轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析茉莉酸甲酯對(duì)雙孢蘑菇個(gè)體大小的影響機(jī)制

宋 媛，胡秋輝，蘇安祥，裴 斐，馬高興，馬 寧，楊文建

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又稱白蘑菇、洋蘑菇、紐扣蘑菇等，富含維生素、甘露醇等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有低脂肪、低能量、高蛋白的特征，是一種典型的菌類保健食品[1-2]。雙孢蘑菇是世界上種植最廣泛的食用菌，也是市場(chǎng)上最常見(jiàn)的食用菌，在我國(guó)雙孢蘑菇的消費(fèi)量和出口量較大，經(jīng)濟(jì)收益十分可觀[3]。通過(guò)適宜的栽培條件，可提高雙孢蘑菇品質(zhì)，增加經(jīng)濟(jì)效益。趙志順等[4]的研究證明泥炭覆土可改善雙孢蘑菇品質(zhì)，由于改變?cè)耘鄺l件操作復(fù)雜，增加了原料成本及勞動(dòng)力，尋找一種新型、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的提高雙孢蘑菇品質(zhì)的方法并研究其作用機(jī)理具有重要意義。

近年來(lái)，外源噴施茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）成為一種新興的改善作物品質(zhì)的方式。MeJA是植物體內(nèi)廣泛存在的天然化學(xué)物質(zhì)，其外源應(yīng)用能調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[5]，也能激發(fā)防御植物基因的表達(dá)[6]。MeJA作為新型植物調(diào)節(jié)物質(zhì)，近年來(lái)被廣泛用于園藝作物和農(nóng)作物的品質(zhì)優(yōu)化中。外源噴施MeJA可增大香蕉李的果實(shí)大小和質(zhì)量[7]，可提高不同灌溉條件下的2 個(gè)面包小麥品種的穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量和籽粒產(chǎn)量[8]，以及增加香雪蘭的小花數(shù)和提高植株高度[9]。對(duì)于雙孢蘑菇品質(zhì)的提高，過(guò)去主要采取改良覆土層的方式實(shí)現(xiàn)，通過(guò)外源噴施MeJA的方式鮮見(jiàn)報(bào)道。在前期MeJA外源噴施處理對(duì)雙孢蘑菇采后保鮮的研究中[10]，發(fā)現(xiàn)菇蕾期噴施MeJA提高雙孢蘑菇采后保鮮品質(zhì)的同時(shí)還能促進(jìn)雙孢蘑菇個(gè)體增大，因此MeJA可作為雙孢蘑菇的新型品質(zhì)優(yōu)化劑，探究MeJA促進(jìn)雙孢蘑菇個(gè)體增大的機(jī)理具有重大意義。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)因其具有低成本、高通量、重復(fù)性好、精確度高以及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于差異表達(dá)基因的研究。張艷艷等[11]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)揭示了西瓜噬酸菌2 個(gè)不同菌株與寄主甜瓜幼苗互作在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)差異，明確了CaM、Rboh、CDPK、FLS2等基因在西瓜噬酸菌與寄主之間早期互作的重要性。吳小梅[12]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序技術(shù)，對(duì)3 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的雙孢蘑菇子實(shí)體進(jìn)行測(cè)序和Pathway功能富集分析，篩選得到的差異基因主要富集在核苷酸代謝、脂類代謝、能量代謝、碳水化合物代謝和氨基酸代謝這5大代謝通路中，包括激酶蛋白、信號(hào)受體蛋白以及一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性蛋白等酶類蛋白，表明雙孢蘑菇子實(shí)體發(fā)育形成需要一系列代謝反應(yīng)協(xié)同調(diào)控以及各類轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)調(diào)控。邊小禹等[13]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析挖掘了3 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的豬苓菌核中有關(guān)防御、跨膜運(yùn)輸、極性生長(zhǎng)、形態(tài)發(fā)育、細(xì)胞壁合成、黑色素合成、藥效成分麥角甾醇和豬苓多糖合成功能的差異表達(dá)基因，根據(jù)差異表達(dá)基因通路富集注釋進(jìn)一步推測(cè)出豬苓菌核的發(fā)育成熟機(jī)制。因此，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序技術(shù)研究探索MeJA促進(jìn)雙孢蘑菇個(gè)體增大的基因具有重要的意義。

本研究以雙孢蘑菇為材料，采用不同濃度的MeJA溶液采前噴施處理，篩選得到能使雙孢蘑菇個(gè)體增大的MeJA濃度，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析研究MeJA處理促進(jìn)雙孢蘑菇個(gè)體增大的作用機(jī)制，為MeJA促進(jìn)雙孢蘑菇的個(gè)體增大提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究選用的雙孢蘑菇栽培、采摘于江蘇紫山生物股份有限公司（江蘇淮安）。

MeJA（純度95%） 美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇（分析純） 南京化學(xué)試劑有限公司；細(xì)胞色素P450氧化酶ELISA檢測(cè)試劑盒、木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶ELISA檢測(cè)試劑盒、內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶ELISA檢測(cè)試劑盒 南京立奧生物科技有限公司。

MeJA溶液配制：向2%乙醇溶液分別添加MeJA，配制濃度分別為10、50、100、150、200 μmol/L的MeJA溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-280恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波江南儀器設(shè)備有限公司；CS501-SP數(shù)顯恒溫振蕩水浴鍋 重慶四達(dá)試驗(yàn)儀器有限公司；M2E型多功能酶標(biāo)測(cè)試儀 美國(guó)BioTek公司；Allegra系列冷凍離心機(jī)、Allegra 64R臺(tái)式離心機(jī)美國(guó)Beckman Coulter公司；Gel DOCXR凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

設(shè)置超純水為空白組、2%乙醇溶液為乙醇組，不同濃度的MeJA溶液為處理組，每組處理設(shè)置3 床雙孢蘑菇。當(dāng)雙孢蘑菇處于出菇期第4天（菇蕾直徑=（9.77f 0.16）mm）時(shí)，將不同處理組的溶液以30 mL/m2均勻噴灑于雙孢蘑菇表面。自噴菇之日起，每天采摘雙孢蘑菇，連續(xù)采收4 d，直至達(dá)到雙孢蘑菇采收期（噴施處理后第3天）。選擇菇體完整、無(wú)機(jī)械損傷和病蟲危害的雙孢蘑菇，隨機(jī)取同一處理組雙孢蘑菇10 個(gè)左右分離菌傘、菌柄，將菌傘和菌柄分別混合作為一組樣品，再進(jìn)行相同操作2 次，每種處理取3 組樣品作為平行樣。將所有樣品液氮冷凍，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 雙孢蘑菇大小及質(zhì)量測(cè)定

從各個(gè)處理組樣品中隨機(jī)取10 個(gè)雙孢蘑菇，測(cè)量菌傘直徑、厚度，并稱質(zhì)量。篩選出最佳促雙孢蘑菇個(gè)體增大的MeJA濃度，并選用個(gè)體增大最顯著的處理組進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3.2.2 細(xì)胞色素P450氧化酶、木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶及內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活力測(cè)定

分別采用細(xì)胞色素P450氧化酶ELISA檢測(cè)試劑盒、木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶ELISA檢測(cè)試劑盒和內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)雙孢蘑菇菌傘進(jìn)行酶活力測(cè)定。

1.3.2.3 總RNA的提取與測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建

選擇第0天和第1天的雙孢蘑菇菌傘進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序。用Trizol試劑提取總RNA，取雙孢蘑菇樣品0.1 g，在液氮中充分研磨至粉末后置于1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol抽提液。室溫下放置5～10 min后，12 000 r/min離心15 min，取上清液并加入1/5體積的氯仿，劇烈振蕩15 s后在冰上放置5 min；12 000 r/min離心15 min，取上清液于另一離心管中，加入等體積異丙醇并上下顛倒混勻，在冰上放置15～20 min；12 000 r/min離心15 min后棄去上清液。將沉淀用1 mL 75%乙醇溶液清洗2 次，并于4 ℃、7 500 r/min離心10 min，棄去上清液，室溫下干燥1～2 min即得樣品總RNA。利用凝膠成像系統(tǒng)和酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA的質(zhì)量。完整的RNA具有3 條明顯的條帶，28S、18S和5S rRNA，且28S條帶是18S條帶亮度的2 倍。測(cè)定RNA的濃度和OD260nm/OD280nm值，RNA的OD260nm/OD280nm值介于1.8和2.1之間[14]。樣品檢測(cè)合格后，由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及高通量測(cè)序。

1.3.2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析

高通量測(cè)序中產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)（raw reads）為fastq格式序列。為了得到可進(jìn)行后續(xù)分析的高質(zhì)量reads，需進(jìn)一步對(duì)raw reads進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾。采用Trimmomatic[15]軟件進(jìn)行質(zhì)控并除去接頭，在此基礎(chǔ)上過(guò)濾掉低質(zhì)量的堿基和N堿基，得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。使用hisat2[16]將clean reads比對(duì)到物種的參考基因組，軟件參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)，通過(guò)基因組的比對(duì)率評(píng)估樣本的情況（雙孢蘑菇基因組網(wǎng)址：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/300/575/GCF_000300575.1_Agabi_varbisH97_2/GCF_000300575.1_Agabi_varbisH97_2_genomic.fna.gz）。

Clean reads與參考基因組比對(duì)的結(jié)果，以二進(jìn)制binary文件進(jìn)行儲(chǔ)存?；騀PKM表達(dá)量值采用cufflinks[17]軟件定量。在計(jì)算基因表達(dá)量的差異時(shí)，利用htseqcount[18]軟件得到落到各個(gè)樣本中基因的reads數(shù)目，使用DESeq(2012)R package[19]的estimateSizeFactors函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并使用nbinom Test函數(shù)計(jì)算差異比較的P值和Fold Change值。挑選出Fold Change大于2、P值小于0.05的差異基因，并進(jìn)行差異基因的基因本體（gene ontology，GO）[20]富集分析，以判定差異基因的功能。

1.4 數(shù)據(jù)處理

雙孢蘑菇個(gè)體大小及質(zhì)量測(cè)定設(shè)置10 組平行，其余指標(biāo)的測(cè)定設(shè)3 組平行，在熒光定量結(jié)果分析時(shí)，設(shè)內(nèi)參基因的表達(dá)值為1。采用Origin 8.5.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，JMP 10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，利用Duncan法進(jìn)行多重分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA處理對(duì)雙孢蘑菇個(gè)體大小的影響

表1 不同處理對(duì)雙孢蘑菇個(gè)體大小的影響Table 1 Effect of different treatments on the size of A.bisporus

由表1可知，與對(duì)照組相比，50 μmol/L MeJA能顯著促進(jìn)雙孢蘑菇個(gè)體增大。在噴施MeJA后的第1天，經(jīng)50 μmol/L MeJA處理的雙孢蘑菇平均單菇質(zhì)量、菌傘直徑和菌傘厚度均顯著高于其他組（P＜0.05），其中平均單菇質(zhì)量約為其他組雙孢蘑菇的2 倍。處理后第2天，50 μmol/L MeJA處理的雙孢蘑菇平均單菇質(zhì)量和大小仍顯著高于其他組（P＜0.05），且基本達(dá)到采收期的大小。處理后第3天，各組雙孢蘑菇均達(dá)到采收期大小，無(wú)顯著差異。結(jié)果表明50 μmol/L MeJA能促進(jìn)雙孢蘑菇的個(gè)體增大，使雙孢蘑菇提前1 d生長(zhǎng)至采收期大小。因此本研究促進(jìn)雙孢蘑菇個(gè)體增大的最佳MeJA濃度為50 μmol/L，后續(xù)結(jié)果分析中的MeJA處理均指代50 μmol/L MeJA處理。

2.2 MeJA處理對(duì)雙孢蘑菇生長(zhǎng)相關(guān)酶活力的影響

圖1 不同處理對(duì)雙孢蘑菇細(xì)胞色素P450氧化酶（A）、木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶（B）和內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶（C）活力的影響Fig.1 Effect of different treatments on the activities of cytochrome P450 oxidase (A), xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (B) and endo-β-1,4-glucanase (C) in A.bisporus

由圖1可知，經(jīng)50 μmol/L MeJA噴施處理后，雙孢蘑菇中細(xì)胞色素P450氧化酶活力在第1、3天顯著增加（P＜0.05），第2天酶活力與其他組相比無(wú)顯著差異。MeJA處理對(duì)雙孢蘑菇中木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶活力并無(wú)明顯的調(diào)控趨勢(shì)。3 組雙孢蘑菇樣品中內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活力在處理后第1天無(wú)顯著差異，第2天處理組酶活力顯著高于空白組和乙醇組（P＜0.05）。因此，MeJA可能通過(guò)誘導(dǎo)增加細(xì)胞色素P450氧化酶、內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶的活力促進(jìn)雙孢蘑菇的個(gè)體增大。

2.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表2 樣品測(cè)序產(chǎn)出數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估情況Table 2 Quality assessment of sequencing output data of samples

由表2可知，對(duì)雙孢蘑菇不同處理的樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序，獲得的原始片段均高于48×106，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量預(yù)處理后，對(duì)整個(gè)質(zhì)控過(guò)程中的reads數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)匯總得到超過(guò)45×106的剩余片段，且有效基數(shù)均高于89%。4 組樣本的平均Q30值分別為91.49%、91.77%、92.29%和90.99%，平均GC相對(duì)含量分別為49.91%、49.93%、49.87%和49.87%。由此可見(jiàn)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的數(shù)據(jù)數(shù)量和質(zhì)量都較高，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，可用于后續(xù)研究分析。

2.4 與參考基因組比對(duì)分析

表3 Reads與參考基因組比對(duì)情況Table 3 Results of reads mapping to the reference genome

為了檢查測(cè)序得到的基因文庫(kù)是否滿足后續(xù)基因表達(dá)的計(jì)算，將有效序列與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，獲取在參考基因組或基因上的位置信息，以及測(cè)序樣品特有的序列特征信息。由表3 可知，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的有效序列中，能定位到基因組上的序列片段占比均在92.97%～94.34%范圍內(nèi)。在參考序列上，具有多個(gè)比對(duì)位置的序列片段占比均在0.98%～1.18%范圍內(nèi)；具有唯一比對(duì)位置的序列片段占比在91.79%～93.36%范圍內(nèi)；比對(duì)到基因組上正鏈的序列片段占比在45.88%～46.67%范圍內(nèi)，比對(duì)到負(fù)鏈上的序列片段占比均在45.91%～46.69%范圍內(nèi)。定位到基因組上的序列片段中，能整段比對(duì)到外顯子占比在53.28%～55.08%范圍內(nèi)，分段比對(duì)到外顯子占比在38.22%～39.12%范圍內(nèi)。該結(jié)果表明所有文庫(kù)基本檢測(cè)到了組織內(nèi)所有表達(dá)的基因，滿足后續(xù)基因的表達(dá)計(jì)算。

2.5 差異基因整體分布情況分析

圖2 CT1 vs CK（A）、ET1 vs CK（B）、MJ1 vs CK（C）差異基因表達(dá)MA圖Fig.2 MA plots of differentially expressed genes in CT1 vs CK (A),ET1 vs CK (B) and MJ1 vs CK (C)

通過(guò)MA圖[21]可以了解差異表達(dá)基因的整體分布情況。如圖2所示，在3 個(gè)對(duì)比處理組中，MJ1 vs CK組的顯著差異基因最多。CT1與CK比較，共篩選得到267 個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因134 個(gè)，下調(diào)基因133 個(gè)；ET1與CK比較，共篩選得到243 個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因93 個(gè)，下調(diào)基因150 個(gè)；MJ1與CK比較，共篩選得到525 個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因212 個(gè)，下調(diào)基因313 個(gè)。結(jié)果表明經(jīng)50 μmol/L MeJA處理后，雙孢蘑菇中基因變化差異最大，這種變化可能與雙孢蘑菇更快速的生長(zhǎng)活動(dòng)相關(guān)，說(shuō)明MeJA通過(guò)影響基因的差異表達(dá)促進(jìn)雙孢蘑菇的個(gè)體增大。

2.6 差異基因GO富集分析

GO富集分析可以為基因產(chǎn)物提供三類描述，即生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能，通過(guò)差異基因的GO富集分析，可研究基因的功能，如圖3所示，在3 個(gè)對(duì)比處理組中，CT1 vs CK、ET1 vs CK和MJ1 vs CK中的總上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因數(shù)分別為64和46、44和53、95和126。在生物過(guò)程這一功能分類中，3 組處理中大多數(shù)差異表達(dá)基因都富集在細(xì)胞過(guò)程條目，其中，MJ1 vs CK組中有52 個(gè)上調(diào)基因和54 個(gè)下調(diào)基因，顯著多于CT1 vs CK組中的38 個(gè)上調(diào)基因、18 個(gè)下調(diào)基因和ET1 vs CK組中的21 個(gè)上調(diào)基因和21 個(gè)下調(diào)基因。在細(xì)胞成分分類中，MJ1 vs CK組中有59 個(gè)上調(diào)基因和68 個(gè)下調(diào)基因富集在細(xì)胞這一條目，而CT1 vs CK組中只有43 個(gè)上調(diào)基因和23 個(gè)下調(diào)基因、ET1 vs CK組中25 個(gè)上調(diào)基因和27 個(gè)下調(diào)基因富集在該GO條目。分子功能中催化活性這一GO條目包含了大多數(shù)差異表達(dá)基因，其中MJ1 vs CK組中有69 個(gè)上調(diào)基因和84 個(gè)下調(diào)基因，多于CT1 vs CK組中48 個(gè)上調(diào)基因和32 個(gè)下調(diào)基因以及ET1 vs CK組中32 個(gè)上調(diào)基因和38 個(gè)下調(diào)基因。這些基因功能都與雙孢蘑菇的生長(zhǎng)代謝相關(guān)，說(shuō)明MeJA可以通過(guò)影響以上GO條目中基因的差異表達(dá)促進(jìn)雙孢蘑菇的個(gè)體增大。

2.7 雙孢蘑菇個(gè)體增大相關(guān)基因篩選

表4 雙孢蘑菇個(gè)體增大相關(guān)基因篩選結(jié)果Table 4 Screening results of genes related to the size of A.bisporus

從基因文庫(kù)中篩選表達(dá)差異最顯著的部分基因，見(jiàn)表4。篩選得到的基因多為未注釋的基因，且多為下調(diào)表達(dá)，僅基因AGABI2DRAFT_43781和A G A B I 2 D R A F T_1 3 8 3 4 3 上調(diào)表達(dá)。其中基因AGABI2DRAFT_136361與疏水蛋白的形成有關(guān)；基因AGABI2DRAFT_188444與鋅金屬蛋白酶的編碼相關(guān)；基因AGABI2DRAFT_194024參與編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶；基因AGABI2DRAFT_43781與非特異膜蛋白形成相關(guān)。該篩選結(jié)果表明MeJA可以通過(guò)影響以上基因的差異表達(dá)來(lái)促進(jìn)雙孢蘑菇的個(gè)體增大。

圖3 CT1 vs CK（A）、ET1 vs CK（B）、MJ1 vs CK（C）差異基因GO富集結(jié)果Fig.3 GO enrichment analysis of differentially expressed genes in CT1 vs CK (A), ET1 vs CK (B) and MJ1 vs CK (C)

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明50 μmol/L MeJA能促進(jìn)雙孢蘑菇個(gè)體增大，提前1 d達(dá)到采收期大小。與以往在覆土層中添加一定量的豆粕[22]、石灰石[23]或惡臭假單胞菌[24]等提高雙孢蘑菇品質(zhì)的方式相比，外源噴施MeJA簡(jiǎn)化了生產(chǎn)過(guò)程，同時(shí)，每1 m2菇床只需要噴施0.327 μL MeJA，減少了原料投入，提高了經(jīng)濟(jì)效益。

雙孢蘑菇生長(zhǎng)過(guò)程中，處理組細(xì)胞色素P450氧化酶活力在第1、3天顯著高于空白組和乙醇組，內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活力在第2天顯著高于其他組。楊杰等[25]指出細(xì)胞色素P450單加氧酶（CYP450）是植物代謝過(guò)程中最大的酶家族，參與三萜和甾醇骨架結(jié)構(gòu)的多樣化以及功能修飾，三萜類化合物和甾醇在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。戴永國(guó)等[26]研究表明細(xì)胞色素P450家族酶參與很多與發(fā)育相關(guān)的內(nèi)源性物質(zhì)的代謝，進(jìn)而影響機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育。內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶是一種纖維素酶，可以從多種材料中消化纖維素，如纖維素、β-1,4-葡聚糖[27]。張新富等[28]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶與茌梨果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶能夠促進(jìn)組織的快速生長(zhǎng)以及果實(shí)的成熟[29]。因此MeJA可能通過(guò)誘導(dǎo)增加細(xì)胞色素P450氧化酶、內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活力，促進(jìn)雙孢蘑菇的個(gè)體增大。

雙孢蘑菇的生長(zhǎng)由很多基因決定。有研究表明hypB基因、ATP合成酶亞基編碼基因AtpD和隔膜蛋白編碼基因SepA對(duì)雙孢蘑菇子實(shí)體的良好發(fā)育具有重要作用[30]；翻譯延長(zhǎng)因子1a基因?qū)S持雙孢蘑菇成熟細(xì)胞的形態(tài)具有重要作用，C2H2型鋅指蛋白、真菌特異性轉(zhuǎn)錄因子、熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子hsf1[12]；疏水蛋白基因hypA、脲酶基因及起滲透調(diào)節(jié)作用的甘露醇脫氫酶基因參與了雙孢蘑菇子實(shí)體的形成過(guò)程[31-32]。本研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究50 μmol/L MeJA對(duì)雙孢蘑菇個(gè)體的促增大作用，檢測(cè)到雙孢蘑菇生長(zhǎng)過(guò)程中富集在細(xì)胞過(guò)程、細(xì)胞、催化活性等GO條目中的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)基因數(shù)目均顯著增加，這些功能條目均與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，結(jié)果表明MeJA通過(guò)影響這些GO條目中基因的差異表達(dá)促進(jìn)雙孢蘑菇的個(gè)體增大。從差異基因中篩選的差異最顯著部分基因中，有功能注釋的基因AGABI2DRAFT_136361、AGABI2DRAFT_188444、AGABI2DRAFT_194024和AGABI2DRAFT_43781分別與疏水蛋白、鋅金屬蛋白酶、細(xì)胞色素P450單加氧酶和非特異膜蛋白的形成相關(guān)。疏水蛋白參與真菌許多形態(tài)發(fā)生過(guò)程，包括分生孢子萌發(fā)、子實(shí)體發(fā)育[33]。含鋅金屬蛋白酶可參與調(diào)控多種細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的活動(dòng)，如調(diào)節(jié)纖維素的沉積[34]，進(jìn)而影響機(jī)體組織等的發(fā)育[35]。細(xì)胞色素P450單加氧酶可在植物發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著特異性調(diào)節(jié)作用[36]。膜脂結(jié)構(gòu)存在許多膜蛋白，包括各種酶、蛋白轉(zhuǎn)位酶復(fù)合物以及許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在生物體細(xì)胞的增殖和分化、能量轉(zhuǎn)換、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)仍S多生命活動(dòng)中起著非常重要的作用[37]。這些基因都參與雙孢蘑菇的生長(zhǎng)發(fā)育，均與雙孢蘑菇的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，說(shuō)明MeJA可能通過(guò)調(diào)控這些差異基因的表達(dá)促進(jìn)雙孢蘑菇的個(gè)體增大。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能更深入、全面地從整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，這也為后續(xù)進(jìn)一步差異基因的功能驗(yàn)證、差異基因受MeJA調(diào)控在雙孢蘑菇生長(zhǎng)期間的功能解析及MeJA促進(jìn)雙孢蘑菇個(gè)體增大調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的精確描繪提供了理論依據(jù)。

因此，50 μmol/L MeJA能促進(jìn)雙孢蘑菇的個(gè)體增大，導(dǎo)致雙孢蘑菇個(gè)體增大的原因可能是50 μmol/L M e J A 處理后，雙孢蘑菇生長(zhǎng)過(guò)程中一些基因的表達(dá)、生長(zhǎng)代謝活動(dòng)以及一些酶活力受到調(diào)控。其中與生長(zhǎng)相關(guān)的基因A G A B I 2 D R A F T_1 3 6 3 6 1、AGABI2DRAFT_188444和AGABI2DRAFT_194024下調(diào)表達(dá)，基因AGABI2DRAFT_43781上調(diào)表達(dá)；富集在細(xì)胞過(guò)程、細(xì)胞、催化活性等與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的GO條目中的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)基因數(shù)目顯著增加；與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)酶細(xì)胞色素P450氧化酶和內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活力顯著增加。