生防菌NH-8及其高效突變體誘導(dǎo)番茄抗性的比較

李德全 汪寶華 曹云英 鄧自發(fā)

摘要：在比較枯草芽孢桿菌NH-8及其突變體B2、H7抑菌活性的基礎(chǔ)上，以蘇粉8號(hào)番茄幼苗為試材，比較枯草芽孢桿菌NH-8及其高效突變體對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)、抗性酶活性的影響。結(jié)果表明，NH-8菌株及其高效突變菌株對(duì)番茄生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，接種H7菌株的番茄幼苗其幼苗株高、主莖高度、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別為42.50 cm、282 cm、1498 g/株、4.65 g/株，較清水對(duì)照增加73.04%、276.00%、77.28%、100.43%;2個(gè)高效突變菌株的拮抗能力較枯草芽孢桿菌NH-8有所提高，其促生作用和誘導(dǎo)抗性酶活性大多相應(yīng)增強(qiáng);接種生防菌株H7的番茄葉片過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶活性相對(duì)最大，分別為4.5、55.5、47.6、14.7 U。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌NH-8;突變體;番茄;抗性酶;酶活性;抗性誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)： S641.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）07-0111-04

收稿日期：2020-07-09

基金項(xiàng)目：江蘇省南通市應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（編號(hào)：MS12015089）;南通大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：03080227）。

作者簡(jiǎn)介：李德全（1975―），男，江蘇豐縣人，博士，副教授，從事生物防治和抗性生理研究。E-mail：lidequan@ntu.edu.cn。

芽孢桿菌為芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌，既能產(chǎn)生芽孢以抵抗各種化學(xué)和物理的脅迫，又能產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)抑制病原物，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，在植物病害生物防治中應(yīng)用廣泛[1-5]。誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性保護(hù)是植物產(chǎn)生主動(dòng)抗性的一種表現(xiàn)，經(jīng)典抗性誘導(dǎo)是在植物體上先接種病原菌或誘導(dǎo)物，導(dǎo)致在接種部位產(chǎn)生病斑，進(jìn)而產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，而多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）等酶的活性大小往往與植物抗性強(qiáng)弱有密切關(guān)系[6-9]，可用于指征植物對(duì)病原菌的抗性能力。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）NH-8是從近海海藻分離篩選到的具有良好抑菌活性的產(chǎn)芽孢桿菌[10]，生長(zhǎng)快，能產(chǎn)生抗生素，對(duì)多種植物病原生物具有較強(qiáng)的拮抗作用，是一種能在植物病害防治中發(fā)揮重要作用的生物防治因子[11]。本試驗(yàn)利用比單一誘變更為有效的氮離子注入法[12]對(duì)海洋細(xì)菌NH-8進(jìn)行誘變處理，篩選獲得2株拮抗性能比菌株NH-8更為高效的突變體;在此基礎(chǔ)上，以蘇粉8號(hào)番茄幼苗為試材，測(cè)定接種生防菌NH-8和2株高效突變菌株的番茄葉片多酚氧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等活性水平，并分析比較其對(duì)番茄幼苗的控病促生作用，旨在明確生防菌NH-8和2株突變菌株的誘抗能力，為評(píng)價(jià)該生防菌株的應(yīng)用價(jià)值、生防作用機(jī)制及對(duì)植物病害的有效防治提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌NH-8及其高效突變菌株B2、H7、小麥紋枯病原菌，由南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存提供，供試番茄品種為蘇粉8號(hào)。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

田間盆栽試驗(yàn)于2019年2—5月選擇在南通大學(xué)植物試驗(yàn)園進(jìn)行，室內(nèi)試驗(yàn)在南通大學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3 菌株NH-8及其高效突變株的抑菌活性比較

以小麥紋枯菌為指示菌，采用平板對(duì)峙法驗(yàn)證抑菌活性，其具體操作過程：將菌株NH-8及其2株突變菌株分別移植到牛肉膏、蛋白胨液體培養(yǎng)基中，26℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，備用;將紋枯病病原菌移植到直徑為90 mm的PDA平板上，26 ℃培養(yǎng)48 h;打孔器打孔，將菌塊移植到直徑為90 mm的空白PDA平板中央培養(yǎng)8 h，對(duì)角接種NH-8及其2株高效突變體，26 ℃培養(yǎng)48 h;測(cè)量接種菌株的菌圈直徑，計(jì)算抑制率，重復(fù)6次。抑制率計(jì)算公式：

抑制率=菌圈直徑/45×100%。

式中：45為平板半徑值，mm。

1.4 菌株NH-8及其高效突變菌株對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響

選取生長(zhǎng)相對(duì)一致的番茄幼苗，移栽到按順序擺放、裝有滅菌土的塑料盆中，每盆移栽1株，接種菌含量為1010 CFU/mL的菌株NH-8及其高效突變菌株發(fā)酵液250 mL/株，分別以空白培養(yǎng)基、清水處理為對(duì)照，移栽后15、25 d再用相應(yīng)的溶液處理1次;定植后30 d，每處理隨機(jī)選擇5點(diǎn)，每點(diǎn)選取番茄6株，取出植株，用自來水洗凈，晾干;分別采用直尺、游標(biāo)卡尺測(cè)量株高、短縮莖粗度，采用電子秤稱量植株的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量;稱量干質(zhì)量時(shí)，將番茄植株在烘箱中55 ℃烘干。每次處理試驗(yàn)植株數(shù)為30株，重復(fù)4次。

1.5 番茄葉片抗性酶活性的測(cè)定

1.5.1 接種處理 以番茄幼苗為試材，分別噴施菌含量為1010 CFU/mL的NH-8、H7、B2菌株發(fā)酵液100 mL/株，以噴等量清水為對(duì)照，共計(jì)4個(gè)處理;分別在接種后1、2、3、4、5、6 d取適量番茄葉片，測(cè)定其抗性酶活性，重復(fù)4次。

1.5.2 番茄葉片酶活性測(cè)定方法[13] （1）過氧化物酶和多酚氧化酶。取番茄葉片1.2 g，加入pH值6.8的0.05 mol/L磷酸緩沖液5 mL、石英砂少許，冰浴下研磨成勻漿;4 ℃、12 000 r/min離心 20 min，取上清液，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)。過氧化物酶：以0.18 mol/L愈瘡木酚為底物，室溫反應(yīng) 6 min，以測(cè)定波長(zhǎng)為460 nm的吸光度D420 nm 1 min 增加0.1所需酶量為1個(gè)酶活單位，U;多酚氧化酶：以150 μmol/L聯(lián)苯三酚為底物，反應(yīng)10 min，加人15% H2SO4 中止，以測(cè)定波長(zhǎng)為 420 nm 的吸光度D420 nm 1 min增加0.001所需酶量為1個(gè)酶活單位，U。（2）超氧化物歧化酶和過氧化氫酶。取番茄葉片1.2 g，加入pH值7.8的 0.05 mol/L 緩沖液 5 mL、石英砂少許，冰浴下研磨成勻漿;4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，取上清液，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)。超氧化物歧化酶：測(cè)定波長(zhǎng)為560 nm的吸光度值D560 nm，以抑制氮藍(lán)四唑光化學(xué)反應(yīng)還原50%為1個(gè)酶活性單位，U;過氧化氫酶：測(cè)定以0.2%過氧化氫為底物，室溫反應(yīng)3 min，以測(cè)定波長(zhǎng)為240 nm的吸光度D240 nm 1 min減少0.01所需酶量為1個(gè)酶活單位，U。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株NH-8及其高效突變體的抑菌效果

由表1、圖1可見，菌株NH-8的2個(gè)高效突變體H7、B2的抑菌率分別為80.4%、72.0%，其拮抗能力明顯好于出發(fā)菌株NH-8，分別較菌株NH-8增加23.6、32.0百分點(diǎn);H7菌株對(duì)紋枯病病原菌的拮抗能力最強(qiáng)，其菌落直徑相對(duì)最大，為36.2 cm。

2.2 菌株NH-8及其高效突變體對(duì)番茄幼苗的促生效果

由表2可見，與對(duì)照相比，各個(gè)菌株發(fā)酵液處理對(duì)番茄生長(zhǎng)均有顯著的促生作用（P<0.05），菌株發(fā)酵液處理20 d，番茄幼苗株高、主莖高度、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別顯著高于清水對(duì)照，其中接種H7菌株的番茄幼苗增加相對(duì)最高，幼苗株高、主莖高度、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別為42.50 cm、2.82 cm、14.98 g/株、4.65 g/株，分別較清水對(duì)照顯著增加73.04%、276.00%、77.28%、100.43%（P<0.05）。

2.3 菌株NH-8及其突變體處理對(duì)番茄抗性酶活性的影響

由圖2可見，噴施拮抗菌NH-8及其高效突變株B2、H7菌液，番茄葉片抗氧化酶活性均呈先上升后下降趨勢(shì)。接種H7菌液的番茄葉片其過氧化物酶活性在接種3 d、多酚氧化酶活性在接種4 d、超氧

化物歧化酶活性在接種2 d、過氧化氫酶活性在接種3 d時(shí)達(dá)到最大，4個(gè)酶活性分別為4.5、14.7、55.5、47.6 U，接種6 d時(shí)均接近于對(duì)照水平;B2、H7這2個(gè)高效突變株的防御酶活性多高于出發(fā)菌株NH-8，說明防御酶系的活性隨著拮抗菌株的拮抗能力和促生作用提高而增強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

有研究認(rèn)為，誘導(dǎo)植物獲得系統(tǒng)抗性（SAR）在生防菌防病作用中起重要的作用[14]，而誘導(dǎo)抗病性保護(hù)是植物產(chǎn)生主動(dòng)抗性的一種表現(xiàn)[15]。王美琴等認(rèn)為，生防菌可以影響與植物抗病性相關(guān)的重要酶活性，植物早期防御反應(yīng)可提高木質(zhì)化程度，增強(qiáng)氧化酶活性等，這都與誘導(dǎo)抗病性有關(guān)[16-17]?？莶菅堪麠U菌對(duì)人畜無毒害，對(duì)環(huán)境無污染，具有明顯的抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，本試驗(yàn)采用的枯草芽孢桿菌NH-8對(duì)多種植物病原生物具有較強(qiáng)的拮抗性能，與其高效突變菌株對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)盆栽促生試驗(yàn)結(jié)果顯示，接種H7菌株的番茄幼苗的株高、主莖高度、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別為4250 cm、2.82 cm、14.98 g/株、4.65 g/株，較清水對(duì)照顯著增加73.04%、27600%、77.28%、100.43%（P<0.05）。

生防菌對(duì)植物病害的防病作用可能是促生、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)及誘導(dǎo)宿主抗性產(chǎn)生等多因素綜合作用的結(jié)果[18-19]。拮抗菌株NH-8和突變菌株可以誘導(dǎo)番茄幼苗葉片內(nèi)過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶等與抗病性相關(guān)的防御酶活性大幅度提高，而2個(gè)高效突變株的防御酶活性比出發(fā)菌株NH-8略高。因此，有必要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)高效突變菌株的研發(fā)與應(yīng)用。

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