（遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000）

酸菜是酸漬大白菜的簡稱，指在低濃度食鹽條件下，經過乳酸菌發(fā)酵而形成的蔬菜發(fā)酵制品，是我國東北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一[1-3]。酸菜的制作過程其實就是乳酸菌利用白菜作為培養(yǎng)基發(fā)酵產生乳酸的過程。乳酸是一種重要的多用途有機酸，可廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工、制革、紡織、環(huán)保和農業(yè)等諸多領域，按其構型及旋光性可分為L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸三類[4-6]。醫(yī)學研究證明，人體只具有代謝L-乳酸的酶（L-乳酸脫氫酶），只能代謝L-乳酸，而D-乳酸進入人體后由于不能代謝會使血尿酸度提高，過量地攝入就會引起代謝紊亂，造成酸中毒等不良反應，危害人體健康[7-8]。世界衛(wèi)生組織明確規(guī)定，成人每天攝入D-乳酸的量不得超過100 mg/kg體重，3個月以下的嬰兒食品中不應加入D-乳酸，而對于L-乳酸則不加限制[9-10]。傳統(tǒng)酸菜發(fā)酵產物多為D-乳酸，因此，就需要對傳統(tǒng)酸菜進行改良，要篩選出高產L-乳酸、生長性能好、產酸力強的優(yōu)良菌株[11-14]，才能更好地滿足廣大消費者對食品安全性的要求。

本文從自然發(fā)酵酸菜汁中篩選高產L-乳酸的乳酸菌，并用響應面法對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，為生產出安全優(yōu)質的酸菜提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品

自然發(fā)酵酸菜：市售。

1.1.2 試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、瓊脂、檸檬酸二銨、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸氫二鉀（均為分析純）：北京奧博星生物技術有限責任公司；D/L-乳酸檢測試劑盒（D/L-lactic acid assay lit）：愛爾蘭 Megazyme公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基 ：牛肉膏10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸鈉2.0 g、檸檬酸二銨2.0 g、吐溫 80 1.0 g、K2HPO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、瓊脂粉 15.0 g、水 1.0 L，pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

1.1.4 主要儀器設備

離心機（Z-16PK）：Sigma公司；高壓滅菌鍋（SX-500）：TDMY KOGYO 公司；電子分析天平（JA2003）：上海越平科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計（T6）：北京普析通用儀器有限責任公司；恒溫培養(yǎng)箱（GSP-9080MBE）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.2 方法

1.2.1 產L-乳酸乳酸菌的分離和純化

將自然發(fā)酵酸菜的酸菜汁液稀釋至10-7，涂于MRS平板培養(yǎng)基，32℃恒溫培養(yǎng)2 d～4 d。挑選單菌落進行分離純化。純化后的菌株分別接到液體MRS培養(yǎng)基中，32℃靜置培養(yǎng)24 h，進行L-乳酸檢測[15]，按D/L-乳酸檢測試劑盒步驟進行。產L-乳酸的菌株作為以下試驗目標菌。

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.2.1 發(fā)酵時間對乳酸菌數(shù)和L-乳酸產量的影響

將菌株按3%接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于32℃條件下培養(yǎng) 14、16、18、20、22、24 h 及 26 h 后測發(fā)酵液的菌數(shù)和L-乳酸產量。

1.2.2.2 發(fā)酵溫度對乳酸菌數(shù)和L-乳酸產量的影響

將菌株按3%接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，設28、30、32、34、36、38℃6個溫度條件，培養(yǎng)20 h后測發(fā)酵液的菌數(shù)和L-乳酸產量。

1.2.2.3 接種量對乳酸菌數(shù)和L-乳酸產量的影響

將菌株按1%、2%、3%、4%、5%接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32℃條件下培養(yǎng)20 h后測發(fā)酵液的菌數(shù)和L-乳酸產量。

1.2.2.4 初始pH值對乳酸菌數(shù)和L-乳酸產量的影響

將菌株按3%接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，設定培養(yǎng)基初始 pH 值為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 和 7.5，在 32 ℃條件下培養(yǎng)20 h后測發(fā)酵液的菌數(shù)和L-乳酸產量。

1.2.2.5 Box-Behnken響應面試驗

根據單因素試驗結果，選取對產L-乳酸影響顯著的因素水平，以L-乳酸產量為響應值，通過Design-Expert 8.0.6軟件設計四因素三水平Box-Behnken響應面試驗[16-19]，具體方案如表1所示。

表1 響應面因素水平Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

2 結果與分析

2.1 產L-乳酸乳酸菌的分離和純化

從自然發(fā)酵的酸菜汁中分離得到4株乳酸菌，分別命名為 LZH-1、LZH-2、LZH-3和 LZH-4，通過產 L-乳酸檢測發(fā)現(xiàn)，只有LZH-3產L-乳酸。L-乳酸產量為22.52 g/L。LZH-3的菌落形態(tài)和菌體形態(tài)見圖1。

圖1 LZH-3的菌落形態(tài)和菌體形態(tài)Fig.1 The colony morphology and microscopic morphology of LZH-3

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗結果

2.2.1 發(fā)酵時間對菌數(shù)和L-乳酸產量的影響

發(fā)酵時間對菌數(shù)和L-乳酸產量的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵時間對菌數(shù)和L-乳酸產量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on bacteria number and L-lactate production

如圖2所示，在接種后14 h～20 h內，LZH-3快速生長，L-乳酸產量也隨之增長，這時LZH-3處于對數(shù)生長期，生長代謝都處于旺盛期，發(fā)酵到20 h菌數(shù)達到最高，L-乳酸產量也達到最高值22.32 g/L，之后隨著發(fā)酵時間的延長，菌數(shù)趨于平衡，L-乳酸產量基本沒有變化，這是因為LZH-3進入生長穩(wěn)定期，代謝達到平衡，這與該菌的生長曲線相吻合。

2.2.2 發(fā)酵溫度對菌數(shù)和L-乳酸產量的影響

發(fā)酵溫度對菌數(shù)和L-乳酸產量的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對菌數(shù)和L-乳酸產量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on bacteria number and L-lactate production

從圖3可以看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，菌株LZH-3菌數(shù)和L-乳酸產量都隨之增加，到32℃時生長代謝最為旺盛，菌數(shù)和L-乳酸產量達到最高，再隨著溫度升高生長繁殖受到抑制，同時代謝能力也衰退，菌數(shù)和L-乳酸產量都呈下降趨勢。故確定LZH-3最適宜的發(fā)酵溫度和產L-乳酸溫度為32℃。

2.2.3 接種量對菌數(shù)和L-乳酸產量的影響

接種量對菌數(shù)和L-乳酸產量的影響見圖4。

圖4 接種量對菌數(shù)和L-乳酸產量的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on the number of bacteria and L-lactate production

從圖4可以得到，隨著接種量的增加，菌數(shù)和L-乳酸產量均增加，但當接種量超過3%的時候，菌數(shù)和L-乳酸產量都略有下降，應該是由于接種量過多導致養(yǎng)分不足，菌的繁殖受到限制，從而影響了L-乳酸的產量。綜合上述結果確定LZH-3的最適接種量為3%。

2.2.4 初始pH對菌數(shù)和L-乳酸產量的影響

初始pH值對菌數(shù)和L-乳酸產量的影響見圖5。

圖5 初始pH值對菌數(shù)和L-乳酸產量的影響Fig.5 Effect of initial pH on bacteria number and L-lactate production

如圖5所示，隨著初始pH值的增加，菌數(shù)和L-乳酸產量都成增加趨勢，到pH值為6時菌數(shù)和L-乳酸產量達到最高。在初始pH值在6～6.5的條件下，菌株LZH-3的菌數(shù)和L-乳酸產量均可保持在一個較高的水平。初始pH值繼續(xù)升高，菌數(shù)和L-乳酸產量迅速下降，因此菌株LZH-3生長繁殖及產L-乳酸的最適宜pH值是6。故菌株LZH-3的發(fā)酵初始pH值選擇6。

2.2.5 響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件

2.2.5.1 模型建立及顯著性分析

以L-乳酸產量為響應值，運用Box-Benhnken設計29組試驗。Box-Benhnken試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Benhnken試驗設計及結果Table 2 Expeiment design and results of Box-Benhnken

續(xù)表2 Box-Benhnken試驗設計及結果Coutinue table 2 Expeiment design and results of Box-Benhnken

用Design-Expert 8.0.6軟件對表2的結果進行多元回歸擬合，得到的回歸方程為Y=26.51+0.74A+1.32B+4.5C+2.93D-0.55AB+1.28AC-0.87AD-0.64BC-0.16BD-0.56CD-2.33A2-1.78B2-4.78C2-3.25D2。方差分析結果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

該模型的決定系數(shù)R2=0.986 5，校正決定系數(shù)R2Adj=0.973 0，說明試驗的實際值和預測值擬合度比較好。由表3可以看出，從對L-乳酸產量的影響來看，一次項A、B、C、D對產L-乳酸的影響均達到極顯著水平，影響順序為C＞D＞B＞A，即發(fā)酵溫度＞初始pH值＞發(fā)酵時間＞接種量。該回歸模型P＜0.000 1，表明試驗所采取的二次模型極顯著，失擬項的P=0.053 7＞0.05，模型失擬項不顯著，表明該模型在統(tǒng)計學上是有意義的。模型中 A、B、C、D、AC、A2、B2、C2、D2，對 L-乳酸的產量影響極顯著（P＜0.01）。AD對L-乳酸的產量影響顯著（P＜0.05）。交互項AB、BC、BD、CD 對L-乳酸的產量無顯著性影響（P＞0.05）。

2.2.5.2 響應面交互作用分析

通過Design-Expert8.0.6軟件，做出兩因素之間交互作用的3D響應面曲線圖見圖6。

圖6b曲面傾斜度比較大，且越接近曲面頂端時，顏色愈深，表示變化越急劇，作用越明顯，說明相關兩因素間交互作用顯著。其中圖6c曲面變化度尤為明顯，說明交互作用顯著。而圖6adef中曲面的變化相對平緩，說明相關兩因素間交互作用不明顯。交互效應強弱程度也可從等高線的形狀中觀察，圓形為交互作用不顯著，橢圓則為交互作用顯著[20]。

圖6 兩因素交互作用3D響應面曲線Fig.6 3D Response surface curve of interaction between factors

2.2.5.3 產L-乳酸試驗的優(yōu)化與驗證

通過Design-Expert8.0.6軟件優(yōu)化后的最佳產L-乳酸的發(fā)酵條件：接種量為3.18%，發(fā)酵時間為20.49 h，發(fā)酵溫度為32.91℃，初始pH值為6.19，此時預測L-乳酸產量為28.33 g/L。為方便實際的操作，將發(fā)酵條件調整為接種量3%，發(fā)酵時間20 h，發(fā)酵溫度33℃，初始pH 6.2，按此條件進行試驗，重復3次取平均值，測得L-乳酸產量為28.17 g/L，與預測值的相對誤差為0.56%，說明方程擬合較好，響應面優(yōu)化得到的發(fā)酵參數(shù)準確，具有實用價值。

3 結論

從自然發(fā)酵酸菜汁中分離得到4株乳酸菌，將其中一株產L-乳酸的菌株編號為LZH-3。通過響應面法對其液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得出最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度為33℃、接種量為3%，初始pH值為6.2，發(fā)酵時間為20 h。在此優(yōu)化條件下L-乳酸產量為28.17 g/L，是優(yōu)化前的1.25倍。本研究為此乳酸菌大規(guī)模工業(yè)化生產優(yōu)質酸菜提供了重要的理論依據。