基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法的普魯蘭酶重組大腸桿菌高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化

遲 雷，王靜雨，侯俊超，魏佳佳，魏 濤，胡曉龍，何培新

（鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450000）

普魯蘭酶（pullulanase，EC 3.2.1.41）屬于淀粉脫支酶，能夠?qū)Ｒ恍缘厮馄蒸斕m多糖、支鏈淀粉、極限糊精等中的α-1,6糖苷鍵，使其形成直鏈淀粉[1-2]。在淀粉加工的相關(guān)行業(yè)中，淀粉原材料中支鏈淀粉含量較高，而普魯蘭酶與其他淀粉酶協(xié)同作用能夠充分水解支鏈淀粉，提高原料轉(zhuǎn)化率，增加產(chǎn)量，因此廣泛應(yīng)用于食品深加工、釀造、制藥、生物質(zhì)能源和高聚物材料等領(lǐng)域[3-4]。根據(jù)催化機(jī)理和水解產(chǎn)物的區(qū)別，將普魯蘭酶分為2種類型：I型普魯蘭酶，專一性水解α-1,6糖苷鍵[5]；II型普魯蘭酶，可同時(shí)水解α-1,4和α-1,6糖苷鍵[6]。目前，針對(duì)普魯蘭酶異源表達(dá)的研究主要集中在兩方面。一方面，利用不同來(lái)源的普魯蘭酶基因構(gòu)建具有特殊酶學(xué)性質(zhì)的表達(dá)體系，以滿足淀粉加工相關(guān)工業(yè)對(duì)水解條件的不同要求。例如，構(gòu)建常溫型普魯蘭酶表達(dá)體系[7]；構(gòu)建耐熱耐酸型普魯蘭酶表達(dá)體系，以實(shí)現(xiàn)淀粉水解一步液化（95～105 ℃）、糖化（60℃、pH4.5～5.5）[8-9]；構(gòu)建耐堿型普魯蘭酶表達(dá)體系[10]；構(gòu)建分泌型胞外表達(dá)體系[11-12]。另一方面，集中在重組菌的發(fā)酵工藝研究上，但規(guī)?；a(chǎn)的研究較少。Duan Xuguo等[13]在3 L發(fā)酵罐中對(duì)重組大腸桿菌（Escherichia coli）表達(dá)普魯蘭酶的高密度發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用了兩階段甘油補(bǔ)料和乳糖誘導(dǎo)的策略，普魯蘭酶活力達(dá)到了315.7 U/mL，并發(fā)現(xiàn)添加甜菜堿能夠進(jìn)一步提高普魯蘭酶活力。喬宇等[14]在5 L發(fā)酵罐的重組E. coli高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化中，采用了合成培養(yǎng)基和指數(shù)流加葡萄糖控制的策略，使細(xì)胞質(zhì)量濃度和普魯蘭酶表達(dá)量分別達(dá)到了53.3 g/L和1.35 g/L。

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種模擬大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的信息處理黑箱模型，是由輸入、輸出數(shù)據(jù)建立而成，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)元連接矩陣反映輸入與輸出的非線性關(guān)系，非常適合用在復(fù)雜生物發(fā)酵過(guò)程中的工藝控制和工藝優(yōu)化中[15-18]。其中，反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是常用的發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化模型之一[19-21]。遺傳算法是一種基于自然選擇學(xué)說(shuō)和遺傳學(xué)原理實(shí)現(xiàn)隨機(jī)、自適應(yīng)、并行全局搜索的群體尋優(yōu)算法[22-23]。在發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化研究中，遺傳算法常與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型聯(lián)用，能夠簡(jiǎn)單、快速地求取模型最優(yōu)解。

本研究利用重組E. coli體系，表達(dá)源于嗜熱細(xì)菌Thermotoga lettingaeTMO基因的耐熱耐酸普魯蘭酶[24]，采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)的方法實(shí)現(xiàn)其高密度發(fā)酵，利用反向傳播（back propagation，BP）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法對(duì)培養(yǎng)溫度、pH值、培養(yǎng)基碳氮比（C/N，mol/mol）等工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳的工藝條件，為開發(fā)普魯蘭酶工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

重組普魯蘭酶生產(chǎn)菌株E. coliBL21和質(zhì)粒pET15b，氨芐青霉素抗性，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[24]。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基為固態(tài)LB培養(yǎng)基和液態(tài)LB培養(yǎng)基，初始發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基的成分組成見表1。其中酵母粉生產(chǎn)商為英國(guó)Oxoid公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 培養(yǎng)基組成Table 1 Medium composition g/L

1.2 儀器與設(shè)備

Biostat B 5 L發(fā)酵罐 德國(guó)Sartorius公司；PL3002分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；SQP分析天平 北京Sartorius公司；JY 92-11N超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技公司；721S分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

從活化好的種子平板上分別挑取4 個(gè)單菌落，分別接種至4 個(gè)裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于37 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的搖床中培養(yǎng)12 h后接種至發(fā)酵罐。高密度發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在裝有2 L初始發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行，通氣速率保持在0.24 m3/h，通過(guò)改變攪拌功率和添加富氧空氣的方法將溶解氧控制在25%左右，培養(yǎng)溫度通過(guò)自動(dòng)控制系統(tǒng)維持在設(shè)定值，pH值通過(guò)自動(dòng)流加質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%的氨水維持在設(shè)定值。當(dāng)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖耗盡時(shí)，補(bǔ)料開始，補(bǔ)料培養(yǎng)基采用擬指數(shù)補(bǔ)料方式控制比生長(zhǎng)速率為0.15 h-1，補(bǔ)料速率（F）按式（1）計(jì)算，每小時(shí)調(diào)整一次。依據(jù)葡萄糖流加速率，按設(shè)定的培養(yǎng)基C/N進(jìn)行氮源的流加控制。當(dāng)OD600nm達(dá)到100左右時(shí)，添加終體積0.5 mmol/L IPTG開始誘導(dǎo)，控制比生長(zhǎng)速率在0.05 h-1，誘導(dǎo)8 h左右發(fā)酵結(jié)束。補(bǔ)料速率計(jì)算公式如下：

式中：F為補(bǔ)料速率/（L/h）；μset為比生長(zhǎng)速率設(shè)定值/h-1；X0、V0分別為補(bǔ)料起始時(shí)的細(xì)胞量/（g/L）、發(fā)酵液體積/L；SF為補(bǔ)料葡萄糖質(zhì)量濃度/（g/L）；YX/S為細(xì)胞/葡糖糖得率/（g/g）；tF為補(bǔ)料時(shí)間/h。

1.3.2 蛋白純化方法[24]

4 ℃、7 000 r/min離心20 min收集菌體細(xì)胞，用破壁緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L NaCl）懸浮后，超聲破碎。破壁后的菌液于80 ℃熱處理30 min，常溫、12 000 r/min離心20 min，最后采用Ni-NTA瓊脂糖親和層析純化目標(biāo)蛋白，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗(yàn)純化效果，蛋白質(zhì)濃度用考馬斯亮藍(lán)比色Bradford方法測(cè)定。普魯蘭酶的活性測(cè)定采用二硝基水楊酸法，酶活力定義為：在90 ℃和pH 5.4的反應(yīng)條件下，每分鐘從普魯蘭底物釋放1 μmol還原糖所需要的酶量作為1 個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

1.3.3 細(xì)胞量分析方法

發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)稀釋后于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度。細(xì)胞干質(zhì)量由OD600nm換算得到，即將10 mL發(fā)酵液離心，并用純凈水洗滌3 次，收集菌體置于60 ℃烘干至恒質(zhì)量，得到1 OD600nm近似為0.45 g/L，以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì)。

1.3.4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

本實(shí)驗(yàn)選擇發(fā)酵溫度（T）、發(fā)酵pH值和培養(yǎng)基C/N作為模型輸入，分別以菌體細(xì)胞量（X）和產(chǎn)物普魯蘭酶產(chǎn)量（P）作為模型輸出，建立2 個(gè)結(jié)構(gòu)為3-n-1的單輸出網(wǎng)絡(luò)，如圖1所示。其中，隱層神經(jīng)元（H）個(gè)數(shù)由實(shí)驗(yàn)確定，模型訓(xùn)練由MATLAB軟件實(shí)現(xiàn)，所有變量均按比例縮放到0.1～0.9數(shù)值范圍內(nèi)以避免“S”形函數(shù)的收斂問(wèn)題[19,25]。

圖1 BP網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)Fig.1 Topological structure of BP network

1.3.5 遺傳算法

使用MATLAB遺傳算法工具箱求取模型最優(yōu)解[21]，其中變量數(shù)選擇3，隨機(jī)產(chǎn)生初始種群，將訓(xùn)練好的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型作為遺傳算法的適應(yīng)度函數(shù)求解。

1.3.6 數(shù)據(jù)樣本

訓(xùn)練BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的均方根誤差（root mean square error，RMSE）、預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)差（standard error prediction，SEP）等數(shù)據(jù)如表2、3設(shè)計(jì)，所有實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行3 次重復(fù)。

表2 參數(shù)水平選擇Table 2 Level and code of independent parameters

表3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型訓(xùn)練數(shù)據(jù)樣本設(shè)計(jì)Table 3 Experimental design for BPN model with predicted values

2 結(jié)果與分析

2.1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)隱層層數(shù)的確定

為了確定隱層神經(jīng)元個(gè)數(shù)，將隱層神經(jīng)元個(gè)數(shù)設(shè)置為3～10 個(gè)，分別利用數(shù)據(jù)樣本訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)后，比較模型的均方根誤差，結(jié)果如圖2所示。在隱層神經(jīng)元為8 個(gè)時(shí)，均方根誤差最小，據(jù)此最終確定BP網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為：輸入層3 個(gè)神經(jīng)元（T、pH值、C/N），隱層8 個(gè)神經(jīng)元（X），輸出層1 個(gè)神經(jīng)元（P）。

圖2 隱層神經(jīng)元數(shù)量對(duì)模型均方根誤差的影響Fig.2 Effect of the number of neurons in the hidden layer on the RMSE

2.2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練

使用表3所列數(shù)據(jù)樣本對(duì)2 個(gè)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型訓(xùn)練后，分別得到了生物量和產(chǎn)物產(chǎn)量的理論預(yù)測(cè)值（表3）。將實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值比較（圖3、4），可以看到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型很好地?cái)M合了優(yōu)化參數(shù)和輸出的非線性關(guān)系。生物量模型的均方根誤差和標(biāo)準(zhǔn)誤差分別是0.8 g/L和1.65%，產(chǎn)物產(chǎn)量模型的均方根誤差和標(biāo)準(zhǔn)誤差分別是0.05 g/L和2.04%，同樣說(shuō)明了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具很好的擬合能力。

圖3 生物量實(shí)驗(yàn)值與BPN模型預(yù)測(cè)值的比較Fig.3 Biomass predicted by the BPN model compared with experimental data

圖4 產(chǎn)物產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)值與BPN模型預(yù)測(cè)值的比較Fig.4 Production predicted by the BPN model compared with experimental data

為了檢驗(yàn)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的擬合性能和預(yù)測(cè)性能，將驗(yàn)證樣本輸入模型（表4），分別把細(xì)胞量、產(chǎn)物產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行比較，結(jié)果見圖5，可以看到實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值吻合程度很高，說(shuō)明建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有令人滿意的擬合性能和預(yù)測(cè)性能。

表4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型驗(yàn)證數(shù)據(jù)樣本設(shè)計(jì)Table 4 Experimental design for testing the BPN model

圖5 生物量（X）和產(chǎn)物產(chǎn)量（P）實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的比較Fig.5 Biomass (X) and production (P) predicted by the BPN model compared with experimental data

2.3 遺傳算法優(yōu)化結(jié)果

建立好BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之后，利用訓(xùn)練好的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型作為遺傳算法的適應(yīng)度函數(shù)，通過(guò)遺傳算法尋優(yōu)，找到最佳的輸入值，也就是最優(yōu)的溫度、pH值和C/N條件。利用MATLAB遺傳算法工具箱，搜索3 個(gè)變量的變化范圍，隨機(jī)產(chǎn)生初始種群，經(jīng)過(guò)不斷的選擇、交叉、變異操作，如圖6所示，經(jīng)過(guò)56 次傳代得到了最優(yōu)條件，見表5。由于在構(gòu)建BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)時(shí)進(jìn)行了輸出層單神經(jīng)元分割，因此分別得到了針對(duì)生物量最大和產(chǎn)物產(chǎn)量最大的兩組最優(yōu)發(fā)酵條件?？梢钥吹剑?dāng)發(fā)酵溫度34.4 ℃、pH 6.87、培養(yǎng)基C/N 6.1時(shí)，更適合工程菌細(xì)胞生長(zhǎng)。而當(dāng)溫度降低至32.5 ℃，pH值減小至6.69，培養(yǎng)基C/N降低至5.3時(shí)，更適合目標(biāo)蛋白的表達(dá)，這說(shuō)明在較低溫度、偏酸環(huán)境以及更充分氮源的條件下，蛋白產(chǎn)物表達(dá)更好。因此，本實(shí)驗(yàn)將整個(gè)發(fā)酵過(guò)程分為誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后2 個(gè)階段分別按得到的優(yōu)化條件進(jìn)行調(diào)控，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到結(jié)果見表5。最優(yōu)條件下的實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值誤差均小于3%，最終確定最佳發(fā)酵條件：誘導(dǎo)前發(fā)酵溫度34.4 ℃、pH 6.87、培養(yǎng)基C/N 6.1，誘導(dǎo)后發(fā)酵溫度32.5 ℃、pH 6.69、培養(yǎng)基C/N 5.3，獲得細(xì)胞質(zhì)量濃度56.5 g/L，重組蛋白產(chǎn)量3.21 g/L，酶活力為268.3 U/mL。

圖6 遺傳算法尋優(yōu)軌跡Fig.6 Best fitting profile from genetic algorithm

表5 遺傳算法求取的最優(yōu)條件及驗(yàn)證結(jié)果Table 5 Experimental data under the optimal conditions validated by genetic algorithm

3 結(jié) 論

本研究利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法，優(yōu)化重組E. coli表達(dá)耐熱耐酸普魯蘭酶的高密度發(fā)酵控制工藝。實(shí)驗(yàn)選取了3 個(gè)參數(shù)條件：發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH值以及培養(yǎng)基C/N，分別以生物量和產(chǎn)物產(chǎn)量為輸出建立2 個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。通過(guò)對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型訓(xùn)練擬合，并用遺傳算法求取最優(yōu)解。最終確定最佳發(fā)酵條件：誘導(dǎo)前發(fā)酵溫度34.4 ℃、pH 6.87、培養(yǎng)基C/N 6.1，誘導(dǎo)后發(fā)酵溫度32.5 ℃、pH 6.69、培養(yǎng)基C/N 5.3，最終得到細(xì)胞質(zhì)量濃度56.5 g/L，重組蛋白產(chǎn)量3.21 g/L，酶活力為268.3 U/mL。本研究發(fā)現(xiàn)，較低溫度、偏酸pH值環(huán)境以及更充分氮源的條件，更適合蛋白產(chǎn)物的表達(dá)；反之，提高溫度、偏中性pH值環(huán)境以及碳源比例更高，適合細(xì)胞的生長(zhǎng)。從眾多基因工程菌高密度發(fā)酵的研究中不難看出，誘導(dǎo)開始后，發(fā)酵調(diào)控的重心從細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物表達(dá)，應(yīng)采取有針對(duì)性的工藝調(diào)整。例如在誘導(dǎo)前后控制不同的比生長(zhǎng)速率，本實(shí)驗(yàn)采用了誘導(dǎo)前比生長(zhǎng)速率0.15 h-1，誘導(dǎo)后比生長(zhǎng)速率0.05 h-1的控制策略，通常在誘導(dǎo)階段維持較低的比生長(zhǎng)速率有利于產(chǎn)物表達(dá)，也有誘導(dǎo)后較高水平的比生長(zhǎng)速率促進(jìn)產(chǎn)量提升的報(bào)道，但比較少見[26]。誘導(dǎo)后，發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)物表達(dá)也至關(guān)重要。一般而言，較低的誘導(dǎo)溫度有利于重組蛋白正確折疊，減少包涵體的形成[27]，但也有報(bào)道采用熱激的方式誘導(dǎo)熱激蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)重組蛋白正確折疊[28]。此外，培養(yǎng)基成分也可能因重組蛋白的種類不同而異，除了本實(shí)驗(yàn)中pH值和培養(yǎng)基C/N的影響外，還有一些誘導(dǎo)后添加氨基酸[29]、甜菜堿[13]及環(huán)糊精[30]等利于重組蛋白表達(dá)成分的報(bào)道?？傊诟呙芏劝l(fā)酵中，誘導(dǎo)后的主要目的是產(chǎn)物表達(dá)，此時(shí)宜采用對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響較小但能極大促進(jìn)產(chǎn)物表達(dá)的調(diào)控工藝。本研究利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法得到的優(yōu)化結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。同時(shí)，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型能夠很好地?cái)M合發(fā)酵過(guò)程的非線性對(duì)應(yīng)關(guān)系，其與遺傳算法結(jié)合，能夠快速準(zhǔn)確地獲得最優(yōu)結(jié)果，是優(yōu)化發(fā)酵工藝的有力工具。