劉雨，周青，李曉秀，劉波

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院2017級藥學(xué)專業(yè)，遼寧 沈陽110034；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2015級醫(yī)學(xué)影像學(xué)專業(yè)；3.沈陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；4.遼寧省行為與認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)重點實驗室）

帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）是一種神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)生于老年人，主要癥狀包括靜止性震顫、肌僵直、運動功能和姿勢平衡障礙。典型的病理特征為黑質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）神經(jīng)元大量缺失，且有路易小體異常折疊聚集。PD的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為可能與遺傳基因、老齡化、經(jīng)常接觸或暴露于環(huán)境污染物，比如殺蟲劑魚藤酮等各種危險因素相關(guān)［1］?，F(xiàn)有的藥物僅可以緩解癥狀，不能終止或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程。故建立簡便有效的PD模型對于開展病因、發(fā)病機(jī)制、藥物篩選研究具有重大意義。本研究旨在細(xì)胞、腦組織水平，探討魚藤酮對線粒體的影響，為建立魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及實驗動物 PC12細(xì)胞株（大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所。清潔級SD雄性大鼠，6只，體重280～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（京）2006-0009。

1.2 試劑與儀器 RMPI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（FBS）、馬血清（美國HyClone公司）；魚藤酮、DCFH-DA、多聚賴氨酸、ADP（美國Sigma公司）；ATP檢測試劑盒（美國Promega公司）；CCK-8試劑盒（Cell Counting Kit-8）、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1） （碧云天生物技術(shù)研究所）；其他常用化學(xué)試劑均為分析純。細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司），正置顯微鏡（OLYMPUS-IX62），超凈工作臺（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠），AllegraTM X-22R低溫離心機(jī)（美國Beckman公司），Spectra Max M5酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司），線粒體氧耗測定儀（英國SI公司）。

1.3 方法

1.3.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng) 將PC12細(xì)胞以完全RMPI 1640培養(yǎng)基（含10%滅活馬血清，5%胎牛血清，100 U／ml青霉素，100μg／ml鏈霉素，1%谷氨酰胺），于37℃、5%CO2、飽和濕度、無菌條件下培養(yǎng)，每2 d換培養(yǎng)基一次，細(xì)胞呈對數(shù)增長時，進(jìn)行細(xì)胞傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至3.4×104個／孔，接種至96孔培養(yǎng)板，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。制備模型時，正常對照組換用4%血清培養(yǎng)。

1.3.2 CCK-8試劑測定細(xì)胞活力 將不同濃度（0.1、1、2、5μM）魚藤酮處理24、48、72 h后，加入CCK-8試劑，10μl／孔，37℃孵育2 h，450 nm處讀取吸收值。以正常對照組細(xì)胞存活率為100%，計算各組細(xì)胞存活率。

1.3.3 DCFH-DA熒光探針測定細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量 將2μM魚藤酮處理5 h后，棄原液，PBS洗一次，加入含DCFH-DA（終濃度10μM），100μl／孔；37℃孵育20 min，棄染料，PBS洗一次，每孔加入100μl PBS。在激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm下測定熒光值。以對照組ROS含量為100%，計算各組細(xì)胞ROS含量。

1.3.4 熒光素酶發(fā)光法測定細(xì)胞內(nèi)ATP含量 使用CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay（promega G7570），將2μM魚藤酮處理48 h后，室溫放置30 min，加入100μl發(fā)光試劑，振蕩混勻2 min以誘導(dǎo)細(xì)胞裂解，室溫避光放置10 min以穩(wěn)定發(fā)光信號，使用M5酶標(biāo)儀檢測ATP含量。以對照組ATP含量為100%，計算各組細(xì)胞ATP含量。

1.3.5 JC-1熒光探針測定線粒體膜電位（△Ψm） 將細(xì)胞接種24孔板，2μM魚藤酮作用48 h后，棄原液，PBS輕吹、離心、收集細(xì)胞。加入JC-1染色工作液，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min，用染色緩沖液洗滌2次。重懸后分別加入96孔板，測定熒光值。檢測JC-1單體時，激發(fā)光波長490 nm，發(fā)射光波長530 nm；檢測JC-1聚合物時，激發(fā)光波長525 nm，發(fā)射光波長590 nm。

1.3.6 大鼠腦線粒體提取 大鼠斷頭處死后，迅速取出腦組織，去除小腦，稱重。置于預(yù)冷的玻璃甁皿內(nèi)，用預(yù)冷的線粒體分離緩沖液（0.25 M glucose、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、250μg／ml BSA，調(diào)節(jié)pH 7.4）沖洗3次，剝?nèi)パ?，去除淤血，剪成碎塊，轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器，加入分離緩沖液（10 ml／g組織），手動勻漿10次。所得勻漿液以700 g離心10 min，取上清；將上清以10 000 g離心10 min，去除上清，所得沉淀即為線粒體；以分離緩沖液重懸沉淀，10 000 g重復(fù)離心10 min，棄上清，將線粒體沉淀懸于300μl分離緩沖液中。以Bradford方法檢測線粒體蛋白濃度。線粒體制備過程均在4℃環(huán)境下進(jìn)行。

1.3.7 Clark氧電極法測定線粒體呼吸功能 反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)總體積1.0 ml。調(diào)節(jié)氧電極，校正100%氧（連續(xù)攪拌30 min）和0%氧（向反應(yīng)體系加入亞硫酸鈉，將氧氣全部消耗）。向反應(yīng)池加入線粒體呼吸緩沖液920μl（225 mM glucose、5 mM KH2PO4、10 mM Tris-HCl、10 mM KCl、0.2 mM EDTA、100μg／ml BSA，調(diào)節(jié)pH 7.4），穩(wěn)定1 min，依次加入線粒體懸液40μl（終濃度0.5 mg／ml）、魚藤酮10μl（終濃度分別為1、0.1、0.01μM）、底物I共10μl（L-谷氨酸鈉及蘋果酸），出現(xiàn)Ⅱ態(tài)呼吸；加入20μl ADP（終濃度250μM），出現(xiàn)Ⅲ態(tài)呼吸；反應(yīng)足夠長時間，進(jìn)入Ⅳ態(tài)呼吸。再次加入ADP，出現(xiàn)新的Ⅲ態(tài)和Ⅳ態(tài)呼吸。觀察并記錄氧耗曲線，計算線粒體氧化磷酸化參數(shù)：Ⅲ態(tài)呼吸速率（V3）、Ⅳ態(tài)呼吸速率（V4）、呼吸控制指數(shù)（respiration control rate，RCR）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 魚藤酮對PC12細(xì)胞存活率的影響 與對照組比較，PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度的魚藤酮處理24、48、72 h，細(xì)胞存活率呈不同程度的下降（P＜0.05）。其中，2μM的魚藤酮與PC12細(xì)胞共處理48 h，細(xì)胞活力下降為對照組的47.57%。見圖1。

圖1 魚藤酮對PC12細(xì)胞存活率的影響

2.2 魚藤酮對PC12細(xì)胞ROS、ATP含量、線粒體膜電位的影響 與對照組比較，經(jīng)2μM魚藤酮處理5 h后，PC12細(xì)胞的ROS含量顯著升高；2 μM魚藤酮處理48 h后，細(xì)胞ATP含量顯著降低；線粒體膜電位顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 魚藤酮對PC12細(xì)胞ROS、ATP含量、線粒體膜電位的影響

2.3 魚藤酮對大鼠腦線粒體呼吸功能的影響 與對照組比較，魚藤酮使線粒體氧化磷酸功能呈劑量依賴性損傷，呼吸效率下降，表現(xiàn)為模型組線粒體的V3、V4、RCR顯著降低（P＜0.05），見圖2。

3 討論

PD的病因尚不明確，可能與年齡老化、家族遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)。近年來，研究顯示，許多環(huán)境化合物參與了線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、小膠質(zhì)細(xì)胞活化及α-突觸核蛋白異常聚集以及自噬受損等發(fā)病機(jī)制，從而增加了PD的發(fā)生風(fēng)險。魚藤酮曾作為殺蟲劑廣泛應(yīng)用，具有親脂性，可透過血腦屏障。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，長期接觸魚藤酮的人群患PD概率增加［2-3］，體內(nèi)外研究結(jié)果表明，魚藤酮可導(dǎo)致中樞DA神經(jīng)元損傷，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)路易小體，動物出現(xiàn)震顫、步態(tài)不穩(wěn)等PD癥狀［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)線粒體在魚藤酮所致的多巴胺神經(jīng)元變性損傷中發(fā)揮了核心作用，線粒體的功能障礙參與了魚藤酮誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)元的變性損傷和PD的病程［6］。

圖2 魚藤酮對大鼠腦線粒體呼吸功能的影響

PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，在形態(tài)和功能上具有典型的神經(jīng)細(xì)胞特征。PC12細(xì)胞表達(dá)多巴胺轉(zhuǎn)運體，并合成多巴胺，細(xì)胞膜上的受體及合成的遞質(zhì)接近中腦DA能神經(jīng)元，故廣泛應(yīng)用于神經(jīng)元，特別是DA能神經(jīng)元死亡方式的研究，是研究體外神經(jīng)細(xì)胞損傷及保護(hù)最為廣泛的細(xì)胞系，常用于PD的研究。

本研究選用PC12細(xì)胞建立體外PD模型，首先以不同濃度的魚藤酮與細(xì)胞共處理，細(xì)胞存活率呈不同程度下降，最佳的處理濃度和時間是2μM和48 h，此時細(xì)胞的存活率是47.57%。在明確了損傷條件后，進(jìn)一步探討了魚藤酮損傷PC12細(xì)胞的作用機(jī)制。以往研究表明，魚藤酮與線粒體具有較高親和力，能夠選擇性抑制線粒體復(fù)合物I，進(jìn)而影響線粒體功能和細(xì)胞存活［7］。線粒體膜電位的缺失在細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用，本研究應(yīng)用熒光探針JC-1指示線粒體膜電位水平，圍繞線粒體功能，考察了2μM魚藤酮對多巴胺神經(jīng)細(xì)胞線粒體的膜電位及能量代謝的影響。結(jié)果顯示，魚藤酮顯著降低線粒體膜電位和ATP含量。線粒體膜電位是反映線粒體功能的重要指標(biāo)，膜電位的改變影響質(zhì)子泵功能，進(jìn)而影響ATP的生成。近年來，線粒體功能障礙與氧化應(yīng)激在PD病理機(jī)制研究中備受關(guān)注。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧自由基的主要來源。線粒體消耗了細(xì)胞內(nèi)85%～90%的氧，用以支持氧化磷酸化ATP合成，在這個過程中產(chǎn)生了大量的氧自由基。在生理狀態(tài)下，ROS產(chǎn)生與清除可以達(dá)到動態(tài)平衡。但線粒體損傷時，平衡會被打破，大量的ROS攻擊DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)，導(dǎo)致線粒體功能障礙，產(chǎn)生更多的氧自由基，造成惡性循環(huán)。通過檢測細(xì)胞內(nèi)ROS及ATP含量，可反映細(xì)胞氧化應(yīng)激及能量代謝水平。在本研究中，魚藤酮能夠引起氧化應(yīng)激，與以往報道［8］一致，本研究還發(fā)現(xiàn)，2μM魚藤酮處理PC12細(xì)胞，ROS的含量顯著升高的時間點為共孵育5 h，該時間點早于線粒體功能障礙的時間，故魚藤酮引起的氧化應(yīng)激可能是引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要途徑。

線粒體是糖、脂肪和氨基酸最終氧化的場所。其主要功能是氧化磷酸化合成ATP，為生命活動提供能量，為了驗證魚藤酮對線粒體的直接影響，本研究以大鼠腦線粒體為研究對象，采用Clark氧電極法，直接測定魚藤酮對線粒體呼吸功能的改變。在NADH呼吸鏈啟動的條件下，與對照組相比，魚藤酮組V3、V4、RCR均顯著降低。RCR值可以反映線粒體的結(jié)構(gòu)及功能的完整性，比值越大，表明線粒體結(jié)構(gòu)越完整，而損傷的線粒體RCR值可低至1。研究結(jié)果驗證了魚藤酮直接損傷大鼠腦線粒體，使呼吸效率顯著下降。

線粒體功能障礙是PD發(fā)病機(jī)制學(xué)說之一，以線粒體為靶點，篩選PD治療藥物已經(jīng)成為一種新策略［9］。本研究表明魚藤酮在細(xì)胞和腦組織水平可以不同程度的損傷線粒體，引起DA能神經(jīng)元氧化應(yīng)激及降低細(xì)胞存活率。該結(jié)果為建立魚藤酮誘導(dǎo)的體外PD模型，深入研究PD病理機(jī)制、篩選候選藥物，實現(xiàn)精準(zhǔn)的靶向治療提供了實驗依據(jù)。