柴 多,王美婷,姜雨萌,劉瀧澤,肖 琳,王繽晨,董 亮
(大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧 大連 116034)
蕎麥,學(xué)名韃靼蕎麥,是一年生雙子葉蓼科草本植物,開發(fā)較早,品種豐富。目前,蕎麥屬在全球范圍內(nèi)廣泛分布,在世界上有約15 個(gè)種和2 個(gè)變種,主要集中分布在北半球歐亞大陸的溫帶地區(qū)。我國(guó)的蕎麥品類繁多,具有10 個(gè)種,其中主要的品種有苦蕎和甜蕎,且資源豐富,是全世界最大的蕎麥出口國(guó)。蕎麥具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力,能夠在貧瘠的土壤、寒冷區(qū)域和高海拔區(qū)域正常生長(zhǎng)[1-2]。苦蕎是一種健康食品的原料[3],具有抗氧化、抗炎和抗高血壓等保健作用[4],可用作食用抗氧化劑和營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)劑等。研究發(fā)現(xiàn),苦蕎含有大量的黃酮類物質(zhì),且其含量遠(yuǎn)高于其他品種的普通蕎麥[5],而蘆丁是蕎麥中特有的一種含量豐富的黃酮類化合物,是具有抗氧化和消炎作用的主要活性物質(zhì)。因此,苦蕎作為一種優(yōu)質(zhì)的原料用于黃酮類物質(zhì)的工業(yè)提取,在苦蕎深加工領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用。同時(shí),苦蕎中的甾醇、蛋白質(zhì)以及脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量也比常見的糧食作物要高出很多,是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的糧食作物[6-7],具有較高的開發(fā)應(yīng)用前景。因此,廣大科研工作者對(duì)蕎麥中活性成分[8]、保健功能[9-11]等方面進(jìn)行了大量的研究。張莉等[12]利用高效液相色譜法對(duì)苦蕎葉、莖、根中的槲皮素含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)同一種苦蕎葉中槲皮素含量最高。有實(shí)驗(yàn)選取了苦蕎芽苗菜粉、苦蕎葉粉及籽粒粉,比較其中3 種黃酮類成分含量,苦蕎芽苗菜粉中蕓香苷、槲皮素的含量明顯高于蕎麥葉粉、籽粒粉,而山柰酚含量則以籽粒粉中的最高[13],同時(shí)有研究測(cè)定了不同地區(qū)苦蕎樣品的游離酚和結(jié)合酚進(jìn)行了并檢測(cè)其抗氧化性能,其中對(duì)羥基苯甲酸,阿魏酸和原兒茶酸是主要的酚酸[14]。王世霞等[15]對(duì)7 種苦蕎籽粒的水分、灰分、氨基酸、脂肪酸、淀粉、蛋白質(zhì)以及功能組分黃酮和多酚的含量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明因地域差異導(dǎo)致苦蕎麥的營(yíng)養(yǎng)及功能性成分的種類和含量差別不顯著,Janes等[16]還對(duì)同一批苦蕎的苦蕎殼、麩皮及苦蕎粉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了探究,僅在蕎麥碎粒中鑒定出某些化合物,如(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-癸烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛等,而在蕎麥粉或麩皮中未鑒定出這些化合物。
目前關(guān)于苦蕎的研究大多集中在活性成分的鑒別和保健功能的開發(fā)等方面,而苦蕎作為一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的雜糧食品的開發(fā)一直相對(duì)緩慢,相關(guān)的基礎(chǔ)研究和加工設(shè)備研究較少,這也造成了其加工過程中營(yíng)養(yǎng)和活性物質(zhì)損失較大。因此,開展苦蕎籽粒中不同部位的代謝物質(zhì)及活性成分分布的研究工作對(duì)指導(dǎo)苦蕎深加工中營(yíng)養(yǎng)和活性的保持具有重要的理論指導(dǎo)和應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用代謝組學(xué)法,將苦蕎麥種子細(xì)分為蕎麥殼、麩皮、胚部及胚乳4 個(gè)部位,利用氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用法分別對(duì)每一個(gè)部位的代謝物進(jìn)行檢測(cè)和定量分析,并利用高效液相色譜對(duì)苦蕎不同部位的活性成分進(jìn)行測(cè)定,從而更細(xì)致全面地構(gòu)建苦蕎營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輪廓,為苦蕎的深加工提供參考依據(jù)。
苦蕎 山西省大同市東方亮生命科技有限公司;三甲基硅咪唑 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;硅烷衍生化試劑N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺、N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺(N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide,MTBSTFA)(>97%)、甘氨酸、丙氨酸等19 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
7890A/5975C GC-MS儀 安捷倫科技有限公司;BS224S電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器;Scientz-10ND型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司;Cleanert Silica(硅膠)SPE固相萃取柱 天津博納艾杰爾科技有限公司;TTL-DC型多功能氮吹儀、CR22N型高速離心機(jī) 日本日立公司;VORTEX3型旋渦振蕩混合器 德國(guó)IKA公司。
1.3.1 原料處理
選取優(yōu)質(zhì)帶殼苦蕎麥籽粒,將苦蕎殼手工剝離放置待用,把剩余無殼蕎麥用鑷子分開,取出其中胚部放置待用,將剩余部分壓碎,過90 目不銹鋼篩,篩出部分為胚乳,剩余部分為麩皮部分。將蕎麥殼、麩皮、胚部、胚乳用球磨儀磨成粉備用。
1.3.2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
分別將19 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液,并配制成19 種氨基酸質(zhì)量濃度均為5 μg/mL的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液,分別取20、40、80、160、240 μL的氨基酸混標(biāo)溶液,加入10 μL內(nèi)標(biāo)(0.3 mg/mL的L-4-氯苯丙氨酸溶液)后氮吹儀吹干,加入360 μL乙腈復(fù)溶,旋渦振蕩后,再加入40 μL的MTBSTFA于70 ℃衍生30 min,最后取1 μL溶液進(jìn)樣,繪制19 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.3 游離氨基酸的提取及測(cè)定
1.3.3.1 游離氨基酸的提取
分別取300 mg的蕎麥殼粉、麩皮粉、胚部粉及胚乳粉,各加入80%的甲醇溶液5 mL,旋渦振蕩2 min后室溫下置于超聲清洗儀中,功率100 W超聲15 min,取出后旋渦振蕩2 min,10 000 r/min離心15 min,取1 mL上清液加入10 μL L-4-氯苯丙氨酸溶液(0.3 mg/mL),氮吹儀吹干,取360 μL乙腈復(fù)溶,加入40 μL MTBSTFA,在70 ℃的條件下反應(yīng)30 min。
1.3.3.2 游離氨基酸的測(cè)定
取1 μL制備好的氨基酸提取樣品,通過GC-MS對(duì)樣品中的氨基酸種類及含量進(jìn)行測(cè)定。色譜條件:色譜柱為Agilent HP-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm);柱溫:初始溫度60 ℃,隨后以5 ℃/min升溫至300 ℃,保持5 min;載氣為氦氣,流速1 mL/min,進(jìn)樣口溫度260 ℃。質(zhì)譜條件:電子電離源,電離能量70 eV;離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃;采用單離子檢測(cè)掃描模式選擇需要檢測(cè)的離子,離子掃描范圍m/z 40~450。
1.3.4 糖類物質(zhì)的提取及測(cè)定
1.3.4.1 糖類物質(zhì)的提取
取苦蕎殼粉、麩皮粉、胚部粉及胚乳粉各100 mg,各加入80%的甲醇溶液5 mL,旋渦振蕩2 min后超聲處理15 min,取出后旋渦振蕩2 min,10 000 r/min離心15 min,取50 μL上清液,加入30 μL質(zhì)量濃度為10 μg/mL的核糖醇溶液作為內(nèi)標(biāo),用氮吹儀吹干后,加入260 μL吡啶復(fù)溶,再加入40 μL衍生化試劑(三甲基硅咪唑),70 ℃加熱30 min。
1.3.4.2 糖類物質(zhì)的測(cè)定
取1 μL制備好的糖類物質(zhì)提取樣品,通過GC-MS對(duì)樣品中的糖類物質(zhì)的種類及含量進(jìn)行測(cè)定。色譜及質(zhì)譜條件與1.3.3節(jié)一致,采用全掃描模式(Scan模式)采集。
1.3.5 脂類物質(zhì)的提取及測(cè)定
脂類物質(zhì)的提取參照Chai Duo等[17]的方法。
脂肪酸甲酯的測(cè)定方法:取1 μ L 制備好的脂肪酸甲酯提取樣品,通過G C-M S 對(duì)樣品中的脂肪酸甲酯種類及含量進(jìn)行測(cè)定。色譜條件:A g i l e n t HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);柱溫:初始溫度60 ℃,隨后以10 ℃/min升溫至180 ℃,然后以5 ℃/min升至270 ℃,再以9 ℃/min升至300 ℃;載氣為氦氣,流速1 mL/min,進(jìn)樣口溫度260 ℃。質(zhì)譜條件及采集方式同1.3.4節(jié)。
游離脂肪酸的測(cè)定方法同1.3.4節(jié)。
1.3.6 黃酮類物質(zhì)的提取及測(cè)定
1.3.6.1 黃酮類物質(zhì)的提取
取苦蕎蕎麥殼粉、麩皮粉、胚部粉及胚乳粉各200 mg于離心管中,加入2 mL 80%的甲醇溶液,超聲處理1 h,10 000 r/min離心15 min,取上清液,重復(fù)3 次,將上清液合并,用氮吹儀吹干,200 μL甲醇復(fù)溶,待測(cè)。
1.3.6.2 色譜條件
色譜柱:Phenomenex Chrom-CloneC18柱(4.6 mm×250 mm,5.0 μm);柱溫(30.0±5)℃;進(jìn)樣體積1 0.0 μ L;流速1.0 0 m L/m i n;流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液(A),甲醇(B),梯度洗脫:0~16 min,90%~58% A,10%~42% B;16~20 min,58%~54% A,42%~46% B;20~35 min,54%~15%,46%~85% B;檢測(cè)波長(zhǎng):260、280、320、308、369 nm。取1.3.6節(jié)條件下制備的上清液1 mL經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾,待進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定。
運(yùn)用GC-MS對(duì)苦蕎的蕎麥殼、麩皮、胚部及胚乳進(jìn)行代謝輪廓分析,共分析鑒定出19 種氨基酸、12 種脂肪酸甲酯、6 種糖類、20 種游離脂肪酸。由表1可以看出,苦蕎麥的各個(gè)部位中都含有豐富的游離脂肪酸及脂肪酸甲酯,其中苦蕎麥的胚部的脂肪酸甲酯及游離脂肪酸的種類最多,含量最高;蕎麥殼中的脂肪酸甲酯及游離脂肪酸的種類最少,含量也最少。在檢測(cè)出的苦蕎的脂肪酸甲酯中,十六烷酸、9,12-十八碳二烯酸、9-十八碳烯酸比其他種類的脂肪酸甲酯含量高出很多,并且主要存在于苦蕎麥的胚部。其中9-十八碳烯酸又稱油酸,是一種單不飽和脂肪酸,廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi),具有一定的保健功能,可以起到預(yù)防心血管疾病的作用,并且可以降低高血脂癥患者血脂水平[18-19]。9,12-十八碳二烯酸又稱亞油酸,以甘油酯的形式存在于動(dòng)植物油脂中,是一種人體無法合成的必須氨基酸,有很好的降血壓的作用[20-21]??嗍w麥各個(gè)部位也含有種類豐富的游離脂肪酸,其中含量較高的游離脂肪酸有棕櫚酸、硬脂酸、1-棕櫚酸及β-谷甾醇,且在胚部中的含量明顯高于其他部位。十七烷酸及花生四烯酸僅在胚部中被檢測(cè)出來,在其他3 個(gè)部位并無分布。在苦蕎中檢測(cè)出的甾醇類物質(zhì)具有良好的降血脂及抗菌的作用[22-23]。
在蕎麥的麩皮中共檢測(cè)出10 種脂肪酸甲酯,其中含量最高的是9-十八碳烯酸,為3.24 mg/g,并檢測(cè)到了18 種游離脂肪酸,含量最高的是棕櫚酸,為85.38 μg/g,其次是硬脂酸及1-棕櫚酸,含量分別為51.73 μg/g和50.55 μg/g,同時(shí),麩皮中的β-谷甾醇含量也較高。如圖1所示,苦蕎胚部中含有12 種脂肪酸甲酯,含量較高的是9-十八碳烯酸33.77 mg/g、9,12-十八碳烯酸29.48 mg/g及十六烷酸20.51 mg/g,同時(shí)在苦蕎胚部中檢測(cè)出20 種游離脂肪酸,其中β-谷甾醇的含量高達(dá)114.66 μg/g,另外含量較高的還有棕櫚酸104.04 μg/g、硬脂酸77.18 μg/g及1-棕櫚酸61.09 μg/g。在苦蕎的蕎麥殼中僅檢測(cè)到2 種脂肪酸甲酯,分別是十六烷酸和二十四烷酸,且含量都比較低,分別為0.46 mg/g和0.13 mg/g。同時(shí)在蕎麥殼中檢測(cè)出16 種游離脂肪酸,其中含量較高的是棕櫚酸76.4 mg/g、硬脂酸50.57 mg/g及1-棕櫚酸38.44 mg/g。在胚乳中檢測(cè)到10 種脂肪酸甲酯,含量都較低,未檢測(cè)到9-十六碳烯酸和三十烷酸。同時(shí)檢測(cè)出15 種游離脂肪酸,含量最高的同樣是棕櫚酸111.46 μg/g,其次是硬脂酸66.25 μg/g和1-棕櫚酸41.60 mg/g。
表1 苦蕎不同部位脂肪酸甲酯及游離脂肪酸的含量Table 1 Relative contents of fatty acid methyl esters and free fatty acids in different parts of tartary buckwheat seeds
圖1 苦蕎胚部中基礎(chǔ)代謝物總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of basic metabolites in tartary buckwheat germ
表2 苦蕎不同部位糖類物質(zhì)的含量Table 2 Relative contents of carbohydrates in different parts of tartary buckwheat seeds mg/g
如表2所示,苦蕎麩皮中檢測(cè)出6 種糖類物質(zhì),含量均不高,其中含量最高的是蔗糖5.71 mg/g??嗍w胚部中同樣檢測(cè)出6 種糖類物質(zhì),其中蔗糖含量高達(dá)42.76 mg/g,占檢測(cè)出的糖類的總含量的89.9%。在苦蕎的蕎麥殼中僅檢測(cè)出D-葡萄糖這一種糖類物質(zhì),且含量較少僅為0.15 mg/g,其他糖類并未檢測(cè)出??嗍w的胚乳中檢測(cè)出4 種糖類物質(zhì),分別是D-葡萄糖0.08 mg/g、D-海藻糖0.03 mg/g、D-(+)-呋喃糖0.09 mg/g及蔗糖0.07 mg/g,且這幾種糖類物質(zhì)的含量均不高,同時(shí)胚乳中未檢測(cè)到D-葡萄糖醇和肌醇。可以看出,苦蕎麥的胚部及麩皮部分糖類含量較高,種類較多,而胚乳中檢測(cè)出來的糖類物質(zhì)含量則明顯少與麩皮及胚部,苦蕎麥殼中糖類物質(zhì)含量最少,僅檢測(cè)到了D-葡萄糖,并未檢測(cè)到其他糖類。其中含量最高的糖類物質(zhì)是蔗糖,蔗糖是植物體內(nèi)最主要的糖類,且蔗糖在苦蕎麥中主要分布在苦蕎麥的胚部,其他糖類的含量明顯低于蔗糖。
苦蕎麩皮中共檢測(cè)到19 種氨基酸(表3),其中含量最高的氨基酸是谷氨酸,高達(dá)1.66 mg/g,占麩皮中所檢測(cè)到的氨基酸總含量的78.3%,含量最低的氨基酸是蛋氨酸,僅為2.21 μg/g??嗍w的胚部中同樣檢測(cè)到19 種氨基酸,其中含量最高的氨基酸同樣是谷氨酸,含量高達(dá)5.55 mg/g,占胚部中所檢測(cè)到的氨基酸總含量的82.1%,其余氨基酸含量較高的有丙氨酸119.55 μg/g、天冬氨酸241.10 μg/g及天冬酰胺169.74 μg/g等。胚部中含量最少的氨基酸是谷氨酰胺,僅為4.34 μg/g。在苦蕎的蕎麥殼中共檢測(cè)到15 種氨基酸,并未檢測(cè)到蛋氨酸、半胱氨酸、賴氨酸及組氨酸??嗍w蕎麥殼種含量最高的氨基酸是天冬酰胺,含量為149.77 μg/g,占蕎麥殼中所檢測(cè)到的氨基酸總含量的43.9%。蕎麥殼中含量最少的氨基酸是甘氨酸,僅為3.79 μg/g。在苦蕎的胚乳中19 種氨基酸均被檢測(cè)出來,其中含量最高的氨基酸是谷氨酸334.16 μg/g,占胚乳中所檢測(cè)出的氨基酸含量的58.7%。由表3可以看出,苦蕎麥的各個(gè)部位均有種類豐富的氨基酸,其中蕎麥殼中未檢測(cè)到蛋氨酸、半胱氨酸、賴氨酸及組氨酸,其余各部位均檢測(cè)出19 種氨基酸。其中胚部中的氨基酸含量明顯多于其他3 個(gè)部位,且含量最多的氨基酸為谷氨酸,在麩皮及胚乳中含量最多的氨基酸也是谷氨酸,蕎麥殼相對(duì)于其他3 個(gè)部位氨基酸的含量最少,且種類也最少。
表3 苦蕎不同部位氨基酸的含量Table 3 Relative contents of amino acids in different parts of tartary buckwheat seeds μg/g
如表4所示,在苦蕎的麩皮中檢測(cè)出含量較高的是香草酸28.40 μg/g、蘆丁24.64 μg/g及對(duì)香豆酸20.87 μg/g,含量最少的活性成分是槲皮素4.32 μg/g。在苦蕎的胚部中檢測(cè)出6 種活性成分,槲皮素并未檢測(cè)出來,其中蘆丁的含量最多,為40.79 μg/g,占胚部中所檢測(cè)到的活性成分總含量的48.6%,含量最少的活性成分是山柰酚4.84 μg/g。在苦蕎的蕎麥殼中共檢測(cè)到5 種活性成分,未檢測(cè)到丁香酸和對(duì)香豆酸,其中蘆丁的含量遠(yuǎn)高于其他4 種物質(zhì)的含量,高達(dá)106.00 μg/g,占蕎麥殼中所檢測(cè)到的活性成分總含量的81.8%,含量最少的活性成分是綠原酸4.65 μg/g。在苦蕎的胚乳中同樣只檢測(cè)到5 種活性成分,未檢測(cè)到丁香酸和槲皮素,各種活性成分的含量較為相似??梢钥闯龈鞑课换钚猿煞侄驾^豐富,其中蕎麥殼中的活性成分含量最高,胚乳中活性成分含量最少。同時(shí)由表4可以看出,蘆丁是苦蕎中含量最為豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),且在蕎麥殼中含量最高,其次是胚部、麩皮,在胚乳中的含量最少。蘆丁又稱為蕓香苷、VP,是一種廣泛存在于蕎麥、大黃等植物中的黃酮類化合物糖苷,具有很高的藥用價(jià)值。蘆丁能夠清除羥自由基、氧自由基、過氧化氫自由基等自由基[24],這些自由基是導(dǎo)致人體很多疾病的原因之一。同時(shí)蘆丁也具有消炎[25]、抗癌[26-27]等作用,并且在防止心腦血管疾病方面也有很大的作用[28]。另外,所檢測(cè)出的綠原酸也具有廣泛的生物活性,具有一定的清除自由基及抗炎抗癌作用[29-30],已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域。
表4 苦蕎不同部位活性成分的含量Table 4 Contents of bioactive ingredients in different parts of tartary buckwheat seeds μg/g
綜上所述,苦蕎中的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如脂類、氨基酸和糖類,在胚部的含量相比其他部位最高,其原因在于胚部作為蕎麥種子生命活力最強(qiáng)的部位,在萌發(fā)過程中需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成新的組織和器官。相比于胚部,麩皮組織中的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量較小,但也明顯高于殼和胚乳部分的含量,而胚乳部分含有大量的淀粉,其主要生理作用在于為種子萌發(fā)提供能量??嗍w的中如黃酮類等生理活性物質(zhì)主要分布在麩皮部分,但是個(gè)別物質(zhì)如蘆丁在殼中的含量很高?,F(xiàn)階段,蕎麥的食用方式主要以磨粉制成相應(yīng)的蕎麥面粉為主,因此,為了更好的保持蕎麥營(yíng)養(yǎng)和保健功效,應(yīng)在磨粉過程中盡量保留蕎麥的麩皮部分,同時(shí)注意對(duì)胚部的保護(hù)。隨著人們生活水平的日益提高,人們的保健意識(shí)也越來越強(qiáng),更營(yíng)養(yǎng)更健康的全谷物食品越來越受到消費(fèi)者的歡迎,這也客觀的要求面粉或像苦蕎麥這類雜糧在加工制粉過程中對(duì)胚部和麩皮部分的保護(hù)甚至保留。通過本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),苦蕎麥殼蘆丁含量高,可以作為蘆丁潛在的原料資源進(jìn)行開發(fā),為苦蕎麥資源的綜合開發(fā)和利用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
GC-MS能夠有效的對(duì)苦蕎的代謝輪廓進(jìn)行分析??嗍w中的氨基酸、脂類和糖類等基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要分布在胚部和麩皮中,而黃酮類等生理活性物質(zhì)主要分布在麩皮中,在苦蕎的加工制粉中應(yīng)注意對(duì)這兩部分的保護(hù)或保留,其中蘆丁在蕎麥殼中含量最大,蕎麥殼可以作為蘆丁潛在的原料資源進(jìn)行開發(fā)。