薛奮龍，簡(jiǎn)鍇陶

(1.天津市第一中心醫(yī)院心血管外科 300192；2.天津市胸科醫(yī)院心血管外科 300051；3.上海德達(dá)醫(yī)院心血管外科 200336)

目前，缺血性心臟病(IHD)仍然是全世界病死率最高的疾病。對(duì)于IHD導(dǎo)致的慢性心力衰竭的治療已經(jīng)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，包括β-受體抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體抑制劑等的藥物治療，以及再同步化療[1]。終末期慢性心力衰竭患者也可以進(jìn)行左心室輔助裝置和心臟移植治療。雖然這些治療方法對(duì)于IHD所導(dǎo)致的慢性心力衰竭發(fā)揮了重要的作用，但是藥物治療非常有限，預(yù)后不佳，左心室輔助裝置受設(shè)備和醫(yī)療水平限制，無(wú)法廣泛的開展，同時(shí)心臟移植受供體和受體條件所限，受益人群有限。因此，對(duì)于IHD慢性心力衰竭的治療方法仍需要不斷的發(fā)展和探索。應(yīng)用干細(xì)胞治療IHD是過去20年間逐步發(fā)展的新策略，自體干細(xì)胞移植治療IHD的臨床研究已經(jīng)開展并時(shí)有報(bào)道[2-3]。可以選擇的干細(xì)胞移植種類雖然很多，但無(wú)論應(yīng)用何種干細(xì)胞，移植的方式在干細(xì)胞治療方案中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。目前臨床中應(yīng)用的移植方式主要是在外科手術(shù)時(shí)心肌內(nèi)注射或者通過導(dǎo)管冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射。但通過這些途徑移植的治療效果有限，原因可能與心肌內(nèi)注射后干細(xì)胞只作用在局部區(qū)域和注射部位心肌損傷造成移植干細(xì)胞生存條件更加惡化有關(guān)，導(dǎo)管內(nèi)冠狀動(dòng)脈注射干細(xì)胞后干細(xì)胞隨血流到達(dá)損傷部位的干細(xì)胞數(shù)量有限，治療作用不理想。因此，有學(xué)者選擇應(yīng)用干細(xì)胞膜片進(jìn)行移植，干細(xì)胞膜片具有不破壞細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)，具有更加強(qiáng)大的旁分泌效應(yīng)[4-5]。干細(xì)胞膜片的種類很多，包括心肌干細(xì)胞、骨骼肌干細(xì)胞、基質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等，但制備和應(yīng)用內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)膜片治療IHD的動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究大鼠EPCs的制備方法并探討EPCs膜片的生物學(xué)功能，以為EPCs膜片移植治療IHD提供參考依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。清潔級(jí)同種系成年雄性Wistar大鼠15只，8周齡，體重200～250 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心。(2)主要試劑及儀器。內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基及生長(zhǎng)因子套裝(EBM-2 Basal Medium)購(gòu)自美國(guó)Lonza公司；淋巴細(xì)胞分離液(Histopaque 1083)、大鼠血漿來源玻連蛋白、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的荊豆凝集素1(FITC-UEA-1)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；羊抗大鼠CD34流式抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗大鼠CD133流式抗體購(gòu)自美國(guó)Bioss公司；VE-cadherin 抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；KDR抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;Dil 標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-acLDL)購(gòu)自美國(guó)Molecular probes公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)購(gòu)自瑞士Roche公司；大鼠基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(SDF-1α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)ELISA試劑盒及大鼠表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)ELISA試劑盒均購(gòu)自泉州市科諾迪生物科技有限公司。CO2孵育箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Nunc UpCell Surface培養(yǎng)皿購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，熒光倒置顯微鏡(IX71)購(gòu)自日本Olympus公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD FACS Calibur公司。

1.2 方法

1.2.1建立大鼠骨髓來源EPCs(BM-EPCs)培養(yǎng)體系

大鼠BM-EPCs培養(yǎng)體系建立同前期試驗(yàn)所述[6]，斷頭處死雄性大鼠1只，75%乙醇浸泡2遍，分離股骨和脛骨，用注射器吸取適量的勻漿沖洗液沖洗髓腔至無(wú)色，收集懸液到合適離心管中，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，70 μm細(xì)胞篩過濾，2 500 r/min離心10 min，棄上清液，加細(xì)胞稀釋液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×108～2×109/mL備用，15 mL離心管加入與骨髓單細(xì)胞懸液等量的淋巴細(xì)胞分離液Histopaque 1083，緩慢加入細(xì)胞懸液，2 100 r/min離心30 min，離心后分四層，取第二層棕黃色單核細(xì)胞于15 mL離心管，加入10 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻清洗，1 400 r/min離心10 min，EBM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)皿中。在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 d后首次全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，以后每3天更換新鮮培養(yǎng)液，所有細(xì)胞均培養(yǎng)至第14天。

1.2.2大鼠BM-EPCs表面抗原流式細(xì)胞術(shù)鑒定

棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞，0.25%胰酶消化培養(yǎng)至14 d貼壁細(xì)胞，1 000 r/min離心3 min，PBS重懸，1 000 r/min離心3 min，細(xì)胞計(jì)數(shù)，PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL，取200 μL單細(xì)胞懸液。設(shè)空白對(duì)照管、CD34、CD133、KDR、VE-cadherin管，分別加入PBS、CD34、CD133、KDR、VE-cadherin一抗，室溫孵育2 h，流式洗液洗滌1次，加入二抗Alexa Flour488，室溫避光孵育1 h，流式洗液洗滌后行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3EPCs吞噬功能鑒定

將培養(yǎng)至14 d的細(xì)胞中加入1 mL完全培養(yǎng)基稀釋的10 mg/L的Dil-acLDL，37 ℃溫箱孵化4 h后，PBS洗滌3次，2%甲醛室溫下固定20 min，再加入1 mL濃度為10 mg/L FITC-UEA-1室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，最后加入1 mL完全培養(yǎng)基稀釋的10 mg/L 的DAPI于37 ℃溫箱孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察Dil-acLDL和FITC-UEA-1雙陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.4EPCs膜片建立

取培養(yǎng)至7 d的1.5×106個(gè)BM-EPCs接種至包被有玻連蛋白的Nunc UpCell Surface培養(yǎng)皿中，37 ℃溫箱繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，迅速放置于25 ℃恒溫箱中避光孵育30 min，獲得大鼠BM-EPCs膜片。

1.2.5細(xì)胞膜片厚度測(cè)定

棄掉培養(yǎng)至7 d的Nunc UpCell Surface 培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入20 mL 預(yù)冷至-20 ℃的甲醇液，4 ℃孵育10 min，1×PBS洗1次，含10% 羊血清的PBS室溫下封閉40 min，PBS-T稀釋一抗ColⅠ共3 mL，室溫孵育4 h，PBS-T洗3次，每次5 min，PBS-T稀釋 Alexa Fluor 488二抗共3 mL，室溫避光孵育1 h，PBS-T稀釋DAPI共3 mL，室溫避光孵育3 min，PBS-T洗3次，每次5 min。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞膜片，計(jì)算膜片厚度。

1.2.6CCK8法檢測(cè)細(xì)胞膜片中細(xì)胞代謝

分別制備培養(yǎng)至14 d的BM-EPCs單細(xì)胞及BM-EPC膜片1×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，分別設(shè)為EPC單細(xì)胞組及EPC膜片組。5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，每組細(xì)胞至少接種6個(gè)孔，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在12、24、48、72 h時(shí)用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性，每孔加入10 μL CCK8檢測(cè)液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔細(xì)胞在450 nm處的吸光度(A)。分別繪出EPCs單細(xì)胞及EPC膜片的生長(zhǎng)曲線。

1.2.7細(xì)胞膜片內(nèi)皮分化功能檢測(cè)

4 ℃過夜融化Matrigel，用M199基礎(chǔ)無(wú)添加培養(yǎng)基按1∶1稀釋Matrigel，于96孔板中每孔均勻鋪置50 μL Matrigel后，37 ℃溫箱孵育30 min使其凝固。分別重懸BM-EPCs單細(xì)胞及細(xì)胞膜片，制作成2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸浮液。分別加100 μL單細(xì)胞懸液于Matrigel表面上，37 ℃孵育4 h，顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形成血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Wimasis image analysis軟件分析總的血管環(huán)數(shù)。

1.2.8ELISA法檢測(cè)細(xì)胞膜片旁分泌SDF-1α、VEGF、EGF水平

分別取BM-EPCs單細(xì)胞及細(xì)胞膜片培養(yǎng)上清液，1 000 r/min，離心10 min去除顆粒物及漂浮細(xì)胞。按照ELISA檢測(cè)試劑盒操作說明設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50 μL；樣本孔分別加入兩組培養(yǎng)上清液50 μL；立即加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL， 用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋孵育 60 min，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿1×洗滌液，靜置 1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板 5 次。每孔加入底物 A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液 50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的A值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠BM-EPCs培養(yǎng)體系建立

培養(yǎng)14 d的BM-EPCs在顯微鏡下呈鵝卵石樣排列，局部可見細(xì)胞島狀排列，細(xì)胞以錘狀、梭形細(xì)胞為主，中央?yún)^(qū)多見多邊形細(xì)胞；個(gè)別細(xì)胞呈線性排列，細(xì)胞呈典型紡錘狀，見圖1。

A：鵝卵石樣排列(×100)；B：局部細(xì)胞島狀排列(×200)；C：梭形排列(×200)。

2.2 大鼠BM-EPCs鑒定

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原，結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的BM-EPCs CD34、CD133、KDR、VE-cadherin陽(yáng)性率分別為85.43%、59.30%、51.83%、38.78%，見圖2。BM-EPCs吞噬功能鑒定顯示，BM-EPCs結(jié)合Dil-acLDL后呈紅色，結(jié)合了FITC-UEA-1的細(xì)胞呈綠色，結(jié)合了DAPI的細(xì)胞核呈藍(lán)色，雙陽(yáng)性細(xì)胞呈黃色，表明其具有EPCs增殖特性，見圖3。

圖2 BM-EPCs細(xì)胞表面抗原流式細(xì)胞術(shù)鑒定

A:吞噬Dil-acLDL的EPCs；B:吞噬FITC-UEA-1的EPCs；C:結(jié)合了DAPI的EPCs核；D:吞噬Dil-acLDL和FITC-UEA-1的雙陽(yáng)性EPCs。

2.3 BM-EPCs膜片建立及膜片厚度測(cè)定

單層BM-EPCs膜片的厚度約15 μm，3～4層膜片的厚度約60 μm，見圖4。

A:細(xì)胞連接更加緊密的膜片鏡下結(jié)構(gòu)(×200);B:細(xì)胞膜片形態(tài)(×100)。

2.4 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞膜片中細(xì)胞代謝

24 h之內(nèi)，與EPC單細(xì)胞組比較，EPC膜片組中細(xì)胞增殖更快(1.59±0.17vs.3.65±0.25，P<0.01)；24 h以后，由于EPC膜片組中細(xì)胞長(zhǎng)滿96孔板，生長(zhǎng)停滯繼而開始凋亡，見圖5。

a：P<0.01，與EPCs比較。

2.5 內(nèi)皮分化功能檢測(cè)

體外血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與EPC單細(xì)胞組比較，EPC膜片組血管形成能力更強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

A：EPC單細(xì)胞組(×100)；B：EPC膜片組(×100)；C：兩組細(xì)胞血管環(huán)數(shù)比較(n=6)；a：P<0.01，與EPC膜片組比較。

2.6 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞膜片旁分泌因子SDF-1α、VEGF、EGF水平

與EPC單細(xì)胞組比較，EPC膜片組細(xì)胞旁分泌SDF-1α 和VEGF的能力更強(qiáng)(P<0.05)，而兩組細(xì)胞旁分泌EGF的能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組細(xì)胞旁分泌因子水平比較

3 討 論

血管EPCs主要存在于骨髓及外周血中，不同來源EPCs生物學(xué)特征不同。骨髓中含有豐富的EPCs，正常生理?xiàng)l件下BM-EPCs 逐步分化為成熟EPCs到外周血中，通過內(nèi)皮化和新生血管化參與機(jī)體血管損傷修復(fù)和維持體內(nèi)EPCs的內(nèi)平衡[2]。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)，BM-EPCs被動(dòng)員釋放入外周循環(huán)，在不同細(xì)胞因子介導(dǎo)趨化下聚集到損傷部位，進(jìn)行血管再生從而達(dá)到修補(bǔ)損傷的作用。自然條件下通過動(dòng)員自身骨髓，遷移至損傷部位的EPCs數(shù)量有限，因此，通過不同的移植方式，增加局部EPCs是促進(jìn)局部組織修補(bǔ)的有效方法。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床中應(yīng)用的移植方式主要是在外科手術(shù)時(shí)心肌內(nèi)注射或者通過導(dǎo)管冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射，移植效果欠理想。因此，應(yīng)用EPCs進(jìn)行缺血心肌治療時(shí)，移植方式起到關(guān)鍵性作用，所以，尋求一種有效的干細(xì)胞移植方式至關(guān)重要[5,7-8]。有研究表明，EPCs在修復(fù)組織損傷過程中，可以通過旁分泌機(jī)制分泌一些抗炎、促血管生成的因子發(fā)揮重要作用，如SDF-1α,VEGF,EGF等[9-10]。由干細(xì)胞形成的干細(xì)胞膜片具有完整的細(xì)胞橋接結(jié)構(gòu)，具有更強(qiáng)的旁分泌機(jī)制。目前應(yīng)用最廣泛的制備干細(xì)胞膜片的技術(shù)為溫度感應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)板，利用細(xì)胞培養(yǎng)皿表面特殊的溫度反應(yīng)材料在溫差明顯的條件下形成完整片狀結(jié)構(gòu)[4]。多項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞等細(xì)胞膜片在皮膚損傷，骨損傷修復(fù)及心肌梗死修復(fù)表現(xiàn)出理想的結(jié)果[11-12]。為達(dá)到更佳的治療效果，通過組織工程學(xué)方法建立的細(xì)胞或干細(xì)胞膜片研究逐漸成為臨床研究熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過組織工程學(xué)方法，獲得EPCs膜片，比較EPCs膜片與EPCs生物學(xué)功能的不同。研究結(jié)果顯示，EPCs膜片在24 h內(nèi)，細(xì)胞增殖速度比EPCs快，EPCs膜片比EPCs血管生成能力強(qiáng)。局部心肌梗死發(fā)生后，細(xì)胞壞死并發(fā)生炎性反應(yīng)，釋放大量SDF-1α,BM-EPCs通過SDF-1α/CXCR4體系軸，具有向SDF-1α定向遷移的功能[13]。干細(xì)胞在發(fā)揮細(xì)胞生物學(xué)作用時(shí)，除了細(xì)胞自身發(fā)揮作用外，細(xì)胞之間的相互作用也非常重要，旁分泌信號(hào)通路是細(xì)胞間相互聯(lián)系最基本也是最重要的組成部分[14-15]。在EPCs膜片中，細(xì)胞相互間通過旁分泌細(xì)胞因子刺激，增強(qiáng)了細(xì)胞生物學(xué)功能，與大鼠BM-EPCs單細(xì)胞相比，EPCs膜片中細(xì)胞旁分泌SDF-1α,VEGF等重要因子的作用更強(qiáng)，這些關(guān)鍵因子進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路介導(dǎo)并強(qiáng)化相應(yīng)細(xì)胞學(xué)生物功能。本研究初步確定了EPCs膜片生物學(xué)功能優(yōu)勢(shì)，可為進(jìn)一步的研究提供了參考。但本研究還存在一些不足，今后將對(duì)更多的旁分泌的關(guān)鍵因子及其發(fā)揮作用的關(guān)鍵信號(hào)通路進(jìn)行深入研究。