魚腸道中抗氧化活性乳酸菌的篩選及鑒定

丁麗麗，呂欣然，高永悅，崔曉玲，王小咪，白鳳翎,*，儀淑敏，郭曉華

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，國家魚糜及魚糜制品加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧 錦州 121013；2.山東美佳集團有限公司，山東 日照 276815）

水產(chǎn)品具有高蛋白、低脂肪、味道鮮美等特點，受到廣大消費者的青睞。但是，水產(chǎn)品極易受到脂質(zhì)和蛋白氧化等影響，使水產(chǎn)品產(chǎn)生色澤變暗、彈性變差以及安全性降低等不良變化[1-3]。最終導(dǎo)致水產(chǎn)品整體質(zhì)量下降，給人們健康帶來危害[4-5]。

目前預(yù)防和延緩水產(chǎn)品氧化最主要的方式是向水產(chǎn)品中添加抗氧化劑。植物源抗氧化劑主要有酚類、植物多糖類、生物堿類及維生素類等植物提取物，動物源抗氧化劑主要由動物自身組織產(chǎn)生的內(nèi)源物質(zhì)（如肌肽）和動物水解蛋白質(zhì)的產(chǎn)物兩部分組成，合成類抗氧化劑主要包括丁基羥基茴香醚、特丁基對苯二酚等，這3 類抗氧化劑都存在成本高、作用機制單一等缺點[6-11]。微生物源抗氧化劑中以乳酸菌最為常見，乳酸菌作為天然抗氧化劑，具有完整的抗氧化體系及評價體系的同時還具有來源廣泛、成本低廉、安全性高等優(yōu)點[12-13]。相對于其他類抗氧化劑，開發(fā)微生物源抗氧化劑更具有潛在的應(yīng)用價值。

從自然界乳酸菌資源中篩選具有抗氧化活性的菌株已成為研究熱點。王惋等[14]通過體外抗氧化和胃腸道環(huán)境的耐受性實驗，從發(fā)酵蔬菜中分離出具有較好抗氧化性、耐酸性和疏水性的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）A15。李默等[15]從發(fā)酵肉制品中分離到希臘魏斯氏菌（Weissella hellenica）L23，可作為抗氧化發(fā)酵劑用于肉制品生產(chǎn)。唐宇[16]從發(fā)酵豆乳中分離到干酪乳桿菌（L. casei）16，該菌具有抗氧化活性，同時能提高糖苷型大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化率，使發(fā)酵后的豆乳更具營養(yǎng)。研究表明，抗氧化乳酸菌主要來源于發(fā)酵食品，魚腸道來源的抗氧化乳酸菌較少。

本實驗從魚腸道的乳酸菌中篩選具有抗氧化活性的優(yōu)良菌株，因其可在魚腸道中定植且對宿主無害，在腸道內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用維持氧化還原平衡，同時還具有耐低溫、有效抑制致病菌等優(yōu)點，可以被廣泛的應(yīng)用在冷凍及鮮活水產(chǎn)品的抗氧化加工中[17-18]。因此，從豐富的魚腸道微生物資源中篩選具有抗氧化活性的乳酸菌對開發(fā)水產(chǎn)品抗氧化制劑具有十分重要的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

乳酸菌菌株：來源于遼寧錦州地區(qū)的草魚、鱸魚、刀魚、牙鲆、大菱鲆、鯉魚、鳙魚。

應(yīng)試菌株：志賀氏菌（Shigella Castellani）CMCC（B）51572、埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli）CMCC 44102、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 9027、熒光假單胞菌（P. fluorescens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）ACCC11091、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）CMCC63301及單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC19115均由學(xué)院微生物學(xué)與分子生物學(xué)實驗室保藏；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）ATCC53103 北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、亞油酸、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、鄰菲羅琳、三羥甲基氨基甲烷（Tris） 美國Sigma公司。

氯化鉀（質(zhì)量分數(shù)為0.02%）、氯化鈉（質(zhì)量分數(shù)為0.8%）、磷酸二氫鉀（質(zhì)量分數(shù)為0.024%）、磷酸氫二鈉（質(zhì)量分數(shù)為0.144%）TaqPCR Master mix、細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）快速抽提試劑盒、DNA Marker、PCR擴增引物 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-8C電泳儀 北京六一生物科技有限公司；超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；ABI stepone plus聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、5804R冷凍高速離心機 德國艾本德股份有限公司；Cheimdox XRS凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；UV2550紫外-可見分光光度計 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；IKA Vortex GENIUS 3振蕩器德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌完整細胞及無細胞提取物的制備

稱取0.2 g氯化鉀、8 g氯化鈉、0.24 g磷酸二氫鉀、1.44 g磷酸氫二鈉，先溶于800 mL去離子水，調(diào)節(jié)至pH 7.2后，加去離子水定容至1 L，最后經(jīng)121 ℃滅菌15 min以制備磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）。乳酸菌以2%的接種量（終濃度為109CFU/mL）接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。將第3代活化后的菌株分為兩組，一組4 ℃、6 000 r/min離心15 min，收集菌體，收集的菌體經(jīng)PBS洗滌2 次，重懸于PBS中，作為乳酸菌完整細胞備用。另一組將菌懸液冰浴超聲破碎（15 min變幅桿：φ6；超聲開1 s；超聲關(guān)2 s；功率33%），在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清液，作為乳酸菌無細胞提取物備用。

1.3.2 抗氧化活性乳酸菌的初篩

乳酸菌的DPPH自由基清除能力，參照文獻[19]并稍加改進，以鼠李糖乳桿菌LGG作陽性對照。DPPH自由基清除率公式如下：

式中：Bi為樣品組吸光度；Bj為空白組吸光度；Bc為對照組吸光度。

1.3.3 抗氧化活性的乳酸菌的復(fù)篩

1.3.3.1 乳酸菌的羥自由基清除能力測定

參照文獻[20]的方法稍加改進，以鼠李糖乳桿菌LGG作陽性對照。羥自由基清除率公式如下：

式中：Bs為樣品組吸光度；Bb為對照組吸光度；Bp為空白組吸光度。

1.3.3.2 乳酸菌的抗脂質(zhì)過氧化能力測定

參照文獻[21]的方法稍加改進，以鼠李糖乳桿菌LGG作陽性對照?？怪|(zhì)過氧化率公式如下：

式中：B為樣品組吸光度；Bo為對照組吸光度。

1.3.3.3 乳酸菌的超氧陰離子自由基清除能力測定

參照文獻[22]的方法稍加改進，以鼠李糖乳桿菌LGG作陽性對照。超氧陰離子自由基清除率公式如下：

式中：B為樣品組吸光度；Bo為空白組吸光度。

1.3.4 乳酸菌的抑菌活性測定

以志賀氏菌、埃希氏大腸桿菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及單核細胞性李斯特菌為應(yīng)試菌株，采用牛津杯打孔法[23]測定乳酸菌的抑菌活性。

1.3.5 乳酸菌菌株的鑒定

1.3.5.1 生理生化鑒定

參照文獻[24]對菌株進行初步的鑒定。

1.3.5.2 16S rDNA序列分析

參照文獻[25]的方法稍加改進，將擴增成功的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性乳酸菌的初篩

DPPH自由基清除率是評價乳酸菌抗氧化最常見的指標，是由不成對電子氮為中心構(gòu)成的一種穩(wěn)定的基團，通過接受氫自由基或電子形成更加穩(wěn)定的DPPH-H分子[26-27]。如果乳酸菌能將其清除則說明乳酸菌具有降低自由基的能力，也就具有一定的抗氧化性。因此，乳酸菌的抗氧化活性與DPPH自由基清除率有關(guān)，即乳酸菌的DPPH自由基清除能力越強，則說明乳酸菌的抗氧化活性越強。

表1 乳酸菌菌株對DPPH自由基的清除率Table 1 DPPH free radical scavenging activity of LAB strains

由表1可知，來自魚腸道的48 株乳酸菌均具有DPPH自由基清除能力，清除率范圍在（1.74±0.21）%～（67.29±0.42）%，31 株乳酸菌的DPPH自由基清除率高于陽性對照鼠李糖乳桿菌LGG（P＜0.05），其中菌株LY-21、CY1-2、CY2-1、CY2-3、LY-17的DPPH自由基清除率顯著高于其他乳酸菌包括陽性對照鼠李糖乳桿菌LGG（P＜0.05），清除率分別為（64.10±0.75）%、（67.29±0.42）%、（65.14±0.43）%、（65.6±0.30）%、（61.34±0.34）%。因此，選擇這5 株菌繼續(xù)實驗，結(jié)合其他指標進一步探究其抗氧化活性[28]。

2.2 抗氧化活性乳酸菌的復(fù)篩

2.2.1 羥自由基清除率

圖1 乳酸菌菌株的羥自由基清除結(jié)果Fig.1 Hydroxyl radical scavenging effect of LAB strains

由圖1可知，清除能力較強的5 株乳酸菌的完整細胞及無細胞提取物都表現(xiàn)出較強的羥自由基清除能力，其范圍分別為（56.60±0.52）%～（60.67±1.44）%和（57.43±1.84）%～（64.27±1.26）%，且均超過陽性對照鼠李糖乳桿菌LGG（P＜0.05）。其中，菌株CY1-2的完整細胞及無細胞提取物的羥自由基清除率均高于其他菌株，分別為（60.67±1.44）%和（64.27±1.26）%，并且其無細胞提取物的清除率大于完整細胞的清除率。該結(jié)果與劉少敏等[29]研究植物乳桿菌NDC 75017的羥自由基清除結(jié)果類似，這可能是由于細胞被破壞后，特定的Fe2+和Cu2+金屬螯合物被釋放出來，參與氧化反應(yīng)，從而明顯減少羥自由基的產(chǎn)生。

2.2.2 抗脂質(zhì)過氧化率

由圖2可知，5 株乳酸菌的無細胞提取物組均表現(xiàn)出較強的抗脂質(zhì)過氧化能力，此外，菌株CY1-2和LY-21的抗脂質(zhì)過氧化能力均顯著高于陽性對照鼠李糖乳桿菌LGG（P＜0.05）。乳酸菌的完整細胞組，菌株CY1-2的抗脂質(zhì)過氧化率最高，為（40.77±0.50）%，其次是菌株LY-21，為（39.70±0.35）%。乳酸菌的無細胞提取物組，菌株LY-21的抗脂質(zhì)過氧化率最高，為（56.10±0.01）%，其次是菌株CY1-2，為（51.03±0.40）%。由結(jié)果可知，相較于其他菌株，菌株CY1-2和LY-21抗脂質(zhì)過氧化率較高，且其無細胞提取物的抗脂質(zhì)過氧化率均高于完整細胞，這一結(jié)果與羅章等[30]研究清酒乳桿菌（L. sake）HN05的抗脂質(zhì)過氧化率結(jié)果相似，這可能是由于乳酸菌細胞內(nèi)存在較多的螯合Fe2+的活性物質(zhì)，與脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)，達到抑制脂質(zhì)氧化的目的[21]。

圖2 乳酸菌菌株的抗脂質(zhì)過氧化結(jié)果Fig.2 Anti-lipid peroxidation effect of LAB strains

2.2.3 超氧陰離子自由基清除率

超氧陰離子自由基也可以直接作用于核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，從而導(dǎo)致細胞膜受損，引起一系列的有害反應(yīng)[31]。

圖3 乳酸菌菌株的超氧陰離子自由基清除結(jié)果Fig.3 Superoxide anion radical scavenging effect of LAB strains

由圖3可知，5 株乳酸菌表現(xiàn)出不同差異的超氧陰離子自由基清除效果。乳酸菌的完整細胞提取物組，菌株CY1-2表現(xiàn)出最強的超氧陰離子自由基清除率，為（29.87±1.14）%，其次是菌株LY-21，清除率為（23.63±0.55）%。乳酸菌的無細胞提取物組，菌株LY-21的超氧陰離子自由基清除率最高，為（24.00±1.15）%，其次是菌株CY1-2，清除率為（21.97±1.47）%。且結(jié)果均小于陽性對照鼠李糖乳桿菌LGG（P＜0.05），該結(jié)果與高原[31]研究的植物乳桿菌Y42結(jié)果類似，鼠李糖乳桿菌LGG分泌的抑制超氧陰離子活性物質(zhì)強于實驗菌株，從而表現(xiàn)出較強的抗氧化能力，導(dǎo)致實驗組結(jié)果均小于對照組結(jié)果。菌株CY1-2和LY-17完整細胞的超氧陰離子自由基清除率高于無細胞提取物，該結(jié)果與郭慧芬等[20]研究的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）X31結(jié)果相類似，表明這兩株乳酸菌清除超氧陰離子自由基的活性物質(zhì)主要存在于細胞表面；其他菌株無細胞提取物的超氧陰離子自由基清除率均高于完整細胞，結(jié)果與高原[31]研究的植物乳桿菌Y44結(jié)果類似，表明細胞內(nèi)存在某種抗氧化物質(zhì)，如超氧化物歧化酶與過氧化氫酶作用產(chǎn)生的結(jié)果[32]。

從上述抗氧化活性指標可得出，菌株CY1-2完整細胞的羥自由基、超氧陰離子自由基清除率及抗脂質(zhì)過氧化率均比其他菌株的清除率大；菌株CY1-2無細胞提取物的羥自由基清除效果強于其他菌株，抗脂質(zhì)過氧化率和超氧陰離子自由基清除率僅次于菌株LY-21，結(jié)果可能與細胞表面、細胞內(nèi)部存在的活性分子的差異性有關(guān)。綜合以上指標，故選擇分離自草魚腸道的菌株CY1-2作為優(yōu)良乳酸菌進行后續(xù)研究。

2.3 乳酸菌的抑菌結(jié)果

具有抗氧化及抑菌雙重功效的乳酸菌在水產(chǎn)品加工領(lǐng)域具有非常重要的價值，因為一方面可以延緩水產(chǎn)品氧化，達到延長貨架期的目的；另一方面又能保護水產(chǎn)品免受腐敗菌的污染，提高水產(chǎn)品的安全性。因此，探究抗氧化乳酸菌CY1-2是否具有廣譜抑菌活性。

表2 菌株CY1-2對8 種細菌的抑菌結(jié)果Table 2 Inhibitory effects of strain CY1-2 against eight bacteria

由表2可知，菌株CY1-2對志賀氏菌、埃希氏大腸桿菌、銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌等革蘭氏陰性菌均具有抑菌效果，其中對志賀氏菌的抑菌效果最強，抑菌圈直徑為（14.20±0.07）mm。除單核細胞性李斯特菌之外，菌株CY1-2對地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌均具有抑菌作用，其中對地衣芽孢桿菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為（13.53±0.35）mm。此外，吳光偉等[33]研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌LGG對多種革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌均有抑制作用。因此，菌株CY1-2作為抗氧化菌株也具有廣譜抗菌活性。

2.4 菌株鑒定結(jié)果

2.4.1 生理生化鑒定結(jié)果

菌株CY1-2生理生化鑒定結(jié)果如表3所示。

表3 菌株CY1-2的糖發(fā)酵結(jié)果Table 3 Sugar fermentation characteristics of strain CY1-2

2.4.2 16S rDNA序列結(jié)果

如圖4所示，核酸序列在1 000～2 000 bp之間，進一步測序，得到菌株CY1-2的目的片段序列為1 500 bp。利用BLAST軟件，從GenBank中選擇10 個菌株的16S rDNA基因序列，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖5，菌株CY1-2與L. plantarumKP317705.1親緣關(guān)系達99%，由此確定菌株CY1-2為植物乳桿菌。

圖4 菌株CY1-2的16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified 16S rDNA gene of strain CY1-2

圖5 菌株CY1-2基于16S rDNA的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain CY1-2 based on 16S rDNA gene sequences

3 結(jié) 論

本研究從來自魚腸道的48 株乳酸菌中篩選出具有較強抗氧化活性的菌株CY1-2，經(jīng)生理生化反應(yīng)和16S rDNA序列分析鑒定為植物乳桿菌，該菌株的完整細胞和無細胞提取物均具有較強的清除羥自由基和超氧陰離子自由基、抗脂質(zhì)過氧化能力，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑菌效果，表明該菌株具有良好的抗氧化性和抑菌性。本研究對進一步開發(fā)天然水產(chǎn)品抗氧化劑具有一定的應(yīng)用價值。