素產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)評價(jià)與精準(zhǔn)制備具有重要意義。

      本實(shí)驗(yàn)以蘋果梨酵素為研究對象,采用頂空氣相色譜法測定甲醇、乙醇含量,通過固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(solid-phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用技術(shù),結(jié)合主成分分析(principal component analysis,PCA)、相對氣味活度值(relative odor activity value,ROAV)分析研究關(guān)鍵香氣成分的變化規(guī)律,旨在揭示蘋果梨酵素發(fā)酵過程中甲醇、乙醇、香氣成分的動(dòng)態(tài)變化,為蘋果梨酵素的高值化利用和精深加工提供參考。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      蘋果梨由吉林省延吉市蘋果梨種植基地提供;酵液由浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;白砂糖(食品級) 太古糖業(yè)(中國)有限公司;乙醇(優(yōu)級純)、叔丁醇(色譜純) 上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;甲醇(優(yōu)級純) 美國Thermo Fisher Scientific公司;氯化鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

      1.2 儀器與設(shè)備

      316L型50 L不銹鋼發(fā)酵罐由浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;SpectraMax iD5多功能酶標(biāo)儀美國Molecular Devices公司;GC-2010氣相色譜儀 日本島津公司;HSS86.50頂空進(jìn)樣器 意大利DANI公司;7890A-5975C GC-MS儀 美國Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司。

      1.3 方法

      1.3.1 蘋果梨酵素制備

      用無菌水沖洗新鮮蘋果梨(果實(shí)完全成熟且無蟲害潰爛),自然瀝干后切塊。白砂糖用紫外燈輻照處理45 min,將蘋果梨和白砂糖以質(zhì)量比1∶1加入高壓蒸汽滅菌過的50 L不銹鋼發(fā)酵罐中,并加入5%(V/V)酵液(菌體濃度:1×105CFU/mL),于(20±5)℃避光發(fā)酵,定期取樣50 mL,所取樣品于4 000 r/min離心15 min,將上清液保存于-80 ℃超低溫冰箱中,待測。

      1.3.2 甲醇、乙醇含量測定[4]

      混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:以終質(zhì)量濃度為10 g/L的叔丁醇為內(nèi)標(biāo),配制質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L和1、2、5、10、20、40、50 g/L的甲醇、乙醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,待測。

      樣品配制:酵素樣品中加入終質(zhì)量濃度為10 g/L的叔丁醇作為內(nèi)標(biāo),待測。

      自動(dòng)頂空條件:爐溫85 ℃,平衡時(shí)間40 min;進(jìn)樣閥溫度105 ℃;傳輸線溫度110 ℃。

      氣相色譜條件:RTX-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);柱溫40 ℃,平衡時(shí)間3 min,10 ℃/min升溫至180 ℃,保溫5 min;進(jìn)樣口溫度200 ℃;分流比30∶1;檢測器溫度250 ℃。

      1.3.3 香氣成分測定

      使用SPME-GC-MS聯(lián)用法測定蘋果梨酵素中的香氣成分[13]。萃取前,將萃取頭置于250 ℃ GC進(jìn)樣口中老化1 h。將酵素樣品置于室溫解凍后,取1 mL移入4 mL頂空瓶中,同時(shí)加入0.5 g NaCl和磁力轉(zhuǎn)子,用帶有聚四氟乙烯隔墊的樣品瓶蓋密封,置于50 ℃恒溫磁力攪拌器上平衡15 min后,使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶,頂空萃取50 min,然后將萃取頭插入GC進(jìn)樣口,解吸5 min。

      GC條件:DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×250 μm,0.25 μm);載氣:高純氦氣(純度≥99.999%);流速:1 mL/min;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;無分流進(jìn)樣;升溫程序:40 ℃保持3 min,然后以2 ℃/min的速率升溫至100 ℃,保持2 min,再以3 ℃/min的速率升溫至180 ℃,保持1 min,再以10 ℃/min的速率升溫至240 ℃,總運(yùn)行時(shí)間68.67 min。

      MS條件:接口溫度280 ℃;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;離子化方式為電子電離源;離子源能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍:m/z 40~450;掃描方式:全離子掃描。

      檢測結(jié)果在圖譜庫NIST08.L上檢索并比對參考文獻(xiàn)進(jìn)行人工圖譜解析,采用峰面積歸一化法對DB-5MS柱所得的色譜峰進(jìn)行相對定量,得到各香氣成分的相對含量。

      1.3.4 ROAV計(jì)算[14]

      使用ROAV法確定蘋果梨酵素中的關(guān)鍵香氣成分,使得對樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分ROAVstan為100,其余各組分的ROAVA計(jì)算公式如下:

      式中:Cstan、Tstan分別為對樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的香氣成分的相對含量/%及其感官閾值/(μg/kg);CA、TA分別為其余各香氣成分的相對含量/%及其感官閾值/(μg/kg)。

      1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

      2 結(jié)果與分析

      2.1 蘋果梨酵素發(fā)酵過程中甲醇和乙醇質(zhì)量濃度的變化

      圖1 發(fā)酵過程中甲醇和乙醇質(zhì)量濃度的變化Fig. 1 Changes in the contents of methanol and ethanol during Jiaosu fermentation

      甲醇、乙醇是反映植物酵素質(zhì)量控制的重要指標(biāo),蘋果梨酵素發(fā)酵過程中甲醇、乙醇質(zhì)量濃度的變化結(jié)果如圖1所示。蘋果梨酵素發(fā)酵過程中甲醇、乙醇質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先增長后下降的變化趨勢。甲醇對人體健康的危害極大,尤其對視網(wǎng)膜、呼吸及神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的麻痹、毒害作用[15]。發(fā)酵第15~20天,甲醇質(zhì)量濃度由(0.021±0.000)g/L顯著上升至(0.152±0.017)g/L(P<0.05),造成上述現(xiàn)象的原因主要是蘋果梨果膠含量較高,發(fā)酵前期會被分解為果膠酸和甲醇。發(fā)酵2 0 d 后,甲醇質(zhì)量濃度持續(xù)下降,并于發(fā)酵第80天降至(0.026±0.000)g/L,這表明發(fā)酵過程中甲醇含量得以有效控制,從而保證了蘋果梨酵素的品質(zhì)質(zhì)量。發(fā)酵前50 d,乙醇質(zhì)量濃度逐漸上升至最大值(3.927±0.025) g/L,隨后,乙醇質(zhì)量濃度于發(fā)酵第80天快速下降至(92.623±0.071)g/L。由此可知,蘋果梨酵素中乙醇質(zhì)量濃度始終低于5 g/L,符合植物酵素行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5323—2018《植物酵素》的要求,故參考各香氣成分在水中的感官閾值進(jìn)行ROAV分析。

      2.2 蘋果梨酵素發(fā)酵過程中香氣成分的變化

      如表1所示,蘋果梨酵素發(fā)酵過程中共檢出40 種香氣成分,其中醇類4 種,醛類3 種,酸類7 種,酯類20 種,酚類4 種,烷烴類1 種,醚類1 種。從發(fā)酵5、10、15、20、30、40、50、80 d的蘋果梨酵素中分別檢出18、18、14、33、23、25、23、20 種香氣成分,分別占總峰面積的(79.18±3.87)%、(77.58±4.94)%、(7 6.8 7±4.8 4)%、(9 2.4 7±4.9 5)%、(9 6.5 8±2.3 1)%、(9 4.8 6±1.6 7)%、(98.08±2.80)%、(92.35±1.71)%。不同發(fā)酵時(shí)期的共有香氣成分有:乙醇、辛酸、乙酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、丁香酚5 種。發(fā)酵前15 d,蘋果梨酵素的香氣成分由以乙酸乙酯為主的酯類化合物組成;發(fā)酵20 d后,隨著醇類化合物相對含量的上升,醇類與酯類化合物在整體香氣成分中占比較大。發(fā)酵第5 天,蘋果梨酵素的主要香氣成分為乙酸乙酯(45.89±3.87)%、1-己醇(8.43±1.21)%、鄰苯二甲酸二丁酯(7.29±0.82)%、辛酸(5.13±0.93)%、丁酸乙酯(2.92±0.13)%;發(fā)酵第10天,其主要香氣成分為乙酸乙酯(44.71±3.26)%、乙醇(9.87±0.56)%、1-己醇(5.20±0.41)%、丁香酚(3.92±0.36)%、辛酸(3.61±0.61)%;發(fā)酵第15天,其主要香氣成分為乙酸乙酯(42.84±4.52)%、乙醇(21.49±1.93)%、丁香酚(3.75±0.62)%、丁酸乙酯(2.06±0.41)%、異戊醇(1.42±0.12)%;發(fā)酵20 d后,其主要香氣成分為乙酸乙酯(22.50±1.90)%~(32.94±0.80)%、乙醇(20.07±2.83)%~(26.86±1.14)%、苯乙醇(12.89±1.33)%~(13.66±1.15)%、異戊醇(1.69±0.18)%~(8.71±0.03)%、丁香酚(5.10±0.19)%~(7.96±0.40)%。由此可知,蘋果梨酵素發(fā)酵過程中香氣成分的種類及相對含量存在明顯差異,且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,整體上呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢。

      表1 發(fā)酵過程中香氣成分及其相對含量的變化Table 1 Changes in aroma components and their relative contents during Jiaosu fermentation

      續(xù)表1

      2.2.1 發(fā)酵過程中醇類化合物的變化

      2)非洲是傳統(tǒng)核心區(qū)。埃尼公司上游業(yè)務(wù)幾乎涉及所有非洲傳統(tǒng)油氣資源國家,從北非的阿爾及利亞、利比亞、埃及到西北非的摩納哥,再到東非莫桑比克、肯尼亞等國家,西非傳統(tǒng)油氣大國埃尼公司更是都有進(jìn)入,包括尼日利亞、安哥拉、剛果、加蓬、加納等。埃尼公司已經(jīng)在非洲15個(gè)國家開展上游業(yè)務(wù),未來4年埃尼公司重點(diǎn)聚焦的勘探盆地/地區(qū),非洲仍將占據(jù)一半。

      蘋果梨酵素中的醇類化合物主要通過酵母菌等微生物利用糖、蛋白質(zhì)及氨基酸等物質(zhì)代謝產(chǎn)生,如乙醇、苯乙醇等[16]。蘋果梨酵素發(fā)酵過程中共檢出4 種醇類化合物,其相對含量呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢,并于發(fā)酵第20天達(dá)到(42.37±3.38)%。由此可知,醇類化合物隨著發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸成為蘋果梨酵素中的主要香氣成分。

      乙醇是酵母菌、乳酸菌等微生物的重要代謝產(chǎn)物,適量的乙醇可以賦予蘋果梨酵素怡人的醇香,并可作為其他香氣成分的溶劑。其相對含量從發(fā)酵第5天的(1.39±0.09)%顯著上升至發(fā)酵第15天的(21.49±1.93)%(P<0.05),并隨發(fā)酵時(shí)間延長趨于動(dòng)態(tài)穩(wěn)定,這可能是醋酸菌利用乙醇代謝生成醋酸,且乙醇與脂肪酸酯化生成脂肪酸乙酯所致。

      苯乙醇主要是由釀酒酵母以L-苯丙氨酸為前體,通過艾利希途徑、戊糖磷酸途徑等代謝途徑產(chǎn)生,此外部分苯乙醇還可由釀酒酵母利用葡萄糖通過莽草酸途徑生成[17-18]。發(fā)酵前10 d,苯乙醇均未被檢出;發(fā)酵第20天,苯乙醇的相對含量由(0.45±0.11)%顯著上升至(13.49±1.14)%(P<0.05);發(fā)酵20 d后其相對含量趨于穩(wěn)定。

      高級醇通常產(chǎn)生于有氧條件下糖脫羧反應(yīng)或者厭氧條件下氨基酸脫氨基反應(yīng)[19]。異戊醇是在蘋果梨酵素發(fā)酵中后期產(chǎn)生的高級醇,具有濃郁的水果香及花香[20]。1-己醇是一種富有水果芬芳香氣的高級脂肪醇,但過高含量的1-己醇對人的神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的生理毒性,進(jìn)而引發(fā)頭疼、惡心等癥狀[21-22]。發(fā)酵過程中,1-己醇相對含量由發(fā)酵第5天的(8.43±1.21)%顯著下降至發(fā)酵第20天的(0.10±0.08)%(P<0.05),可能是由于其發(fā)生了酯化、氧化還原等一系列反應(yīng)。Qin Gaihua等[23]研究表明1-己醇作為梨中的代謝前體,相較于亞油酸和亞麻酸等脂肪酸,更有適合于酯類化合物等揮發(fā)性成分的生物合成及調(diào)控。

      2.2.2 發(fā)酵過程中醛類化合物的變化

      醛類化合物由于其感官閾值較低,是構(gòu)成蘋果梨酵素發(fā)酵前期成熟果香香味的化學(xué)成分之一[24]。蘋果梨酵素發(fā)酵過程中共檢出3 種醛類化合物,其相對含量呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢。水果中的壬醛、癸醛等中碳鏈長度脂肪醛類化合物被認(rèn)為是對主體香氣起輔助作用的重要組分[25]。發(fā)酵前期,壬醛和癸醛的相對含量迅速下降直至未檢出,主要是由于發(fā)酵過程中醛類化合物極不穩(wěn)定,進(jìn)一步氧化或酯化成酸類及酯類化合物[26];發(fā)酵第40天,由于苯乙醇發(fā)生氧化反應(yīng)導(dǎo)致苯乙醛的生成及其相對含量的持續(xù)增加[27]。

      2.2.3 發(fā)酵過程中酸類化合物的變化

      蘋果梨酵素中的酸類化合物對酯類化合物的生成有極大的貢獻(xiàn)作用。蘋果梨酵素發(fā)酵過程中共檢出7 種酸類化合物,其相對含量呈先下降后上升再下降的趨勢,并于發(fā)酵第20天達(dá)到最大值(9.67±2.03)%。發(fā)酵第20天酸類化合物的種類及相對含量的增加,可能是因?yàn)榻湍妇任⑸镌诎l(fā)酵過程中積累了大量的代謝副產(chǎn)物。同時(shí),隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,蘋果梨酵素中的醇類及醛類化合物會進(jìn)一步氧化形成酸類化合物[28]。辛酸和癸酸是蘋果梨酵素中的主要酸類化合物,兩者相對含量的降低主要?dú)w因于發(fā)酵過程中與乙醇酯化生成對應(yīng)的脂肪酸乙酯。

      酯類化合物是蘋果梨酵素中一類種類豐富且含量高的香氣成分,為蘋果梨酵素獨(dú)特果香風(fēng)味的主要來源。蘋果梨酵素發(fā)酵過程中共檢出17 種酯類化合物,其相對含量呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵前期微生物代謝生成大量有機(jī)酸,而較低pH值會使酯類化合物水解,以致其相對含量的降低;發(fā)酵后期,發(fā)酵前期積累的有機(jī)酸與乙醇等醇類化合物發(fā)生酯化反應(yīng),導(dǎo)致酯類化合物相對含量回升。

      乙酸乙酯是蘋果梨酵素中相對含量最高的主要香氣成分, 占總香氣含量的(22.50±1.90)%~(45.89±3.89)%,這與南果梨、碭山梨[23]、西洋梨[29]等研究結(jié)果一致。乙酸乙酯與丁酸乙酯廣泛存在于蘋果、梨等水果中,是構(gòu)成蘋果梨酵素令人愉悅的花果香氣的主體成分。

      3-甲硫基丙酸乙酯具有奇異的熱帶水果香韻和濃郁的菠蘿特征風(fēng)味[30],是一種較罕見的香氣成分[31],自蘋果梨酵素發(fā)酵第20天開始檢出,其相對含量為(0.16±0.00)%~(0.33±0.03)%;乙酸苯乙酯多產(chǎn)生于酒精、醋酸發(fā)酵過程中,由苯乙醇在酯酶的作用下合成[32]。

      蘋果梨酵素中檢出的己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯分別為C6~C18偶數(shù)碳脂肪酸與乙醇酯化生成的高級脂肪酸乙酯[33]。己酸乙酯帶有強(qiáng)烈的香蕉、菠蘿果香[34];辛酸乙酯具有玫瑰、橙子的香氣并伴有白蘭地特有的酒香[35];癸酸乙酯具有葡萄的水果香氣[36];長鏈脂肪酸乙酯具有獨(dú)特的油陳香味[34]。在發(fā)酵后期,高級脂肪酸乙酯的形成增加了蘋果梨酵素的醇厚感和后味,并且有效降低其中的干澀味[37]。

      鄰苯二甲酸酯是蘋果梨采收及后熟期間果皮中具有抑菌活性的主體成分[38]。鄰苯二甲酸二異丁酯和鄰苯二甲酸丁二酯作為蘋果梨中的預(yù)存抗菌物質(zhì),其相對含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸降低,分別由發(fā)酵第5天的(2.58±0.74)%和(7.29±0.82)%降至發(fā)酵第80天的(0.00±0.00)%和(0.06±0.01)%。研究表明,鄰苯二甲酸酯類具有一定的生物毒性,能夠干擾內(nèi)分泌、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)的正常調(diào)節(jié)[39],蘋果梨酵素發(fā)酵過程中其相對含量的降低說明微生物發(fā)酵起到有效的生物降毒、脫毒作用。

      2.2.5 發(fā)酵過程中酚類化合物的變化

      蘋果梨酵素發(fā)酵過程中共檢出4 種酚類化合物,其相對含量呈現(xiàn)總體上升的變化趨勢。發(fā)酵過程中酚類化合物相對含量的變化主要是由丁香酚含量變化引起的。研究表明,丁香酚、異丁香酚可以提供食品一種獨(dú)特的煙熏香味[25],此外丁香酚還具有良好的抑菌防腐功效及較強(qiáng)的保鮮作用[40];2,4-二叔丁基苯酚具有輕微甜香味,在發(fā)酵過程中相對含量較低。

      2.2.6 PCA

      對蘋果梨酵素發(fā)酵過程中的40 種香氣成分含量進(jìn)行PCA,將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后,提取特征值大于3的3 個(gè)成分為PC,其中PC1的特征值為24.73,貢獻(xiàn)率為61.83%;PC2的特征值為7.34,貢獻(xiàn)率為18.34%;PC3的特征值為3.61,貢獻(xiàn)率為9.02%。3 個(gè)PC的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到89.19%,能夠較好地反映原始數(shù)據(jù)的絕大部分信息,符合PCA要求[41]。

      蘋果梨酵素發(fā)酵過程中40 種香氣成分的PCA載荷圖如圖2所示。PC1與1-己醇(C2)、壬醛(Q5)、癸醛(Q6)、辛酸(S9)、庚酸(S14)、γ-戊基丁內(nèi)酯(Z15)、十四酸異丙酯(Z30)、鄰苯二甲酸二異丁酯(Z31)、鄰苯二甲酸二丁酯(Z32)呈高度正相關(guān),與乙醇(C1)呈高度負(fù)相關(guān);PC2與己酸乙酯(Z18)、苯甲酸乙酯(Z19)、3-甲硫基丙酸乙酯(Z20)、乙酸苯乙酯(Z24)、棕櫚酸乙酯(Z33)、油酸乙酯(Z34)、丁香酚(F35)呈高度正相關(guān);PC3與壬酸(S10)、癸酸(S11)、月桂酸(S12)、十四酸(S13)、肉桂酸乙酯(Z27)、對烯丙基苯酚(F38)呈高度正相關(guān)。上述結(jié)果說明,PC1主要反映了蘋果梨酵素發(fā)酵過程中醇類、醛類、鄰苯二甲酸酯類化合物含量的變化;PC2主要反映了發(fā)酵過程中脂肪酸乙酯類、酚類化合物含量的變化;PC3主要反映了發(fā)酵過程中酸類化合物含量的變化。

      圖2 發(fā)酵過程中香氣成分的PCA載荷圖Fig. 2 PCA loading plot of aroma components during fermentation

      由于酸類化合物(PC3)閾值較高,對蘋果梨酵素的總體風(fēng)味貢獻(xiàn)較小,故以PC1為橫坐標(biāo),PC2為縱坐標(biāo),繪制PCA散點(diǎn)圖如圖3所示,并且散點(diǎn)圖中樣品間距的遠(yuǎn)近表明其差異性的大小。PC1可以很好地將發(fā)酵第5、10、15天及發(fā)酵第20~80天區(qū)分開來,說明發(fā)酵前期醇類及醛類化合物含量變化顯著,不同發(fā)酵時(shí)間的香氣特征差異較大。為進(jìn)一步分辨發(fā)酵中后期蘋果梨酵素中香氣成分的異同,通過PC2對集中于PC1負(fù)半軸的各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行載荷距離區(qū)分。發(fā)酵第20、30、40天三者之間載荷距離較遠(yuǎn),說明酯類及酚類化合物可能是決定發(fā)酵中期風(fēng)味特征的重要香氣成分;發(fā)酵第50天和發(fā)酵第80天分別位于PC2的正、負(fù)半軸,說明影響發(fā)酵后期的主要香氣成分為酯類及酚類化合物;發(fā)酵第40天和發(fā)酵第80天的載荷距離較近,說明兩者在PC1和PC2上均無顯著差異,香氣特征較為一致。

      圖3 蘋果梨酵素樣品的PCA散點(diǎn)圖Fig. 3 PCA scatter plot of Jiaosu samples with different fermentation times

      2.3 ROAV分析蘋果梨酵素發(fā)酵過程中關(guān)鍵香氣成分的變化

      蘋果梨酵素的總體風(fēng)味是由各香氣成分的相對含量及其感官閾值共同決定的結(jié)果。為分析蘋果梨酵素發(fā)酵過程中關(guān)鍵香氣成分的變化,根據(jù)已有水中香氣閾值的相關(guān)報(bào)道[25,42-43],對其中檢出的主要化合物進(jìn)行ROAV分析如表2所示。

      表2 發(fā)酵過程中主要香氣成分ROAV的變化Table 2 Changes in ROAV of main aroma components during Jiaosu fermentation

      由表2 可知,蘋果梨酵素發(fā)酵過程中共有7 種關(guān)鍵香氣成分(ROAV≥1)以及4 種修飾香氣成分(0.1≤ROAV<1),其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、丁香酚、壬醛具有較高的ROAV,對蘋果梨酵素發(fā)酵過程中的總體香氣有較大貢獻(xiàn)。

      醇類化合物對蘋果梨酵素的總體香氣具有重要修飾作用。1-己醇具有青草與植物香氣[44];苯乙醇具有玫瑰香、茴香、梔子香和先苦后甜的桃香味[45];異戊醇具有花果香味并有少許苦杏仁味[44]。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,發(fā)揮修飾作用的香氣由發(fā)酵前10天的青草香變?yōu)榘l(fā)酵第20天后的誘人花香。乙醇香氣柔和甜潤,但由于其香氣閾值很高(100 000 μg/kg),ROAV均小于0.01,對整體香貢獻(xiàn)很少[46]。

      醛類化合物為蘋果梨酵素中影響較大的關(guān)鍵香氣成分。壬醛具有強(qiáng)烈的脂肪香,稀釋后具有橙子及玫瑰香韻[47];癸醛具有橙皮香及牛脂香[25]。發(fā)酵前10 d,壬醛和癸醛的ROAV分別為3.64、3.70和30.51、31.49,對蘋果梨酵素的總體風(fēng)味貢獻(xiàn)大;發(fā)酵15~30 d,由于醛類化合物的不穩(wěn)定性,無醛類化合物檢出;發(fā)酵后期,苯乙醛的ROAV從發(fā)酵第40天的0.72上升至發(fā)酵第50天的1.08,成為關(guān)鍵香氣成分,進(jìn)而為蘋果梨酵素增添了玫瑰香型香氣。

      酸類化合物由于其感官閾值較高,在發(fā)酵過程中對總體香氣均無明顯影響(ROAV<0.1)。

      酯類化合物是蘋果梨酵素發(fā)酵過程中最為重要的主體香氣成分,多具有誘人的果香。乙酸乙酯極高的相對含量及其較低的感官閾值(5 μg/kg),使其獨(dú)特的水果風(fēng)味成為對蘋果梨酵素貢獻(xiàn)最大的主體香氣(ROAV=100)。發(fā)酵中后期,具有菠蘿、香蕉型水果香氣的己酸乙酯[48]逐漸代替呈甜蘋果香的丁酸乙酯成為關(guān)鍵香氣成分,豐富了蘋果梨酵素的香型與風(fēng)格。

      丁香酚作為甲氧基酚類化合物,其ROAV自發(fā)酵第5天的3.02快速上升至發(fā)酵第20天的26.57,隨后呈現(xiàn)波動(dòng)下降趨勢。丁香酚具有典型的丁香花香氣[49],同時(shí)也是關(guān)鍵性煙熏風(fēng)味成分,對產(chǎn)品花香、辛香及煙熏風(fēng)味的形成起了重要作用[50]。

      由此可知,發(fā)酵過程中蘋果梨酵素的關(guān)鍵香氣成分由以乙酸乙酯、丁酸乙酯、癸醛、壬醛為主的酯類及醛類化合物逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐砸宜嵋阴ァ⒓核嵋阴?、丁香酚為主的酯類及酚類化合物,這一系列的生成、更替、降解等動(dòng)態(tài)變化,在水果果香的主體基礎(chǔ)上,進(jìn)一步賦予了蘋果梨酵素獨(dú)特的風(fēng)味。

      3 結(jié) 論

      本研究跟蹤檢測各發(fā)酵階段蘋果梨酵素的甲醇、乙醇及香氣成分的動(dòng)態(tài)變化,并通過ROAV法確定其發(fā)酵過程中的關(guān)鍵香氣成分。結(jié)果表明,蘋果梨酵素發(fā)酵過程中共檢出40 種香氣成分,其中的主要香氣成分為以乙酸乙酯為主的酯類化合物以及乙醇、苯乙醇等醇類化合物,不同發(fā)酵時(shí)期的共有香氣成分有乙醇、辛酸、乙酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、丁香酚共5 種。PCA結(jié)果顯示,蘋果梨酵素發(fā)酵過程中醇類、醛類和鄰苯二甲酸酯類化合物是影響發(fā)酵前期香氣變化的主體成分,而脂肪酸乙酯類和酚類化合物是造成發(fā)酵中后期風(fēng)味差異的主要香氣成分。ROAV分析表明,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,表征蘋果梨酵素的關(guān)鍵香氣成分由乙酸乙酯、丁酸乙酯、癸醛、壬醛等酯類及醛類化合物轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜嵋阴ァ⒓核嵋阴?、丁香酚等酯類及酚類化合物。甲醇、乙醇含量在發(fā)酵第20、50天達(dá)到最大值,分別為(0.152±0.017)、(3.927±0.025)g/L。由此可知,適當(dāng)發(fā)酵可改善蘋果梨酵素風(fēng)味,豐富其香氣特征,對酵素制備過程中風(fēng)味品質(zhì)的評價(jià)與控制有一定的參考價(jià)值。

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