陳俊宏，王洋，李芹，葉陽

(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 643000)

我國是肉制品消費大國，目前市場上經(jīng)過精加工的肉制品以肉糜制品居多，例如火腿腸、午餐肉等[1]。但大多肉糜制品經(jīng)過高溫滅菌工藝，導致肉糜營養(yǎng)損失嚴重，風味、口感以及鮮味都較差。目前多通過添加外源物的方式提高肉糜品質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)適量的蘆丁對抑制肉糜脂肪氧化以及改善品質(zhì)特性具有較好作用[2]。此外，在加工過程中食鹽的添加量與蒸煮溫度對于形成良好的肉糜品質(zhì)也具有一定的作用[3]。但對形成肉糜制品良好的口感與風味作用不大，目前眾多的研究表明發(fā)酵工藝可顯著提高肉制品的品質(zhì)，其富含的蛋白質(zhì)、脂肪等經(jīng)過微生物的氧化分解成氨基酸和短肽更易被人體吸收[4]，使其肉質(zhì)鮮嫩、風味獨特、易于保藏。常見的發(fā)酵肉制品主要有發(fā)酵香腸和發(fā)酵火腿，其極大程度上改善了原來肉制品的品質(zhì)，但其發(fā)酵工藝受原料及輔料組成、發(fā)酵劑種類[5]、發(fā)酵時間和溫度、添加量等因素[6]的影響較大。例如郭丹等[7]通過對益生菌發(fā)酵香腸工藝條件的篩選，發(fā)現(xiàn)適宜的發(fā)酵溫度、時間和益生菌添加量能顯著提高亞硝酸鹽的降解率和香腸的感官品質(zhì)。經(jīng)發(fā)酵后的香腸氨基酸含量和其揮發(fā)性成分物質(zhì)均顯著增加，是香腸風味形成的主要原因[8]。乳酸菌因其優(yōu)良的發(fā)酵特性在發(fā)酵肉制品中應用較多，例如利用植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌為發(fā)酵劑可以研制出風味、口感等都較好的糯玉米雞肉發(fā)酵香腸[9]；比較發(fā)現(xiàn)人工接種短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)的發(fā)酵風干香腸綜合品質(zhì)明顯優(yōu)于自然發(fā)酵對照組[10]。但目前卻少有研究將乳酸菌發(fā)酵工藝運用到火腿腸、午餐肉等肉糜制品的生產(chǎn)工藝中，本文為了研究乳酸菌發(fā)酵工藝對肉糜品質(zhì)的影響規(guī)律，拓展乳酸菌在肉制品工業(yè)中的應用，以5菌型的混合乳酸菌發(fā)酵菌粉進行發(fā)酵肉糜的制作，選用氨基酸含量、pH、亞硝酸鹽、質(zhì)構、色澤等反映發(fā)酵肉糜的品質(zhì)特征，確定肉糜發(fā)酵的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

優(yōu)質(zhì)豬后腿肉(肉80%、脂肪20%)、淀粉、白糖、鹽、葡萄糖、食品級亞硝酸鹽等：均為市售；乳酸菌酸奶發(fā)酵菌粉(5菌型，包括保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌，下文簡稱乳酸菌)：均由市售；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；PHS-3C酸度計 天津賽多利斯實驗儀器制造廠；LRH-250C生化培養(yǎng)箱 韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；WFJ7200可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；YX-18HM手提式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設備有限公司； DZ-400/2S真空包裝機 諸城市強大機械廠；TA.XT plus物性分析儀 英國Stable Micro Systems公司；UltraScan VIS臺式色差儀 上海韻鼎國際貿(mào)易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵肉糜基礎配方1.2.1.1 原料

豬瘦肉70%、豬肥膘20%。

1.2.1.2 輔料

以原料100%計，白砂糖2.2%、鹽2.5%、D-抗壞血酸鈉0.03%、亞硝酸鈉 0.01%、淀粉6%、適量發(fā)酵劑。

1.2.2 發(fā)酵肉糜工藝流程 1.2.2.1 工藝流程

1.2.2.2 操作要點

將原料肉肥瘦分離，去除筋腱，絞碎；按工藝配方中的比例加入食鹽、白砂糖、亞硝酸鹽混勻，在3～5 ℃下腌制2 h；將絞碎腌制后的肉斬拌5 min，混合加入其他輔料，斬拌5 min，在斬拌過程中加入20%冰水保證肉糜溫度在6 ℃；接種乳酸菌斬拌混勻，灌裝，緊密無氣孔；在35 ℃生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h；發(fā)酵結束后在85 ℃水浴中蒸煮30 min。

1.2.3 實驗設計

1.2.3.1 乳酸菌發(fā)酵溫度的確定

乳酸菌添加量為1.5%，發(fā)酵時間為24 h，探究乳酸菌發(fā)酵溫度分別為25，30，35，40 ℃時對乳酸菌發(fā)酵肉糜品質(zhì)的影響。

1.2.3.2 乳酸菌發(fā)酵時間的確定

乳酸菌添加量為1.5%，發(fā)酵溫度為35 ℃，探究乳酸菌發(fā)酵時間分別為12，18，24，30 h時對乳酸菌發(fā)酵肉糜品質(zhì)的影響。

1.2.3.3 乳酸菌添加量的確定

乳酸菌發(fā)酵溫度為35 ℃，發(fā)酵時間為24 h，探究乳酸菌添加量分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%時對乳酸菌發(fā)酵肉糜品質(zhì)的影響。

1.2.3.4 貯藏期理化特性變化規(guī)律

研究將蒸煮殺菌后的肉糜于0～4 ℃貯藏，每隔5 d檢測一次pH值、水分含量、亞硝酸鹽含量、氨基酸含量、色度，研究發(fā)酵肉糜在貯藏期的理化特性變化規(guī)律。

1.3 指標測定方法

1.3.1 理化指標的測定1.3.1.1 pH值的測定

采用GB 5009.237—2016測定。

1.3.1.2 水分的測定

采用GB 5009.3—2016中恒溫干燥法測定。

1.3.1.3 亞硝酸鹽含量的測定

參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》方法中的分光光度法進行測定。

1.3.1.4 氨基酸含量的測定

參照GB/T 8314—2013測定。

1.3.2 色澤的測定

將肉糜切成均勻一致的1 cm 厚度的圓片狀，用色度儀測定肉糜色澤，用 L*、a*、b*表示(L*表示亮度，a*表示紅色，b*表示黃色)。

1.3.3 質(zhì)構的測定

將發(fā)酵肉糜切割成3 cm左右的薄片，用于TPA質(zhì)地剖面分析測定，采用TA.XT plus物性測試儀。質(zhì)構測定參數(shù)：測定模式TPA；探頭P36R，測試前速度5.0 mm/s，測試速度2.0 mm/s，測試后速度5.0 mm/s，壓縮比30%, 兩次壓縮之間的時間間隔為5.0 s, 數(shù)據(jù)采集速率為400 pps，觸發(fā)值為5.0 g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，采用SPSS軟件進行最小顯著性差異法(least significant difference，LSD)顯著性分析(P<0.05)；用Microsoft Excel 2010 軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵溫度對發(fā)酵肉糜品質(zhì)的影響

溫度是微生物生長以及代謝活動的重要因素，由表1可知，隨著溫度的增加，發(fā)酵肉糜的各項品質(zhì)指標均變化顯著(P<0.05)。發(fā)酵溫度越高，pH下降程度越大，在35 ℃以后pH降低至5.53，同時pH開始緩慢下降，這與丁希等[11]的結果大致相符，表明乳酸菌適宜的發(fā)酵溫度在35 ℃附近。Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵魚肉香肉糜在37 ℃時蛋白質(zhì)發(fā)生激烈水解，且低pH能增強蛋白酶的活性。較高的發(fā)酵溫度可以加快乳酸菌的代謝活動，乳酸積聚速度加快，pH降低程度大；發(fā)酵溫度過低時不利于發(fā)酵風味的形成。乳酸菌發(fā)酵溫度在35 ℃時，蛋白質(zhì)大量分解產(chǎn)生氨基酸，促進發(fā)酵風味的形成，整體口感較好，且可大幅縮短肉糜成熟時間；如果溫度過高會對乳酸菌的代謝活動起到抑制，同時過度的發(fā)酵會導致肉糜的口感偏酸，同時油脂易酸敗造成營養(yǎng)流失。

表1 發(fā)酵溫度對肉糜品質(zhì)的影響

2.2 乳酸菌發(fā)酵時間對發(fā)酵肉糜品質(zhì)的影響

典型的發(fā)酵肉香肉糜通常表現(xiàn)為水分活度(Aw)低于0.92，pH在4.8～5.5之間[13]。由表2可知，發(fā)酵時間為18 h前的pH高于5.6，高pH的環(huán)境下不利于食品安全且無法形成良好的發(fā)酵風味；在24 h后pH降低到5.3左右，低pH環(huán)境能抑制病原菌和腐敗菌的生長增殖。隨著發(fā)酵時間的延長，肉糜表面疏水性也呈線性增加，且在發(fā)酵過程中疏水值差異顯著(P<0.05)[14]；同時pH的降低使蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)變性以及發(fā)酵降解，使結合水迅速向外擴散，產(chǎn)品水分不斷流失[15]。氨基酸含量反映了發(fā)酵的程度，隨著發(fā)酵時間的延長，氨基酸含量在不斷增加。汪雨等[16]研究發(fā)現(xiàn)草魚肉經(jīng)發(fā)酵后游離氨基酸由(0.62±0.01) g/100 g DM增加到1.65～1.98 g/100 g DM，恰好能反映這種變化趨勢。發(fā)酵24 h后，肉糜亞硝酸鹽的降解率為51.9%，此結果接近翟磊等[17]測定的兩株乳酸菌的亞硝酸鹽降解率分別可以達到85.4%和81.3%，表明乳酸菌發(fā)酵的確能有效降低食品中的亞硝酸鹽含量。綜合肉糜的酸味程度、水分含量等各項因素確定乳酸菌的最佳發(fā)酵時間在24 h，對發(fā)酵產(chǎn)品最為有利。

2.3 乳酸菌添加量對肉糜產(chǎn)品品質(zhì)的影響

不同乳酸菌添加量對發(fā)酵肉糜pH的影響見圖1。

圖1 乳酸菌添加量對pH的影響

由圖1可知，pH值隨著乳酸菌添加量的增加顯著下降(P<0.05)，根據(jù)多重比較分析結果發(fā)現(xiàn)不同乳酸菌添加量的各組之間對pH的差異顯著(P<0.05)，表明乳酸菌添加量對發(fā)酵肉糜的pH值影響很大。且在一定范圍增加接種量可以增加產(chǎn)酸，但酸度過低會掩蓋發(fā)酵肉糜的固有風味，帶來不良的感官風味。當乳酸菌添加量在2.0%時產(chǎn)品品質(zhì)最為合適，經(jīng)過發(fā)酵后的肉糜pH降為5.33，與王志威等的研究結果相近，當接種量為2%時，雞肉發(fā)酵肉糜的pH在5.25左右。乳酸菌通過淀粉等分解產(chǎn)生乳酸能降低pH，當乳酸菌發(fā)酵的底物足夠時，能最大程度地滿足乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)酸，降低體系pH的同時為發(fā)酵和乳酸菌的生長創(chuàng)造良好的條件[18]。但隨著乳酸菌的添加量不斷增加，蛋白質(zhì)發(fā)生降解會產(chǎn)生一些堿性的含氮物質(zhì)(如堿性的游離氨基酸、小肽等)，使pH降低速度變得緩慢。

不同乳酸菌添加量對發(fā)酵肉糜水分含量的影響見圖2。

圖2 乳酸菌添加量對水分的影響

由圖2可知，各實驗組的肉糜水分含量均顯著降低(P<0.05)，根據(jù)多重比較結果分析，當乳酸菌添加量為1.5%和2.0%時，顯著性指數(shù)為0.86>0.05，推斷在0.05顯著性水平下的均值無顯著差異，表明當乳酸菌添加量為1.5%和2.0%時，對于發(fā)酵肉糜中水分含量的影響不大。當添加量為2.0%時，水分含量為64.973%，肉糜中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)有利于肉糜保持水分，經(jīng)發(fā)酵后肉糜中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)分解為氨基酸等小分子物質(zhì)，使肉糜的持水力下降。肉糜中水分含量的變化會改變其感官品質(zhì)，水分過多，肉糜組織結構會比較分散；水分過少，肉糜硬度增加，彈性差。將肉糜中的水分含量維持在一個較高的水平，可以保證產(chǎn)品的鮮美程度并具有較高的嫩度，綜合感官品質(zhì)較高。

由圖3可知，亞硝酸鹽殘留量在乳酸菌添加量為2.0%之前顯著降低(P<0.05)，之后逐漸趨于穩(wěn)定。根據(jù)多重比較結果分析，當乳酸菌添加量為2.0%和2.5%時，顯著性指數(shù)為0.059>0.05，表明乳酸菌添加量為2.0%和2.5%時，發(fā)酵肉糜中的亞硝酸鹽殘留量變化差異不顯著。當添加量為2%時，亞硝酸鹽含量在11.09 mg/kg，降低了44.80%，與王新惠等研究的復合發(fā)酵劑組的亞硝酸鹽降解率94.1%相比，還存在較大差異[19]，可以推測這種差異來自于菌種降解亞硝酸鹽的能力不同[20]。亞硝酸鹽含量降低是由于肉制品中含有的還原性物質(zhì)會促使亞硝酸鹽發(fā)生降解；亞硝酸根與肌紅蛋白和血紅蛋白結合形成穩(wěn)定的絡合物，消耗大部分亞硝酸鹽；同時乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的一些帶巰基的物質(zhì)也會和亞硝酸鹽發(fā)生反應，從而降低亞硝酸鹽的量[21]；當乳酸菌添加量在2.0%～2.5%范圍內(nèi)時，亞硝酸鹽含量逐漸平穩(wěn)。

圖3 乳酸菌添加量對亞硝酸鹽的影響

由圖4可知，隨著乳酸菌添加量的增加，氨基酸含量顯著增加(P<0.05)，且在添加量為2.0%時逐漸趨于平衡，與添加量為0.5%相比氨基酸含量增長了25.9%。根據(jù)多重比較結果分析，乳酸菌添加量為2.0%和2.5%時，顯著性指數(shù)為0.202>0.05，表明發(fā)酵肉糜中氨基酸含量在乳酸菌添加量為2.0%和2.5%時變化不明顯。這是因為乳酸菌通過發(fā)酵使部分蛋白質(zhì)水解，使得肉糜中氨基酸含量大幅度增加，有助于人體消化利用，營養(yǎng)價值更高。當肉糜中蛋白質(zhì)消耗到一定程度時，氨基酸的分解也開始減緩，氨基酸的含量也逐漸趨于穩(wěn)定。

圖4 乳酸菌添加量對氨基酸的影響

綜合發(fā)酵肉糜的各項理化指標，證明乳酸菌添加量為2%條件下發(fā)酵得到的肉糜產(chǎn)品具有較好的風味與口感。

2.4 乳酸菌添加量對肉糜感官質(zhì)構的影響

乳酸菌的添加對肉糜質(zhì)構特性有顯著的影響，由表3可知，硬度隨著乳酸菌用量的增加整體上呈先上升后下降的趨勢，因為蛋白質(zhì)具有很強的凝膠性，可以提高發(fā)酵肉糜的硬度；但隨著乳酸菌添加量增加，蛋白質(zhì)逐步被消耗，使得產(chǎn)品的硬度開始下降，當乳酸菌添加量為2%時，產(chǎn)品硬度較好。彈性的形成是一些乳酸菌能夠分泌胞外多糖與蛋白質(zhì)形成網(wǎng)絡結構，增加了肉糜的彈性[22]，發(fā)酵過程中隨著乳酸菌添加量的增加，肉糜中的蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)被大量消耗，網(wǎng)絡結構被破壞，使發(fā)酵肉糜的彈性逐漸喪失。乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸對肌原纖維和結締組織有一定破壞作用，因此可以改善肉糜的嫩度，口感更細膩[23]。由于乳酸菌的作用使得蛋白質(zhì)分解，蛋白質(zhì)分子之間、蛋白質(zhì)與脂肪之間的凝膠網(wǎng)絡結構解體，使得發(fā)酵后的肉糜凝聚性整體上呈現(xiàn)下降的趨勢[24]。

表3 發(fā)酵肉糜質(zhì)構分析結果

2.5 發(fā)酵肉糜貯藏期理化特性與色差變化規(guī)律

由圖5可知，pH值在貯藏期間均呈現(xiàn)先下降，在后期稍有回升的趨勢。pH值的回升可能是由于微生物或酶的作用，使蛋白質(zhì)發(fā)生分解產(chǎn)生一些堿性的含氮物質(zhì)，或是乳酸菌的生長環(huán)境變差而產(chǎn)酸能力下降從而導致pH值回升。乳酸菌添加量越大，水分含量降低的程度越大，其原因可能與乳酸菌的代謝程度相關。其次水分含量的變化趨勢基本一致：前期水分含量持續(xù)降低，而后則趨于緩慢地降低，這與王靜云等[25]的實驗結果類似。推測其原因是前期肉糜處于發(fā)酵階段，蛋白質(zhì)降解速度快，持水力則顯著降低；后期處于成熟階段，乳酸菌代謝停止，肉糜內(nèi)部自由水不再變化，水分的降低不僅有利于肉糜的儲藏，而且對于產(chǎn)品的質(zhì)構與風味都有影響。

圖5 貯藏期發(fā)酵肉糜的理化規(guī)律變化

前10 d，亞硝酸鹽含量下降較快，此時由于乳酸菌還處于生長繁殖的階段，能降解亞硝酸鹽，有效降低亞硝酸鹽的副作用，使產(chǎn)品更有安全性。氨基酸在貯藏過程中均不斷增加，而后趨于平緩，這是由于蛋白質(zhì)分解從而使氨基酸含量升高，隨著貯藏時間的增加，氨基酸上升趨勢逐漸平衡。

對貯藏期內(nèi)乳酸菌發(fā)酵肉糜的色差分析結果見表4。通過色差儀測定普通肉糜色度值分別為：L*值在1 ～6 d之間呈增加趨勢，在7 d之后開始降低，與Ning 等[26]的研究結果基本一致。其次a*值總體上呈先上升后下降的趨勢，原因是亞硝酸鹽殘留量隨著貯藏時間的延長而降低，會減少肌紅蛋白和血紅蛋白的生成，使得發(fā)酵肉糜的a*值下降；此外，研究發(fā)現(xiàn)Lys、Arg或Cys具有抗氧化和螯合金屬陽離子特性，這可能有助于a*值的增加[27]。

表4 發(fā)酵肉糜貯藏期內(nèi)的色差分析

續(xù) 表

3 結論

上述實驗結果表明肉糜最佳的乳酸菌發(fā)酵工藝為：乳酸菌添加量為2%時，在發(fā)酵溫度為35 ℃的條件下發(fā)酵24 h。在此條件下的發(fā)酵肉糜pH值為5.33±0.02，水分含量為64.937%±0.095%，氨基酸含量為(1783.33±28.87)g/kg，且亞硝酸含量為(11.092±0.02) mg/kg，降解率在44.80%左右，遠小于國家標準30 mg/kg，發(fā)酵肉糜具有較好色澤，肉質(zhì)細嫩，彈性較好。同時研究發(fā)現(xiàn)在15 d的貯藏期內(nèi)發(fā)酵肉糜質(zhì)量變化主要源自于水分含量的減少以及氨基酸含量的增加。經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后的肉糜，氨基酸含量增加，營養(yǎng)價值提高，同時產(chǎn)生很多揮發(fā)性風味物質(zhì)；且降低了肉糜中亞硝酸鹽的殘留量，增加了肉糜產(chǎn)品的安全性；低pH的環(huán)境還能有效抑制肉糜中有害微生物的生長繁殖，延長保質(zhì)期。乳酸菌發(fā)酵肉糜的品質(zhì)研究對提高肉糜制品的品質(zhì)與營養(yǎng)具有重要作用，不僅能擴大乳酸菌發(fā)酵劑的應用范圍，對于肉制品工業(yè)化生產(chǎn)具有理論指導意義，而且能夠推動我國肉制品精深加工技術的研究與創(chuàng)新。