李遠(yuǎn)哲，郭燕軍，胡文潔，施陽(yáng)，侯杰，林新春，宋曉琴，丁顯飛

[1.鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（河南省兒童醫(yī)院），河南 鄭州450018；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450052]

哮喘是兒童時(shí)期常見的慢性氣道疾病之一，我國(guó)兒童的哮喘患病率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響兒童的身心健康。提高哮喘的完全控制率，可提高哮喘患兒生存質(zhì)量、減輕其家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)[1-2]。研究表明維生素D具有抑制氣道重塑、減輕氣道炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞等獨(dú)特作用，其在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[3]；Clara細(xì)胞分泌蛋白16（Clara cell secretory protein 16,CC16）是由位于細(xì)支氣管及終末細(xì)支氣管的Clara細(xì)胞所產(chǎn)生的一類具有抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等生物活性的物質(zhì)，與兒童哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。哮喘控制不理想時(shí)，體內(nèi)多種重要細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-4（Interleukin-4, IL-4）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）水平會(huì)發(fā)生變化，并對(duì)疾病的嚴(yán)重程度及轉(zhuǎn)歸有一定指示意義[5-6]。呼出氣一氧化氮（fraction exhaled nitric oxide,FeNO）因無(wú)創(chuàng)、安全有效，在哮喘的診治中越來(lái)越受到重視。本研究旨在探討不同控制水平的哮喘患兒血清25-羥維生素D3[25（OH）D3]、CC16、IL-4、VEGF水平和FeNO的變化及其之間的關(guān)聯(lián)，以期為提高及動(dòng)態(tài)評(píng)估哮喘兒童的控制水平提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年10月—2018年6月鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院診治的哮喘患兒106 例作為研究對(duì)象。哮喘的診斷及控制水平分級(jí)參考《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[7]。選取同期該院健康體檢兒童為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①6～16 歲，可配合完成FeNO 檢測(cè)，檢測(cè)前未食用富含氮的食物（如動(dòng)物內(nèi)臟、菠菜等）；②6 個(gè)月內(nèi)無(wú)維生素D 攝入者；③4 周內(nèi)無(wú)呼吸道感染病史；④2 周內(nèi)無(wú)全身使用糖皮質(zhì)激素者；⑤無(wú)自身免疫缺陷性疾病、先天性心臟病、無(wú)明確過(guò)敏性疾病等基礎(chǔ)疾病。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及家屬知情同意。106 例哮喘患兒分為良好控制組59 例，男性31 例，女性28 例，年齡（11.3±5.1）歲；部分控制組26 例，男性11例，女性15例，年齡（9.1±4.6）歲；未控制組21例，男性12例，女性9例，年齡（7.4±3.5）歲。對(duì)照組50例，男性27例，女性23例，年齡（7.7±4.1）歲。各組年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 血清25（OH）D3、CC16、IL-4及VEGF水平檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清25（OH）D3、CC16、IL-4 及VEGF 水平。哮喘患兒及健康體檢兒童空腹抽取靜脈血2 ml，室溫靜置10～20 min 后，2 000 r/min 離心10 min，離心半徑為13.5 cm，存放于-80℃冰箱冷凍待測(cè)。25（OH）D3、IL-4、CC16、VEGF 的ELISA 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Ray Biotech 公司，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3 FeNO檢測(cè)

FeNO 檢測(cè)儀采用瑞典Aerocrine 公司的NIOX 分析儀，哮喘患兒和健康體檢兒童的FeNO 值參照美國(guó)胸科學(xué)會(huì)/歐洲呼吸學(xué)會(huì)推薦標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 和GraphPad Prism 7 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-±s）表示，比較采用方差分析或H檢驗(yàn)，方差分析兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，相關(guān)分析用Pearson 法，繪制ROC 曲線，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清25（OH）D3、CC16、IL-4、VEGF水平及FeNO 比較

各組血清25（OH）D3、CC16、IL-4、VEGF 水平及FeNO值的比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；未控制組、部分控制組及良好控制組患兒血清中25（OH）D3、CC16 水平低于對(duì)照組（P＜0.05），未控制組低于部分控制組及良好控制組（P＜0.05），部分控制組低于良好控制組（P＜0.05）；未控制組、部分控制組及良好控制組患兒血清中IL-4、VEGF 水平高于對(duì)照組（P＜0.05），未控制組高于部分控制組及良好控制組（P＜0.05），部分控制組高于良好控制組（P＜0.05）；未控制組、部分控制組及良好控制組患兒FeNO值高于對(duì)照組（P＜0.05），未控制組高于良好控制組及部分控制組（P＜0.05），部分控制組高于良好控制組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組血清25（OH）D3、CC16、IL-4、VEGF水平及FeNO值比較 （±s）

表1 各組血清25（OH）D3、CC16、IL-4、VEGF水平及FeNO值比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與未控制組比較，P ＜0.05；③與部分控制組比較，P ＜0.05。1 ppb=10-9。

組別n FeNO/ppb 25（OH）D3/（ng/ml）CC16/（μg/L）IL-4/（ng/L）VEGF/（pg/ml）對(duì)照組未控制組部分控制組良好控制組F值P值50 21 26 59 13.455±12.50 37.727±7.99①26.033±7.18①②21.925±2.751①②③53.396 0.001 37.212±3.113 22.475±1.784①27.621±3.617①②31.238±1.712①②③76.243 0.001 23.134±2.354 11.292±3.771①14.514±3.156①②19.375±3.374①②③41.134 0.001 12.534±9.623 25.165±6.424①21.261±2.031①②16.932±4.071①②③115.465 0.001 209.844±2.80 314.062±6.76①277.124±3.77①②220.061±0.764①②③244.973 0.001

2.2 血清25（OH）D3與CC16、IL-4、VEGF及FeNO的相關(guān)性

哮喘患兒血清25（OH）D3與CC16 呈正相關(guān)（P＜0.05）；與CC16、IL-4、VEGF 及FeNO 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表2和圖1、2。

2.3 血清25（OH）D3、CC16、IL-4、VEGF及FeNO對(duì)哮喘未控制的診斷價(jià)值

血清25（OH）D3、CC16、IL-4、VEGF 及FeNO5 種因子診斷哮喘未控制的ROC 曲線下面積分別為0.902、0.764、0.671、0.685 和0.859（P＜0.05）；最佳診斷截點(diǎn)分別為18.523 ng/ml、10.741 μg/L、27.392 ng/L、314.273 pg/ml 和38.273 ppb；診斷敏感性分別為89.2%、82.7%、91.3%、69.6%和78.6%；特異性分別為83.6%、76.4%、49.1%、64.9% 和58.2%。見表3和圖3。

表2 血清25（OH）D3與CC16、IL-4、VEGF及FeNO的相關(guān)性

圖1 血清25（OH）D3與CC16和IL-4的相關(guān)性

圖2 血清25（OH）D3與VEGF和FeNO的相關(guān)性

表3 血清25（OH）D3、CC16、IL-4、VEGF及FeNO對(duì)哮喘未控制的診斷價(jià)值

圖3 25（OH）D3、CC16、IL-4、VEGF及FeNO對(duì)哮喘未控制診斷效能的ROC曲線

3 討論

哮喘的管理模式及治療手段在不斷改進(jìn)，但其控制率未見明顯提高，其規(guī)范化管理及治療目標(biāo)之一是獲得良好的癥狀控制。哮喘長(zhǎng)期治療方案的制訂及調(diào)整以其控制水平為依據(jù)，可使多數(shù)哮喘患兒得到更有效的治療，達(dá)到臨床控制的目的[7-9]。

維生素D 是哮喘發(fā)生、發(fā)展中有重要調(diào)控作用的脂溶性維生素，有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫等生物活性作用。目前認(rèn)為，25（OH）D3是人體血清維生素D的表達(dá)形式，檢測(cè)血清25（OH）D3可評(píng)估人體維生素D 水平[10]。在對(duì)哮喘患兒的研究中發(fā)現(xiàn)，相較于患兒的哮喘家族史及血清IgE水平，維生素D的缺乏對(duì)評(píng)估患兒哮喘控制水平更具臨床指導(dǎo)意義，是哮喘較強(qiáng)的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一，缺乏維生素D 的兒童其哮喘發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是維生素D水平正常兒童的6.3倍[11-12]。哮喘兒童維生素D 水平低的原因可能是哮喘患兒外出活動(dòng)較少，接受日照的強(qiáng)度及時(shí)間低于正常兒童，此外，部分患兒存在對(duì)富含維生素D 的食物過(guò)敏如海產(chǎn)品、堅(jiān)果類、牛奶、雞蛋等。本研究納入哮喘患兒106 例，未控制組為21 例，部分控制組為26例，未完全控制患兒共47 例，占44.34%，未完全控制率較高，對(duì)哮喘的控制情況不容樂觀，提高哮喘完全控制率的任務(wù)依舊艱巨。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒血清25（OH）D3水平低于健康體檢兒童，哮喘患兒中，未控制組低于良好控制組及部分控制組，隨著血清25（OH）D3水平的升高，哮喘的控制率也隨之升高，這提示血清25（OH）D3水平與哮喘病情的控制有相關(guān)性。其機(jī)制可能是維生素D 能影響哮喘發(fā)病的相關(guān)重要信號(hào)通路，如Toll 樣受體（TLRs）通路、VDR 信號(hào)通路、酪氨酸蛋白激酶轉(zhuǎn)錄激活因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（JAK-STAT），可調(diào)節(jié)患兒Th1/Th2 細(xì)胞平衡，并促進(jìn)細(xì)胞分化及增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，阻止呼吸道平滑肌細(xì)胞的遷移，進(jìn)而減輕氣道炎癥反應(yīng)，抑制呼吸道重塑及高反應(yīng)性。動(dòng)態(tài)檢測(cè)哮喘患兒血清維生素D 水平，對(duì)于維生素D 缺乏的哮喘患兒，及時(shí)補(bǔ)充維生素D 可作為哮喘輔助治療方法之一[13]。哮喘患兒血清25（OH）D3水平較對(duì)照組兒童降低，其與哮喘控制水平有關(guān)，與CC16 呈正相關(guān)，與IL-4、VEGF 及FeNO 呈負(fù)相關(guān)。有研究顯示維生素D可降低IL-4 的表達(dá)，減輕氣道炎癥反應(yīng)，與本研究結(jié)果一致[14]。本研究結(jié)果顯示，血清25（OH）D3對(duì)哮喘未控制的診斷敏感性及特異性均較高，診斷哮喘未控制的臨界值為18.523 ng/ml，且ROC 曲線下面積最大，表明血清25（OH）D3對(duì)哮喘患兒尤其是未控制的患兒診斷效能優(yōu)于CC16、IL-4、VEGF 及FeNO，提示監(jiān)測(cè)血清25（OH）D3水平對(duì)于預(yù)測(cè)哮喘控制水平、評(píng)價(jià)診療效果、調(diào)整治療方案等具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

Clara 細(xì)胞是分布于呼吸道終末細(xì)支氣管黏膜上的非纖毛細(xì)胞，其分泌蛋白CC16 具有減輕氣道炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性。其可通過(guò)單核衍生樹突細(xì)胞抑制原始T細(xì)胞向Th2分化，減輕哮喘炎癥反應(yīng)[15]。目前證實(shí)，在基因水平CC16 與兒童哮喘存在一定的關(guān)聯(lián)[16]，有研究顯示[17]，CC16 基因型為GA 和AA 的患兒更易發(fā)生中度及重度哮喘，且對(duì)常規(guī)治療方案反應(yīng)更差。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒血清CC16 水平低于對(duì)照組兒童，哮喘患兒中，未控制組低于良好控制組及部分控制組，提示血清CC16 水平與哮喘病情控制相關(guān)，CC16 ROC 曲線下面積為0.764，敏感性及特異性均較高，提示檢測(cè)CC16 對(duì)評(píng)估哮喘控制水平有一定的價(jià)值。有學(xué)者認(rèn)為外源補(bǔ)充CC16 后，可減輕哮喘癥狀、減少哮喘發(fā)生次數(shù)，這或許為治療兒童哮喘的新藥物帶來(lái)啟示[4]。

IL-4 作為Th2 的一項(xiàng)功能指標(biāo)，可間接反映Th1/Th2 的變化，其還是IgE 的特異性誘導(dǎo)劑，可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的聚集，導(dǎo)致氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性[18]。VEGF 是新生血管最重要的調(diào)控因子之一，參與氣道慢性炎癥反應(yīng)及氣道重塑[19]。本研究中，哮喘患兒血清IL-4、VEGF 水平高于對(duì)照組兒童，哮喘患兒中，未控制組高于良好控制組及部分控制組，提示血清IL-4、VEGF 水平與哮喘病情控制相關(guān)，證明其在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中具有重要指示作用，其濃度的高低也可反映哮喘的控制程度。

FeNO 檢測(cè)是一種簡(jiǎn)單有效的評(píng)估氣道炎癥疾病的無(wú)創(chuàng)性檢查方法，F(xiàn)eNO 的升高與氣道高反應(yīng)性及炎癥密切相關(guān)，可作為評(píng)估哮喘患兒氣道炎癥控制水平的可靠指標(biāo)[20]。有研究顯示，將FeNO 作為哮喘管理的一部分能減少吸入激素量并減少急性發(fā)作次數(shù)，病情能得到更好的控制[21]。本研究顯示，哮喘患兒FeNO高于對(duì)照組兒童，哮喘患兒中，未控制組高于良好控制組及部分控制組，且FeNO對(duì)未控制哮喘患兒的敏感性較高，提示其對(duì)哮喘患兒尤其是哮喘控制不理想時(shí)具有較高的診斷意義。行動(dòng)態(tài)FeNO監(jiān)測(cè)，可對(duì)哮喘患兒進(jìn)行更準(zhǔn)確的病情評(píng)估，更及時(shí)地調(diào)整治療方案。

綜上所述，哮喘患兒血清25（OH）D3、CC16 水平低于健康體檢兒童，F(xiàn)eNO 高于健康體檢兒童，且都與哮喘控制水平相關(guān)。25（OH）D3及CC16 可作為評(píng)估哮喘患兒控制水平的較理想的生物學(xué)標(biāo)志物，而外源補(bǔ)充維生素D 及CC16 或許能成為治療兒童哮喘的輔助方式之一。這還需要多中心、大樣本的研究進(jìn)一步證實(shí)。