趙守香 郭琴 李穎 王濤 田勝南 蔡曉珊

目前肺癌在全球癌癥發(fā)病率中位居第一，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）國際癌癥研究署發(fā)布的癌癥報告顯示，2018 年全球肺癌新發(fā)病例約有209 萬例，死亡患者約176 萬例，分別占惡性腫瘤新發(fā)病例及死亡病例的11.6%和18.4%，居惡性腫瘤第1 位，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在肺癌中占80%～85%［1］。當(dāng)前治療肺癌的主要措施除了手術(shù)、放療、化療，還有靶向治療和免疫治療。隨著酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）靶向藥物治療在NSCLC患者中廣泛應(yīng)用，其無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）較單純化療明顯延長，但到目前為止，尚無針對KRAS 基因突變靶點(diǎn)的有效藥物廣泛應(yīng)用于國內(nèi)臨床，所以對KRAS 基因突變的NSCLC 患者的治療方案仍是一個懸而未解的問題［2］。本研究收集2018 年9 月—2020 年9 月453 例NSCLC 患者的臨床資料，總結(jié)并分析是否存在KRAS 基因突變患者的臨床病理特征，旨在深入了解KRAS 基因突變，從而指導(dǎo)臨床進(jìn)行個體化治療，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇濰坊市第二人民醫(yī)院2018 年9 月—2020 年9 月進(jìn)行手術(shù)切除、纖維支氣管鏡和穿刺活檢經(jīng)病理確診且資料完整的453 例原發(fā)性NSCLC 患者作為研究對象。標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定、石蠟包埋、切片以及蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，并確定腫瘤細(xì)胞數(shù)量足夠，再進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。分類整理所有患者的臨床資料，包括一般情況（性別、年齡、吸煙史）和臨床病理資料（包括病理組織學(xué)類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況）。

1.2 試劑與儀器 石蠟切片組織基因組DNA 提取試劑盒、5 種突變基因檢測試劑盒均購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司；SLAN-96S 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司），Eppendorf 微量紫外分光光度計。

1.3 檢測方法

1.3.1 石蠟切片標(biāo)本組織的基因組DNA 提取 評估腫瘤細(xì)胞含量后，使用一次性切片刀切取4～12片組織切片，置于潔凈的1.5 mL 離心管中，按照DNA提取試劑盒說明書示范操作進(jìn)行DNA 抽提。使用Eppendorf SMA4000 微量紫外分光光度計測定DNA的純度及含量。

1.3.2 KRAS 基因突變檢測 采用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）擴(kuò)增KRAS 基因的12 和13 密碼子。操作方法依據(jù)試劑盒說明書，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：42 ℃ 5 min；95 ℃5 min，1 個循環(huán)；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，10 個循環(huán)；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，36 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，由熒光定量PCR 儀輸出擴(kuò)增曲線，根據(jù)試劑盒說明書中的判讀原則來確定突變。每次ARMS 分析實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陽性及陰性對照，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4 倫理學(xué) 本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)本院倫理審批（審批號：20201225），所有檢測均獲得過患者或家屬的知情同意。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)比較KRAS 基因突變及其各突變類型NSCLC 患者的臨床病理特征。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 患者腫瘤組織KRAS 基因突變情況在453 例接受5 種基因突變檢測的NSCLC 患者中，檢出KRAS 基因突變50 例，總突變率為11.04%。該試劑盒檢測出兩種突變類型，分別為G12D/S 型突變6 例，突變率為1.32%，以及G12A/V/R/C、G13C 型突變44 例，突變率為9.71%。見表1。

表1 453 例NSCLC 患者腫瘤組織KRAS 基因突變情況

2.2 不同臨床病理特征NSCLC 患者的KRAS 基因突變情況比較 男性、腺癌、有吸煙史的NSCLC 患者更易發(fā)生KRAS 基因突變，其突變率明顯高于女性、其他類型癌癥以及無吸煙史的NSCLC 患者（均P＜0.05）。雖然KRAS 基因突變率在不同年齡、臨床分期以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者中不同，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征453 例NSCLC 患者的KRAS 基因突變情況

2.3 不同臨床病理特征NSCLC 患者KRAS 基因的突變類型分布 試劑盒檢測出的KRAS 基因兩種突變類型在不同性別、年齡、病理類型、臨床分期、有無吸煙史以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者中比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表3。

表3 不同臨床病理特征50 例NSCLC 患者的KRAS 基因突變分型分布

3 討論

KRAS 是NSCLC 患者中常見的突變癌基因之一，已知參與肺癌發(fā)生以及腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散等多個過程［3］。NSCLC 患者中約有20%～30%存在KRAS 基因突變，在大多數(shù)情況下，KRAS 基因突變是由于外顯子2、密碼子12 和13 的錯義突變，但也存在更罕見的等位基因突變［4］。KRAS 基因與大鼠V-Ha-Ras Harvey 肉瘤病毒癌基因和神經(jīng)母細(xì)胞瘤RAS 病毒癌基因一起編碼一個膜結(jié)合的相對分子質(zhì)量為21 000 的鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）結(jié)合蛋白家族，該家族通過與多種效應(yīng)物的相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和凋亡，這些效應(yīng)物包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）以及磷酸肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）信號通路［5］。

KRAS 基因在歐美國家NSCLC 患者中的突變頻率較高，在肺腺癌患者中突變率可達(dá)到30%～50%，但亞洲地區(qū)的KRAS 基因突變率低于歐美地區(qū)，約為10%［6-7］。KRAS 基因突變與患者的臨床病理特征、腫瘤組織學(xué)、種族差異以及有無吸煙史有一定相關(guān)性［8］。KRAS 基因突變常發(fā)生在肺腺癌患者中（突變率約為30%），而在鱗狀細(xì)胞癌患者中較少見（突變率約為5%）［9］；且該突變與吸煙習(xí)慣存在明顯相關(guān)性［5］。本研究中NSCLC 患者的KRAS 基因突變率為11.04%，且該突變較易發(fā)生于有吸煙史的男性患者中，這與文獻(xiàn)報道一致［10］。本研究結(jié)果還顯示，KRAS 基因中G12D/S 型和G12A/V/R/C、G13C 型這兩種突變類型在不同性別、年齡、臨床分期、病理類型、有無吸煙史以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者中存在差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義。由于本研究中KRAS 基因突變病例數(shù)較少，它們之間是否具有相關(guān)性還需進(jìn)一步的研究。

據(jù)文獻(xiàn)報道，KRAS 基因不同突變亞型的生物學(xué)功能不同，可能與鳥苷三磷酸酶（GTPase）活性存在差異有關(guān)［11］，這就為探討KRAS 基因不同突變亞型與預(yù)后之間的關(guān)系提出了必要性，但關(guān)于這方面的研究結(jié)果在既往文獻(xiàn)報道中并不一致。Cai 等［12］研究表明，存在KRAS 基因G12D 型突變的患者PFS和總生存期（overall survival，OS）均比KRAS 基因G12C 型突變和G12V 型突變的患者短。隨著對KRAS 突變型NSCLC 的研究，越來越多的文獻(xiàn)表明，KRAS 基因突變型NSCLC 實(shí)際上是一種異質(zhì)性疾病，可能由共同發(fā)生改變的染色體定義的分子亞群導(dǎo)致。在某些情況下同時發(fā)生的基因突變似乎在不同程度上調(diào)控了細(xì)胞內(nèi)的生理過程，并影響腫瘤在其微環(huán)境中的行為［13-15］。因此，在一項回顧性分析中，研究者分析了NSCLC 患者中常見的KRAS 基因突變亞型和同時并發(fā)其他致病性基因突變對患者OS 的影響以及這些基因突變?nèi)绾斡绊懩[瘤PD-L1的表達(dá)，結(jié)果表明，KRAS 基因G12D 和STK11 共突變與患者預(yù)后不良有關(guān)［16］。KRAS 基因G12C 和TP53 共突變與PD-L1 陽性表達(dá)相關(guān)，預(yù)示著對此種突變型患者應(yīng)用抗PD-1/PD-L1 免疫治療可能有效。

目前KRAS 基因突變NSCLC 患者的常用治療方法仍為含鉑雙藥化療，患者的預(yù)后相對較差。湯偉忠等［17］采用巖舒復(fù)方苦參注射液聯(lián)合紫杉醇+順鉑化療方案治療NSCLC 取得良好療效。另一方面有研究表明，對KRAS 基因突變的NSCLC 患者應(yīng)用吉非替尼靶向治療，效果并不顯著，且存在天然耐藥趨勢［18］。該如何治療此類患者的問題一直困擾著臨床醫(yī)生。近年來，一些針對G12C 型突變抑制劑的研究逐漸成為靶向治療KRAS 基因突變NSCLC的主流方向。前期臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AMG510 小分子抑制劑在KRAS 基因G12C 型突變的晚期肺癌患者中顯示出有潛力的療效以及可控的安全性［19］，期待后續(xù)的相關(guān)臨床研究結(jié)果。另外，近年來免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）作為一種挽救性治療方法改善了KRAS 基因突變的晚期NSCLC 患者總生存期，這一結(jié)果表明KRAS 基因突變狀態(tài)可能是ICIs 提高生存率的潛在生物標(biāo)志物［20］。這是否預(yù)示著KRAS 基因突變肺癌患者能從單一的含鉑雙藥化療進(jìn)入一個靶向治療及免疫治療的全新時代，有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，對KRAS 基因突變NSCLC 患者的準(zhǔn)確臨床管理對改善該類患者預(yù)后有重要意義。關(guān)注此類患者的KRAS 基因突變情況，并制定精準(zhǔn)的個體化治療方案，可以實(shí)現(xiàn)療效的最大化，提高患者的生活質(zhì)量。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突