鐵十字酢漿草不同極性部位的HPLC 指紋圖譜與抗氧化活性研究

李蕭娜，紀(jì)永輝，王京龍，張立華，臧遠(yuǎn)龍，楊 彬，劉春河，劉春江

（1.棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東 棗莊 277160；2.棗莊虹合食品科技服務(wù)有限公司，山東 棗莊 277800）

酢漿草（Oxalis corniculataL.）為酢漿草科植物酢漿草的新鮮或干燥全草，既是常見的綠化種植花卉，也常作為清熱解毒藥用，是苗族的傳統(tǒng)藥材［1］。酢漿草廣泛分布于云南、廣西、四川等地，大多用作藥物。酢漿草富含黃酮類、多酚類、多糖類等多種成分［2，3］，具有清除自由基、防衰老、抗氧化的作用［4，5］。

目前，對于酢漿草的藥理研究主要集中在抗炎鎮(zhèn)痛作用上，對其抗氧化活性的報道很少。研究表明，人體衰老、血栓形成等許多疾病與自由基有很大的關(guān)系，因其具有強氧化性，能攻擊生物大分子，進(jìn)而導(dǎo)致機體組織、細(xì)胞受到損傷。因此，評價和篩選具有抗氧化功能的天然抗氧化物，在對人體抗衰老等研究方面占據(jù)了重要地位［6］，已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者重點研究的熱點問題。

中藥化學(xué)指紋圖譜是一種綜合、整體的鑒定手段，強調(diào)多組分比例的相對穩(wěn)定和位置順序的完整性特征，以及在共同特征的基礎(chǔ)上個體之間又互有差異的模糊性特征［7-11］。馮華等［12］采用高效液相色譜法比較了不同產(chǎn)地的酢漿草干燥全草及其混淆品藥材的相似度；吳林菁等［13］采用UHPLC，研究了30批15 個不同產(chǎn)地的酢漿草指紋圖譜，并標(biāo)定共有峰24 個。本研究中所用的酢漿草采自云南省，經(jīng)鑒定為鐵十字酢漿草，試驗中所用的為其地下鱗莖部分，經(jīng)不同極性的有機溶劑初步萃取后，通過HPLC 指紋圖譜比較其不同部位在不同極性溶劑中的化學(xué)成分差異，并探究其抗氧化活性，為鐵十字酢漿草的深入研究提供參考［6，14］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技（中國）有限公司）；UV-2600 型全波段紫外可見掃描儀（日本島津公司）；UV-2000 型紫外-可見分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司）；FW100 型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；HH-S4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；RE52CS-2 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、B-260 型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；KQ5200QDB 型超聲波清洗機（寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司）；DHG-92464 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.1.2 試藥 藥材采自云南省，經(jīng)鑒定為酢漿草科植物鐵十字酢漿草。沒食子酸、蘆丁、葡萄糖對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，上海源葉生物科技有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；其他試劑（分析純，國藥集團）。

1.2 方法

1.2.1 酢漿草鱗莖總多酚含量的測定

1）沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精確稱量沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品100.00 mg，用無水乙醇定容至100 mL，即得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于容量瓶中，加入6 mL 酒石酸亞鐵溶液；再用pH 7.5 磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，靜置顯色后在540 nm 波長下測定吸光度，重復(fù)3 次，取平均值［15，16］。將沒食子酸濃度與吸光度進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=13.993x+0.009 8，R2=0.999 1。

2）供試品的制備。取酢漿草鱗莖洗凈，烘干后粉碎、過篩，保存?zhèn)溆?。取外皮、?nèi)芯粉末各2.00 g置于燒瓶中，加入適量乙醇溶液，超聲30 min 后過濾，吸取濾液3 mL，定容至25 mL 容量瓶中。

1.2.2 酢漿草鱗莖總黃酮含量的測定

1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg，用95% 乙醇溶液溶解，再用50% 乙醇溶液定容到100 mL 容量瓶中，制得標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mL 至容量瓶中，加入50% 乙醇溶液至25 mL，加入亞硝酸鈉溶液1.5 mL，加入10% 硝酸鋁溶液1.5 mL，再加入1 mol∕L 氫氧化鈉溶液20 mL，最后用50% 乙醇溶液定容至50 mL，15 min 后于510 nm 波長下測定吸光度，重復(fù)3 次，取平均值［17，18］。將蘆丁濃度與吸光度進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=10.985x+0.006 3，R2=0.999 8。

2）供試品的制備。取酢漿草鱗莖洗凈，烘干后粉碎、過篩，保存?zhèn)溆?。分別稱取2.00 g 酢漿草鱗莖外皮、內(nèi)芯粉末置于燒瓶中，加入適量甲醇溶液超聲30 min 后過濾，濾液水浴蒸干后加入70% 乙醇溶液溶解，定容至10 mL，即得供試品溶液。

1.2.3 酢漿草鱗莖多糖含量的測定

1）總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，去離子水定容至100 mL，即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，補加去離子水至2 mL，加5% 苯酚溶液1 mL，加濃硫酸5 mL，靜置10 min，沸水浴加熱20 min，取出冷卻［19，20］，于487 nm 波長下測定吸光度，重復(fù)3 次，取平均值。將葡萄糖濃度與吸光度進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=66.84x+0.007 1，R2=0.999 3。

2）還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于試管中，補加去離子水至2 mL，加2 mL DNS 試劑，沸水浴加熱5 min，取出快速冷卻［21，22］，在540 nm 波長下測定吸光度，重復(fù)3 次，取平均值。將葡萄糖濃度與吸光度進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=4.8126x+0.055 1，R2=0.999 4。

3）供試品的制備。分別稱取2.00 g 酢漿草鱗莖外皮、內(nèi)芯粉末置于燒瓶中，加去離子水，超聲10 min，沸水浴處理1.5 h 后過濾，取濾液1 mL 定容至25 mL，即為總糖供試液。另取濾液2 mL 定容至10 mL 作為還原糖的供試液。

1.2.4 HPLC 指紋圖譜建立

1）供試品的制備。取酢漿草鱗莖洗凈，烘干后粉碎、過篩，保存?zhèn)溆?。分別稱取酢漿草鱗莖外皮、鱗莖內(nèi)芯粉末8 g 置錐形瓶中，按料液比1∶10 加入70% 乙醇溶液，超聲振蕩提取3 次，收集濾液，減壓濃縮得浸膏，加入去離水定容至50 mL。分別取酢漿草鱗莖外皮和內(nèi)芯10 mL 溶液水浴揮干，用甲醇溶解定容。剩余40 mL 用等體積石油醚萃取，直至石油醚層無色。合并萃取液并減壓濃縮，殘渣即為石油醚相。剩余水相水浴揮盡石油醚，等體積氯仿萃取，直至氯仿層無色，合并萃取液并減壓濃縮，制得氯仿相。同法分別制備乙酸乙酯相、水飽和的正丁醇相。將石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇、水相水浴蒸干，用甲醇溶解定容，為不同極性部位的供試品溶液。

2）色譜條件。Agilent C18色譜柱，流動相0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，10%～20% B；15～55 min，20%～50% B；55～75 min，50%～70% B；75～80 min，70%～80% B；80～100 min，80%～90%B；100～115 min，90%～100%B）；流速1 mL∕min；柱溫25 ℃；檢測波長280 nm；檢測時間115 min；進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位酢漿草鱗莖中活性成分含量的測定結(jié)果

酢漿草鱗莖不同部位中活性成分含量測定結(jié)果如表1 所示。

表1 不同部位活性成分的含量

2.2 HPLC 指紋圖譜建立及分析

2.2.1 方法學(xué)驗證

1）穩(wěn)定性試驗。取同一批酢漿草供試液20 μL，分別于0、4、8、12、24 h 考察指紋圖譜，結(jié)果顯示共有峰相對保留時間的RSD均小于3.0%。

2）精密度試驗。取相同的供試液20 μL 連續(xù)進(jìn)樣6 次，統(tǒng)計共有峰的相對峰面積、相對保留時間，其中峰面積比值的RSD小于3%，符合指紋圖譜的要求，儀器精密度良好。

3）重現(xiàn)性試驗。取同一批次的酢漿草供試液，在指定色譜條件下，檢測指紋圖譜，相對峰面積的RSD小于3%。

2.2.2 酢漿草鱗莖醇提液HPLC 指紋圖譜 精密吸取酢漿草供試品溶液各20 μL，分別進(jìn)樣，經(jīng)梯度洗脫，記錄HPLC 指紋圖譜，酢漿草鱗莖外皮、內(nèi)芯醇提液HPLC 指紋圖譜如圖1。

圖1 酢漿草鱗莖醇提液指紋圖譜

酢漿草鱗莖外皮、內(nèi)芯醇提液相對保留時間和指紋圖譜比較分析見表2。分析酢漿草鱗莖外皮、內(nèi)芯總醇提液的指紋圖譜，以21 號峰為基準(zhǔn)峰，結(jié)果標(biāo)定醇提液外皮共有峰32 個，內(nèi)芯31 個。內(nèi)芯（B）與外皮（A）相比，缺失5 號特征峰。總峰面積：總醇提液外皮（A）＞總醇提液內(nèi)芯（B）。

表2 酢漿草鱗莖醇提液指紋圖譜分析

2.2.3 酢漿草鱗莖不同極性部位HPLC 指紋圖譜

1）酢漿草鱗莖外皮不同極性部位HPLC 指紋圖譜。精密吸取酢漿草供試品溶液各20 μL，分別進(jìn)樣，經(jīng)梯度洗脫，記錄HPLC 指紋圖譜，酢漿草鱗莖外皮不同極性部位HPLC 指紋圖譜疊加如圖2。酢漿草鱗莖外皮不同極性部位HPLC 指紋圖譜比較分析見表3。

表3 酢漿草鱗莖外皮不同極性部位指紋圖譜比較分析

圖2 酢漿草鱗莖外皮不同極性部位指紋圖譜疊加圖

經(jīng)分析得到酢漿草鱗莖外皮不同極性部位的共有峰，其中石油醚相（A1）8 個，氯仿相（A2）22 個，乙酸乙酯相（A3）22 個，正丁醇相（A4）26 個，水相（A5）9個。總峰面積：A2＞A3＞A4＞A1＞A5。

2）酢漿草鱗莖內(nèi)芯不同極性部位HPLC 指紋圖譜。精密吸取酢漿草供試品溶液各20 μL，分別進(jìn)樣，經(jīng)梯度洗脫，記錄HPLC 指紋圖譜，酢漿草鱗莖內(nèi)芯不同極性部位HPLC 指紋圖譜疊加如圖3。酢漿草鱗莖內(nèi)芯不同極性部位HPLC 指紋圖譜分析見表4。

表4 酢漿草鱗莖內(nèi)芯不同極性部位HPLC 指紋圖譜比較分析

圖3 酢漿草鱗莖內(nèi)芯不同極性部位指紋圖譜疊加圖

經(jīng)分析得到酢漿草鱗莖內(nèi)芯不同極性部位的共有峰，其中石油醚相（B1）14 個，氯仿相（B2）21 個，乙酸乙酯相（B3）17 個，正丁醇相（B4）19 個，水相（B5）10 個?？偡迕娣e：B2＞B4＞B5＞B1＞B3。

2.2.4 HPLC 指紋圖譜相似度評價 以鐵十字酢漿草鱗莖外皮和內(nèi)芯不同極性部位的32 個共有峰峰面積，采用夾角余弦值進(jìn)行相似度分析。

1）鱗莖同部位不同極性的圖譜相似度。酢漿草鱗莖同一部位在不同極性溶劑中指紋圖譜相似度計算分析結(jié)果見表5。不同極性部位外皮的夾角余弦值中，氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相的相似度大于0.9，化學(xué)組成相似，不同極性內(nèi)芯相似度有差異，在其化學(xué)組成上存在一定差異。

表5 同部位不同極性指紋圖譜相似度結(jié)果

2）鱗莖同極性不同部位的圖譜相似度。酢漿草鱗莖不同部位在相同極性溶劑中指紋圖譜相似度計算分析結(jié)果見表6。相同極性不同部位的夾角余弦值中，醇提液、氯仿相外皮和內(nèi)芯相似度大于0.9，酢漿草外皮和內(nèi)芯在醇提液、氯仿相其化學(xué)成分相似。乙酸乙酯相外皮和內(nèi)芯相似度比較小，化學(xué)成分可能存在差異。

表6 同極性不同部位指紋圖譜相似度結(jié)果

2.3 抗氧化活性測定

2.3.1 1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）清除率的測定 取不同濃度供試液3.0 mL 置于試管中，加入3.0 mL 0.20 mmol∕L 的DPPH 溶液，充分振蕩，室溫暗處反應(yīng)30 min，測定517 nm 波長處吸光度A，同時測定3.0 mL 無水乙醇和3.0 mL DPPH 混合液的吸光度為A1，測定3.0 mL 供試液和3.0 mL 無水乙醇混合液的吸光度為A2，以無水乙醇作空白，重復(fù)3 次，按下面公式計算清除率。同法操作，以抗壞血酸為陽性對照［15，16］。

DPPH·自由基清除率D=［1-（A-A2）∕A1］×100%

2.3.2 羥基自由基（·OH）清除率的測定 將供試品溶液稀釋至不同的濃度，按下表自上而下加入試劑，加入樣品、硫酸亞鐵溶液后充分震蕩混勻［17-19］，所加試劑見表7。

表7 試劑加樣

在加入以上試劑后，在37 ℃水浴中靜置60 min，在536 nm 波長下測定吸光度A樣、A損、A未損，重復(fù)3 次，按下面公式計算清除率。同法操作，以抗壞血酸為陽性對照。

·OH 自由基清除率D=（A樣-A損）∕（A未損-A損）×100%

2.3.3 酢漿草鱗莖不同極性部位抗氧化活性測定分析

1）不同極性部位對1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）的清除率。酢漿草鱗莖外皮不同極性部位對DPPH·自由基的清除率如圖4，內(nèi)芯不同極性部位對DPPH·自由基的清除率如圖5。由圖4 可知，鱗莖外皮對DPPH·自由基的清除率：氯仿相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相＞水相。由圖5可知，鱗莖內(nèi)芯對DPPH·自由基的清除率：氯仿相＞正丁醇相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞水相。

圖4 外皮不同極性部位對DPPH·自由基的清除率

圖5 內(nèi)芯不同極性部位對DPPH 自由基的清除率

2）不同極性部位對羥基（·OH）自由基的清除率。酢漿草鱗莖外皮不同極性部位對·OH 自由基的清除率如圖6，內(nèi)芯不同極性部位對·OH 自由基的清除率如圖7。由圖6 可知，鱗莖外皮對·OH 自由基的清除率：氯仿相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相＞水相。由圖7 可知，鱗莖內(nèi)芯對·OH 自由基的清除率：氯仿相＞正丁醇相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞水相。

圖6 外皮不同極性部位對·OH 自由基的清除率

圖7 內(nèi)芯不同極性部位對·OH 自由基的清除率

3 小結(jié)與討論

采用的鐵十字酢漿草鱗莖中富含多酚、黃酮、多糖類等成分，采用酒石酸亞鐵顯色法、亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法、硫酸-苯酚法與DNS 法，所采用方法均為常用的經(jīng)典傳統(tǒng)方法，符合方法學(xué)要求，測得其總量分別為：10.18、24.33、138.02 mg∕g，可見酢漿草鱗莖外皮與內(nèi)芯活性成分總含量有一定差異。

在抗氧化活性測定體系中，不同極性的鱗莖外皮和內(nèi)芯都有的抗氧化能力。鱗莖外皮對·OH 自由基的清除率為：氯仿相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相＞水相，鱗莖內(nèi)芯對·OH 自由基的清除率為：氯仿相＞正丁醇相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞水相，可見鱗莖外皮和內(nèi)芯的氯仿相比其他相具有更高的抗氧化能力，且氯仿相指紋圖譜峰面積大，信息量豐富，后續(xù)可對酢漿草鱗莖的氯仿相深入探究。

建立了其鱗莖外皮和內(nèi)芯不同極性部位的HPLC 指紋圖譜，并探究其抗氧化活性。經(jīng)對比分析酢漿草鱗莖不同極性的HPLC 指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)各相峰面積都有一定差異。以21 號峰為基準(zhǔn)峰標(biāo)定醇提液外皮共有峰32 個，內(nèi)芯31 個。其中，總醇提液外皮的指紋圖譜明顯優(yōu)于內(nèi)芯，在外皮中存在5號特征峰，峰面積較大，內(nèi)芯中未出現(xiàn)，可進(jìn)一步對此峰進(jìn)行研究。且總醇提液峰面積外皮遠(yuǎn)大于內(nèi)芯。不同極性部位共有峰外皮為石油醚相8 個、氯仿相22 個、乙酸乙酯相22 個、正丁醇相26 個、水相9 個、內(nèi)芯為石油醚相14 個、氯仿相21 個、乙酸乙酯相17 個、正丁醇相19 個、水相10 個。鱗莖外皮不同極性部位中特征峰數(shù)目多，峰面積大，信息量豐富?？偡迕娣e中，外皮和內(nèi)芯都是氯仿相峰面積最大，數(shù)量多，且外皮其他各個極性部位指紋圖譜信息量都遠(yuǎn)大于內(nèi)芯。

對酢漿草鱗莖外皮和內(nèi)芯不同極性部位的32個共有峰峰面積進(jìn)行相似度分析發(fā)現(xiàn)，酢漿草鱗莖外皮和內(nèi)芯在氯仿相中相似度大于0.9，而且氯仿相的抗氧化能力最高，外皮和內(nèi)芯的氯仿相萃取物化學(xué)成分相似。酢漿草鱗莖的相同部位在不同極性中，鱗莖外皮的氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相均大于0.9，乙酸乙酯相與正丁醇相相似度接近。在抗氧化測定中，鱗莖外皮的乙酸乙酯相與氯仿相自由基清除率相近，所以在這兩相中酢漿草鱗莖外皮的化學(xué)組成可能相似。大多中藥質(zhì)量的評價只探究藥材的同極性同部位指紋圖譜，不利于精細(xì)分析質(zhì)量，本試驗對鐵十字酢漿草不同極性部位的指紋圖譜、抗氧化活性進(jìn)行探究并考察相似度，能夠更加全面評價中藥質(zhì)量。

鐵十字酢漿草作為常見花卉，有著較大的栽培面積，其藥用部位多為地上全草部分。本試驗發(fā)現(xiàn)，其地下鱗莖部分化學(xué)成分豐富，并且鱗莖外皮不同極性部位HPLC 指紋圖譜更能全面反映酢漿草的化學(xué)組成信息，反映出其較好的抗氧化活性。本研究結(jié)果鐵十字酢漿草地下鱗莖富含活性成分，具備較好的抗氧化作用，為該植物的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)支撐。