高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)云南小曲清香型白酒中九種甜味劑的方法

仁紹坤 陸應(yīng)彩

小曲清香型是云南生產(chǎn)的白酒香型代表，這是一種以糧谷為主要釀造原料，以小曲或純種根霉為糖化發(fā)酵劑，采用傳統(tǒng)的固態(tài)法生產(chǎn)，不添加任何呈香呈味呈色物質(zhì)的白酒。好的小曲清香型白酒要經(jīng)過糖化發(fā)酵、蒸煮培菌等極其復(fù)雜特殊的釀造工藝，唯有如此，酒體才會(huì)呈現(xiàn)甘醇的口感。而很多沒錢、沒技術(shù)、沒好原料的小作坊、小企業(yè)，為了達(dá)到這種甘醇的口感，就在制造過程中非法添加一些添加劑，比如甜味劑、增香劑等來達(dá)到良好的香氣和口感。我國(guó)在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB2760-2014中明確規(guī)定了甜蜜素、阿斯巴甜、紐甜等甜味劑的適用范圍及添加限量，而純白酒中不得使用甜味劑。

對(duì)于食品中甜味劑的檢測(cè)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)涉及的大多是色譜法，比如高效液相色譜法、氣相色譜法、離子色譜法，存在檢出限高、只能單一檢測(cè)一種或兩種甜味劑、多種甜味劑同時(shí)檢測(cè)分離效果不佳等問題。而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有定性結(jié)果可靠、靈敏度高、能同時(shí)快速測(cè)定多種物質(zhì)的特點(diǎn)，成為甜味劑檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來也有許多關(guān)于液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)檢測(cè)白酒中多種甜味劑的方法研究，《白酒中四種甜味劑的測(cè)定-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》DB34/T2498-2015和《白酒中甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜和三氯蔗糖四種甜味劑的測(cè)定方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》DBS52/007-2014這兩個(gè)地方標(biāo)準(zhǔn)都采用液質(zhì)聯(lián)用法來檢測(cè)白酒中的甜味劑，但只包含了4種甜味劑，種類較少，而其他的方法又存在一定的弊端，如前處理較繁瑣、流動(dòng)相復(fù)雜、靈敏度偏低、檢出限和定量限較高、耗時(shí)長(zhǎng)等。因此，本研究的目的就是要建立一種快捷、準(zhǔn)確、靈敏度好、精密度高、可同時(shí)檢測(cè)云南小曲清香型白酒中多種甜味劑的液質(zhì)聯(lián)用方法。

一、材料與儀器

1.樣品。成品酒，取自于云南西雙版納傣族自治州景洪市、勐?？h、勐臘縣市售小曲清香白酒。

2.試劑。甲醇（色譜純），美國(guó)Fisher公司；甲酸（色譜級(jí)），Aladdin；實(shí)驗(yàn)室用水，屈臣氏超純水。

3.標(biāo)準(zhǔn)品。安賽蜜（液體，100171，1mg/mL，純度>99.0%），北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司；糖精鈉（液體，19001，1mg/ml，純度>99.0%），中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；甜蜜素（固體，G855226，純度99.9%），Dr.Ehrenstorfer公司；三氯蔗糖（固體，2000μg/ml，S047521，純度99.9%），天津阿爾塔科技有限公司；阿斯巴甜（固體，128464，純度≥97.7%），Dr.Ehrenstorfer公司；阿力甜（液體，70480，純度≥99.8%），TMstandard；愛德萬甜（固體，ALT702308，純度>99.0%），天津阿爾塔科技有限公司；紐甜（液體，2008087，1000μg/mL，壇墨質(zhì)檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甜菊糖苷（液體，S057199，1000μg/mL），天津阿爾塔科技有限公司。甲酸水溶液（0.1%）：準(zhǔn)確移取0.1mL甲酸置于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。

4.儀器。Agilent高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，安捷倫科技有限公司，Agilent1290InfinityⅡ/6470LC/TQ；萬分之一天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，SI-224；水浴鍋HH-6，常州國(guó)華電器有限公司；有機(jī)濾膜，孔徑0.22μm，天津津滕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)與方法

1.標(biāo)準(zhǔn)溶液制備。（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱取阿斯巴甜（固態(tài)）、甜蜜素（固態(tài)）、糖精鈉（固態(tài)）、愛德萬甜（固態(tài)）標(biāo)準(zhǔn)品各0.010g，置于10mL容量瓶中并用純水定容，制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。安賽蜜、三氯蔗糖、阿力甜、紐甜、甜菊糖苷均為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。（2）標(biāo)準(zhǔn)使用液。取上述1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mL，用水定容至100mL，配置成10000μg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液。再用純水稀釋成濃度分別為5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、500μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線系列，過0.22μm濾膜，依據(jù)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。

2.白酒樣品預(yù)處理。用燒杯稱取樣品約10g（精確至0.01g），置60℃恒溫水浴，直至乙醇除凈。再移入50mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，過0.22μm濾膜，依據(jù)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。

3.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件。（1）液相色譜條件。色譜柱：oroshell120EC-C18（2.1mm*100mm，1.9μm）；進(jìn)樣量：5μL；流動(dòng)相：A：甲酸水溶液（0.1%），B：甲醇；流速：0.3mL/min；柱溫：35℃；采用梯度洗脫：0.0-0.5min，A：95%，B：5%；0.5-3.0min，A：95%-10%，B：5%-90%；3.0-6.5min，A：10%，B：90%；6.5-7.5min，A：10%-95%，B：90%-5%；7.5-8.0min，A：95%，B：5%。（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧電離ESI（-）ESI（+）；毛細(xì)管電壓：3500V[ESI（+）]，3500V[ESI（-）]；毛細(xì)管反吹干燥氣溫度：280℃；毛細(xì)管反吹干燥氣流量：9L/min；霧化器壓力：40psi；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流量：11L/min；噴嘴電壓：500V[ESI（+）]，500V[ESI（-）]；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式MRM；駐留時(shí)間：40ms。

三、結(jié)果與分析

1.樣品前處理的優(yōu)化。白酒樣品中含有的乙醇會(huì)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾，采用濾膜過濾、離心、加水稀釋的方法并不能完全消除乙醇的影響，采用氮吹或是旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法對(duì)儀器的要求相對(duì)較高，耗時(shí)也比較長(zhǎng)。本研究選擇把樣品于60℃水浴加熱來除去乙醇，可以有效減弱乙醇基質(zhì)干擾，降低乙醇對(duì)色譜峰峰型的影響，提高檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性。

2.質(zhì)譜條件的選擇。將一定質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)注入質(zhì)譜，在ESI負(fù)離子/正離子MS1Scan模式下掃描各甜味劑的母離子。結(jié)果表明，愛德萬甜在正離子模式下有較強(qiáng)的質(zhì)譜信號(hào)，其他8種甜味劑在負(fù)離子模式下有較強(qiáng)的質(zhì)譜信號(hào)。因干燥氣流速、干燥氣溫度、鞘氣溫度、電壓、駐留時(shí)間等因素均會(huì)影響靈敏度，所以在不同的條件下進(jìn)行了多次試驗(yàn)，最終確定的質(zhì)譜條件是：毛細(xì)管電壓：3500V[ESI（+）]，3500V[ESI（-）]；毛細(xì)管反吹干燥氣溫度：280℃；毛細(xì)管反吹干燥氣流量：9L/min；霧化器壓力：40psi；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流量：11L/min；噴嘴電壓：500V[ESI（+）]，500V[ESI（-）]；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式MRM；駐留時(shí)間：40ms。在上述質(zhì)譜條件下，對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物離子進(jìn)行了自動(dòng)優(yōu)化，檢測(cè)得到9種甜味劑化合物選擇離子流圖，詳見圖1，9種甜味劑化合物響應(yīng)值與靈敏度都表現(xiàn)良好，目標(biāo)物的信號(hào)與離子豐度較強(qiáng)。最終MRM優(yōu)化參數(shù)結(jié)果詳見表2。

3.線性范圍和檢出限。按5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、500μg/L配制混合標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度，在優(yōu)化后的色譜和串聯(lián)質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，詳見表3。從表3可見，9種甜味劑在各自測(cè)定范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.998，檢出限LOD（S/N=3）是0.03μg/L-5.00μg/L，定量限LOQ（S/N=10）是0.1μg/L-15.0μg/L，靈敏度較高。

4.精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)。取濃度分別為50μg/L、100μg/L、400μg/L且放置10天的三個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化后的色譜和串聯(lián)質(zhì)譜條件下各連續(xù)進(jìn)樣6次，考察儀器的精密度，結(jié)果見表4。從表4可見，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間和峰面積的RSD分別是0.00%-0.210%和0.047%-1.400%，說明儀器的精密度和穩(wěn)定性良好。

5.回收率試驗(yàn)。分別稱取不含有分析物的來自西雙版納州不同縣市的三個(gè)白酒樣品各1份，分別加入高、中、低3種濃度（200μg/L、100μg/L、50μg/L）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述樣品前處理步驟進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算其回收率，結(jié)果見表5。由表5可見，安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、愛德萬甜、紐甜、甜菊糖苷的加標(biāo)回收率在95.2%-118.4%之間，說明該檢測(cè)方法有較好的準(zhǔn)確度，可以滿足日常檢測(cè)要求。

6.樣品分析。按優(yōu)化后的試驗(yàn)分析方法，對(duì)西雙版納州三個(gè)縣市30個(gè)市售小曲清香型白酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，9種甜味劑均無響應(yīng)值，即均未檢出，符合國(guó)家對(duì)白酒甜味劑的要求。

本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，建立了云南小曲清香白酒中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、愛德萬甜、紐甜、甜菊糖苷九種人工甜味劑同時(shí)檢測(cè)的分析方法。該方法在8min內(nèi)完成九種甜味劑目標(biāo)化合物的分離，且安賽蜜、阿力甜、愛德萬甜在質(zhì)量濃度為5.0μg/L-100μg/L，糖精鈉、紐甜在質(zhì)量濃度為5.0μg/ L-200μg/L，阿斯巴甜在質(zhì)量濃度為5.0-400μg/L，甜蜜素、三氯蔗糖、甜菊糖苷在質(zhì)量濃度為5.0μg/L-500μg/L時(shí)，有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2≥0.998，檢出限LOD（S/N=3）是0.03μg/L-5.00μg/L，定量限LOQ（S/N=10）是0.1μg/L-15.0μg/L。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)準(zhǔn)確，靈敏度高，大大提高了分析效率，降低了儀器檢測(cè)限和方法定量限，可為云南小曲清香白酒人工甜味劑非法添加的檢測(cè)提供技術(shù)支撐。