重組人促紅細胞生成素對新生鼠腦室周圍白質(zhì)軟化的影響及其機制

宋茂，曹云濤，雷賢明

遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴州遵義 563000

腦室周圍白質(zhì)軟化（PVL）是早產(chǎn)兒腦白質(zhì)非出血性神經(jīng)病理學損傷的主要類型，其主要病理為腦缺氧、缺血、炎癥等多種因素引起腦組織少突膠質(zhì)細胞（OLs）丟失、小膠質(zhì)細胞活化、神經(jīng)元死亡，導致腦白質(zhì)壞死性病變、髓鞘減少及腦室擴大［1-2］。PVL發(fā)生率隨著胎齡降低而增加，在胎齡為24～32周、出生體質(zhì)量＜1 500 g的早產(chǎn)兒中發(fā)病率19.8%～34.1%；其不僅是腦癱的主要危險因素，還與兒童社交和情感發(fā)展障礙、注意力障礙、認知缺陷及視聽覺障礙等有關(guān)［2-3］。目前，尚未發(fā)現(xiàn)對PVL有效的治療措施。因此，尋找治療早產(chǎn)兒PVL和改善PVL所致神經(jīng)功能障礙的潛在方法有重要臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，促紅細胞生成素（EPO）是重要的神經(jīng)保護和營養(yǎng)因子，外源性EPO可減輕新生兒腦損傷［4-5］。2"，3"-環(huán)核苷酸3"-磷酸二酯酶（CNPase）為OLs和髓鞘標志物，其表達減少可提示OLs成熟及髓鞘再生障礙［6］。神經(jīng)膠質(zhì)抗原2（NG2）是少突膠質(zhì)細胞前體（pre-OLs）特異性細胞標志物。當發(fā)生腦損傷時，pre-OLs可代償性增殖分化從而促進OLs成熟和髓鞘形成，使NG2表達增多［7］。2019年2月—2020年1月，本研究采用外源性重組人促紅細胞生成素（rEPO）干預新生鼠PVL模型，通過觀察新生鼠腦組織形態(tài)及腦組織中CNPase和NG2的表達，探討rEPO對新生鼠PVL神經(jīng)保護的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：親代SD大鼠20只，其中雄性大鼠5只，體質(zhì)量320～380 g；雌性大鼠15只，體質(zhì)量200～250 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2014-0011。主要試劑：rEPO（依普定）4 000 IU/mL購自山東科興生物制品有限公司（國藥準字S20030083）；盧卡斯固藍（LFB）髓鞘染色液（G3245）購自北京索萊寶科技有限公司；CNPase一抗購自R&D System（ab227218）；NG2一抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（bs-5829R）；鼠兔通用型二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 分組處理與PVL模型制作 將15只雌鼠及5只雄鼠隨機以3∶1的比例進行合籠自行交配；待雌鼠產(chǎn)鼠后，選擇72只產(chǎn)后第3天SD大鼠，將其隨機分為PVL模型組、rEPO干預組和假手術(shù)組各24只，各組體質(zhì)量、雌雄比例具有可比性。PVL模型組、rEPO干預組根據(jù)前期課題組PVL建模方法［8］，將新生鼠結(jié)扎左頸總動脈，隨后給予低氧混合氣體（8%O2+92%N2）缺氧70 min，建立PVL模型；假手術(shù)組只分離左頸總動脈，但不行結(jié)扎和缺氧處理。

1.3 干預處理與標本獲取 于術(shù)后1 d，將rEPO干預組新生鼠經(jīng)腹腔注射5 IU/g稀釋濃度為200IU/mL的rEPO［2］，1次/天，連續(xù)注射7 d；PVL模型組及假手術(shù)組新生鼠以相同方式注射相同容積的生理鹽水。于術(shù)后3、7、14 d分別從各組中隨機抽取8只新生鼠，采用多聚甲醛灌注心臟處死，取新生鼠腦組織常規(guī)脫水石蠟包埋。

1.4 腦組織形態(tài)觀察 各組隨機選取部分石蠟包埋的腦組織切片，再行腦冠狀面切片，切片厚度5μm。行HE染色于光鏡下觀察各組側(cè)腦室及腦室周圍白質(zhì)組織形態(tài)，行LFB髓鞘染色于光鏡下觀察各組髓鞘組織形態(tài)。

1.5 腦室周圍白質(zhì)組織CNPase、NG2表達檢測 采用免疫組織化學法。選取切片厚度3～4μm的腦組織，常規(guī)脫水、脫蠟；抗原修復，封閉抗原；滴加一抗（CNPase滴度1∶200、NG2滴度1∶100）過夜，復溫后滴加二抗孵育30 min；DAB鏡下顯色30 s后蘇木素復染，切片分化后再次脫水、透明，中性樹脂封片。選用Image-Pro Plus 6.0對封片圖像進行定量分析，計算平均光密度（AOD）值以此表示CNPase、NG2表達水平。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以-x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組新生鼠腦組織形態(tài)觀察結(jié)果

2.1.1 側(cè)腦室HE染色結(jié)果 在術(shù)后各時間點，PVL模型組及rEPO干預組均可見左側(cè)側(cè)腦室較對側(cè)擴大，假手術(shù)組雙側(cè)側(cè)腦室均未見明顯病理改變；PVL模型組術(shù)后14 d腦組織出現(xiàn)腦萎縮，左側(cè)腦室明顯擴大；rEPO干預組術(shù)后14 d可見腦萎縮、左側(cè)腦室擴大，但與PVL模型組比較病理改變均較小。見OSID碼圖1。

2.1.2 腦室周圍白質(zhì)HE染色結(jié)果 術(shù)后3 d，PVL模型組及rEPO干預組側(cè)腦室周圍白質(zhì)可見散在炎癥細胞浸潤，細胞水腫，神經(jīng)元核固縮，神經(jīng)元變性，部分呈空泡狀，伴小膠質(zhì)細胞增生；術(shù)后7 d，PVL模型組側(cè)腦室周圍白質(zhì)病理改變較前加重，組織疏松明顯，見多發(fā)液化灶、篩狀軟化灶形成；術(shù)后14 d，PVL模型組軟化灶較前減少，但左側(cè)側(cè)腦室、第三腦室明顯擴大，并伴囊腔、膠質(zhì)瘢痕形成，腦組織、胼胝體萎縮和神經(jīng)纖維紊亂。術(shù)后各時點，rEPO干預組腦室周圍白質(zhì)病理改變均較PVL模型組輕，假手術(shù)組腦室周圍白質(zhì)細胞形態(tài)及分布正常。見OSID碼圖2。

2.1.3 髓鞘組織LFB染色結(jié)果 術(shù)后3 d，PVL模型組及rEPO干預組可見髓鞘水腫，部分髓鞘斷裂，伴空泡形成。術(shù)后7 d，PVL模型組及rEPO干預組髓鞘水腫加重，髓鞘區(qū)見大量空泡形成，髓鞘染色較術(shù)后3 d變淺，但rEPO干預組髓鞘病理改變輕于PVL模型組。術(shù)后14 d，PVL模型組髓鞘水腫較前減輕，神經(jīng)纖維走行呈條索狀或網(wǎng)狀；rEPO干預組髓鞘較清晰，神經(jīng)纖維走行較規(guī)則。假手術(shù)組在術(shù)后各時點髓鞘結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)纖維走行清晰而規(guī)則。見OSID碼圖3。

2.2 三組新生鼠腦室周圍白質(zhì)組織CNPase表達比較 各組術(shù)后同時點比較，新生鼠腦室周圍白質(zhì)組織CNPase表達假手術(shù)組＞rEPO干預組＞PVL模型組（P均＜0.05）；同組術(shù)后各時點比較，rEPO干預組及PVL模型組腦室周圍白質(zhì)區(qū)CNPase表達術(shù)后14 d＞術(shù)后3 d＞術(shù)后7 d（P均＜0.05）；假手術(shù)組術(shù)后3 d＞術(shù)后7 d、14 d，術(shù)后7 d與14 d比較差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 三組新生鼠腦室周圍白質(zhì)區(qū)不同時間點CNPase表達水平比較（±s）

表1 三組新生鼠腦室周圍白質(zhì)區(qū)不同時間點CNPase表達水平比較（±s）

注：與同組術(shù)后3 d比較，a P＜0.05；與同組術(shù)后7 d比較，b P＜0.05；與假手術(shù)組同時點比較，c P＜0.05；與PVL組同時點比較，d P＜0.05。

組別假手術(shù)組rEPO組PVL模型組F P n 8 8 8術(shù)后3 d 116.05±11.79 66.04± 5.16d 46.92± 5.30c 122.33＜0.01術(shù)后7 d 102.55±10.05a 45.76± 3.30ad 32.76± 3.86ac 260.56＜0.01術(shù)后14 d 101.79±14.09a 76.66± 9.90bcd 61.50± 3.69abc 32.10＜0.01 F 3.52 43.82 87.69 P 0.04＜0.01＜0.01

2.3 三組新生鼠腦室周圍白質(zhì)組織NG2表達比較 各組術(shù)后同時點比較，新生鼠腦室周圍白質(zhì)組織NG2表達rEPO干預組＞PVL模型組＞假手術(shù)組（P均＜0.05）；術(shù)后隨著時間推移，三組腦室周圍白質(zhì)區(qū)NG2表達水平逐漸下降（P均＜0.05）。見表2。

表2 三組新生鼠腦室周圍白質(zhì)區(qū)不同時間點NG2表達水平比較（±s）

表2 三組新生鼠腦室周圍白質(zhì)區(qū)不同時間點NG2表達水平比較（±s）

注：與同組術(shù)后3 d比較，a P＜0.05；與同組術(shù)后7 d比較，b P＜0.05；與假手術(shù)組同時點比較，c P＜0.05；與PVL組同時點比較，d P＜0.05。

組別假手術(shù)組rEPO組PVL組F P n 8 8 8術(shù)后3 d 56.94±2.30 73.62±4.60d 63.09±4.06c 36.63＜0.01術(shù)后7 d 44.88±1.15a 56.96±2.03ad 48.50±0.28ac 166.56＜0.01術(shù)后14 d 39.61±1.70ab 53.96±2.88ad 35.96±0.87abc 180.20＜0.01 F 141.86 80.33 255.46 P＜0.01＜0.01＜0.01

3 討論

PVL是早產(chǎn)兒腦損傷的主要類型，人類PVL主要發(fā)生于胎齡23～32周，此階段以pre-OLs為主，也是髓鞘形成關(guān)鍵期［9］。CRAIG等［10］研究顯示，出生2～5 d大鼠的腦組織處于pre-OLs階段，與早產(chǎn)兒所處的發(fā)育階段相似；因此，出生3 d的大鼠符合人類早產(chǎn)兒PVL發(fā)病時間，故可用于PVL動物模型制作。本研究發(fā)現(xiàn)，PVL模型組及rEPO干預組腦室周圍白質(zhì)組織均可見腦細胞水腫、壞死，神經(jīng)元死亡，軟化灶及膠質(zhì)瘢痕形成，左側(cè)腦室擴大、胼胝體變?。籐FB髓鞘染色顯示PVL模型組髓鞘斷裂、神經(jīng)纖維走形紊亂，上述改變均符合PVL腦組織病理改變，可進一步證實PVL建模成功。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，PVL模型組、rEPO干預組術(shù)后7 d腦室周圍白質(zhì)損傷、脫髓鞘病變最為明顯，其可能因為該時段是新生鼠大量OLs成熟和髓鞘開始形成的關(guān)鍵時期，而兩組新生鼠由于前期缺血、缺氧導致大量OLs損傷和髓鞘化障礙，此時其本身的代償機制又尚未發(fā)揮保護作用［10］。

PVL的主要病理特征是缺血性損傷抑制OLs分化成熟，導致髓鞘形成、成熟障礙。OLs的發(fā)育有三個連續(xù)階段：OLs祖細胞、pre-OLs及成熟OLs［9］。NG2是pre-OLs特異性細胞標志物。研究顯示，pre-OLs對缺氧、缺血損傷高度敏感，當發(fā)生腦損傷時，pre-OLs可代償性增殖分化，促進OLs成熟和髓鞘化形成［11］。CNPase作為OLs和髓鞘標志物，任何原因?qū)е碌膒re-OLs分化及成熟障礙、髓鞘再生障礙都將使CNPase表達減少［12］。因此，通過動態(tài)監(jiān)測CNPase、NG2表達水平，可反映OLs再生及髓鞘形成情況。本研究顯示，隨著時間推移，各組腦室周圍白質(zhì)組織NG2表達逐漸降低，提示隨著新生鼠日齡增長，pre-OLs逐漸分化為成熟的OLs，這符合pre-OLs的發(fā)育規(guī)則；PVL模型組腦室周圍白質(zhì)組織NG2表達高于假手術(shù)組，可能與pre-OLs在腦組織遭受缺血、缺氧損傷后代償性增殖分化以補充OLs，為后期髓鞘形成提供保障有關(guān)。本研究觀察到CNPase在各組腦室周圍白質(zhì)組織均有表達，且在假手術(shù)組腦室周圍白質(zhì)組織表達最多。隨著新生鼠日齡增長，少突膠質(zhì)細胞逐漸分化成熟并形成髓鞘，CNPase表達逐漸趨于穩(wěn)定［10］。本研究結(jié)果同樣顯示，假手術(shù)組CNPase表達在新生鼠術(shù)后3 d后減少，而在術(shù)后7 d與14 d的差異無統(tǒng)計學意義。PVL模型組腦室周圍白質(zhì)組織CNPase表達最少，提示缺血、缺氧損傷可導致OLs成熟障礙及腦組織脫髓鞘樣變。EPO是新生兒期大腦功能發(fā)育的重要生長和保護因子［4］。研究發(fā)現(xiàn)，高劑量rEPO（5 IU/g）可通過血腦屏障，在注射rEPO 2.0～2.5 h后，大鼠腦脊液內(nèi)的濃度即可達到神經(jīng)保護作用；外源性EPO可顯著減少凋亡細胞和減輕腦水腫，并可通過促進OLs成熟以及髓鞘形成來發(fā)揮其保護作用［13-15］。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)rEPO治療后的PVL新生鼠在術(shù)后3、7、14 d腦水腫、腦室擴大均減輕，髓鞘斷裂少見，神經(jīng)纖維走形尚清晰，提示rEPO可減輕PVL新生鼠腦組織細胞水腫、腦室擴大及腦組織萎縮等病理性損傷，并可促進髓鞘修復。rEPO干預后的PVL新生鼠腦室周圍白質(zhì)區(qū)CNPase表達明顯升高，提示外源性EPO可促進CNPase表達，從而促進OLs分化和髓鞘形成，與ZHU等［15］研究結(jié)果一致。rEPO干預組腦組織NG2表達水平明顯升高，NG2表達量在術(shù)后7、14 d均高于PVL模型組，提示rEPO可促進pre-OLs增殖分化，促進OLs成熟。由此可見，我們認為rEPO可通過增加OLs及pre-OLs促進OLs成熟及髓鞘形成，從而減輕腦缺氧、缺血引發(fā)的新生鼠PVL。