謝錦霞 ，劉晶晶

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，晚期出現(xiàn)陰道出血等癥狀[1]。近些年，宮頸細(xì)胞學(xué)篩查的普遍應(yīng)用使宮頸癌的發(fā)病率和死亡率已有明顯下降，但癌細(xì)胞生物學(xué)特性多種多樣，導(dǎo)致宮頸癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移，并對(duì)治療產(chǎn)生不同的反應(yīng)。因此進(jìn)一步了解宮頸癌的發(fā)展機(jī)制能為早期診斷和晚期預(yù)后提供新的分子理論基礎(chǔ)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding，lncRNA)是一類非編碼RNA，含有200個(gè)核苷酸，翻譯潛力有限[2-3]，研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs參與細(xì)胞內(nèi)外的多種活動(dòng)，包括基因轉(zhuǎn)錄、mRNA剪接和腫瘤發(fā)生等[4-6]。HNF1A AS1是一種新鑒定的lncRNA，自鑒定以來(lái)，HNF1A AS1已被證明在人類腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用，如在口腔鱗癌和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，HNF1A AS1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)癌細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移，提示HNF1A AS1可能作為癌基因促進(jìn)癌癥發(fā)展[7-8]。然而，HNF1A AS1是否對(duì)宮頸癌細(xì)胞具有強(qiáng)大的促癌作用還沒(méi)有深入的研究。本研究擬探究HNF1A AS1在宮頸癌發(fā)展過(guò)程中的作用及機(jī)制，為治療宮頸癌患者提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人宮頸癌細(xì)胞C33A和人宮頸上皮永生化細(xì)胞株H8細(xì)胞來(lái)自上海生物細(xì)胞研究所；DMEM(Dulbecco's-modified Eagle's medium)培養(yǎng)基和胎牛血清來(lái)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒、點(diǎn)突變?cè)噭┖泻碗p熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、LipofectamineTM2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；鈣粘附蛋白E(epithelial-cadherin，E-cadherin)、鈣粘附蛋白N(N-cadherin)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)蛋白X(Bcl-2-Associated X，Bax)和GAPDH多克隆抗體購(gòu)于上海圣克魯斯生物科技有限公司；模擬物對(duì)照(mimics NC)、miR-320d 模擬物(miR-320d mimics)、抑制劑對(duì)照(inhibitor NC)、miR-320d抑制劑(miR-320d inhibitor)、干擾對(duì)照(siRNA NC)、HNF1A-AS1干擾(HNF1A-AS1 siRNA)、SOX4干擾(SOX4 siRNA)質(zhì)粒由廣州銳博生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)C33A細(xì)胞和H8細(xì)胞，于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿后，按1×105個(gè)/孔的密度鋪于12孔板中，待細(xì)胞匯合至75%～80%時(shí)，將各組重組質(zhì)粒、LipofectamineTM2000分別稀釋于無(wú)FBS培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染組分為：A:mimics NC組、miR-320d mimics組、inhibitor NC組、miR-320d inhibitor組;B:siRNA NC組、HNF1A-AS1 siRNA組、SOX4 siRNA組；C：siRNA NC+inhibitor NC組、HNF1A-AS1 siRNA+inhibitor NC組、miR-320d inhibitor+siRNA NC組、HNF1A-AS1 siRNA+miR-320d inhibitor組；D:HNF1A-AS1 wt +miR-320d組、HNF1A-AS1 wt +mimics control組、HNF1A-AS1 mut+miR-34a組、HNF1A-AS1 mut+mimics control組；E:SOX4 wt +miR-320d組、SOX4 wt +mimics control組、SOX4 mut+miR-34a組、SOX4 mut+mimics control組。于室溫孵育5 min，將稀釋后的重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體混勻，室溫孵育15 min，將混合物小心滴加到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞RNA樣和蛋白樣進(jìn)行生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞增殖測(cè)定 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)95%時(shí)，PBS清洗3次，用2.5 g/mL胰酶消化細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL的密度鋪于96孔板中，觀察細(xì)胞匯合達(dá)70%～80%時(shí)，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，每組重復(fù)6個(gè)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后棄上清，PBS清洗2次，每孔加入10 μL CCK-8工作液，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，在酶標(biāo)儀上讀取各孔在450 nm處的吸光值。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè) 采用miRanda和TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)HNF1A-AS1和miR-320d潛在靶基因，PCR擴(kuò)增HNF1A-AS1 3' UTR片段和SOX4 3' UTR片段，構(gòu)建HNF1A-AS1野生型(HNF1A-AS1 wt)和SOX4野生型(SOX4 wt)載體。再通過(guò)點(diǎn)突變?cè)噭┖袠?gòu)建HNF1A-AS1和SOX4突變重組質(zhì)粒。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染各組重組質(zhì)粒，采用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)C33A細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞的凋亡率 將各組重組質(zhì)粒使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至C33A細(xì)胞，胰酶消化后，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行中和，1 000 r/min離心10 min后棄上清，PBS清洗3次，沉淀置于70%的乙醇中，4°C固定過(guò)夜，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡水平，收集數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 收取轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞RNA樣，使用Trizol試劑在無(wú)RNA酶條件下從細(xì)胞中抽提總RNA，使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA，按照42℃，2 min；37℃ 15 min，85 ℃ 5 s的程序進(jìn)行反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。使用2-△△Ct法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并以U 6表達(dá)作為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)所用的引物見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western blot 收取轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞蛋白樣，使用RIPA充分裂解細(xì)胞，收集蛋白上清液，使用BCA試劑盒測(cè)定上清蛋白質(zhì)濃度，取適量樣品進(jìn)行點(diǎn)樣，并按照 80 V 35 min、115 V 2 h 的程序進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)將蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF 膜置于封閉液(50 g/L脫脂奶粉配制)中，在室溫?fù)u床封閉 2 h，封閉后的PVDF膜與一抗中在4℃過(guò)夜孵育，TBST清洗5次，每次5 min，一抗孵育結(jié)束后，將膜放在特異性二抗中，室溫?fù)u床孵育1.5 h，TBST清洗3次，每次10 min，清洗干凈后進(jìn)行目的蛋白曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)，至少取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-320d抑制C33A細(xì)胞增殖和EMT，促進(jìn)C33A細(xì)胞的凋亡

由圖1A可知，C33A細(xì)胞中miR-320d的表達(dá)量低于H8細(xì)胞(t=8.139，P=0.0148)。由圖1B可知，和mimics NC組相比，miR-320d mimics組的miR-320d表達(dá)量明顯升高(t=20.79，P=0.0023)。由圖1C MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，miR-320d mimics組的細(xì)胞增殖能力低于mimics NC組(t=6.081，P=0.0260)。由圖1D、1E可知，miR-320d mimics組的細(xì)胞凋亡率明顯高于mimics NC組(t=15.52，P=0.0041)。由圖1F～1I可知，和mimics NC組相比，miR-320d mimics組的Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(t=12.67，P=0.0062)，Bcl-2和N-cadherin蛋白表達(dá)量下降(t=6.281，P=0.0237)，以上結(jié)果表明miR-320d能夠抑制C33A細(xì)胞的增殖和EMT，促進(jìn)C33A細(xì)胞的凋亡。

A：RT-qPCR檢測(cè)miR-320d在C33A和H8細(xì)胞中的表達(dá)量；B：RT-qPCR檢測(cè)miR-320d的相對(duì)表達(dá)量；C：MTT檢測(cè)miR-320d對(duì)C33A細(xì)胞增殖的影響；D：流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-320d對(duì)C33A細(xì)胞凋亡的影響；E：C33A細(xì)胞凋亡率；F：Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)量；G：Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量；H：Western blot檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達(dá)量；I：E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量(*P<0.05;**P<0.01;n=3)(注：“n”是代表每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，下同)

2.2 HNF1A-AS1通過(guò)調(diào)控miR-320d表達(dá)促進(jìn)C33A細(xì)胞增殖和EMT，抑制細(xì)胞凋亡

miRanda預(yù)測(cè)HNF1A-AS1和miR-320d之間的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖2A。圖2B結(jié)果可知，當(dāng)質(zhì)粒攜帶HNF1A-AS1 3' UTR wt時(shí)，miR-320d的熒光素酶活性顯著降低(t=19.70，P=0.0026)；當(dāng)質(zhì)粒攜帶HNF1A-AS1 3' UTR mut時(shí)，miR-320d的熒光素酶活性無(wú)變化(P>0.05)。由圖2C可知，C33A細(xì)胞中HNF1A-AS1的表達(dá)量明顯高于H 8細(xì)胞(t=18.31，P=0.0030)；由圖2D～2E可知，與siRNA NC相比，HNF1A-AS1 siRNA組HNF1A-AS1的基因表達(dá)量下降(t=6.893，P=0.0204)，而miR-320d的基因表達(dá)量上升(t=8.839，P=0.0126)，說(shuō)明HNF1A-AS1和miR-320d之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。由圖2F～2J可知，和siRNA NC+inhibitor NC組相比，HNF1A-AS1 siRNA+inhibitor NC組細(xì)胞增殖能力下降(t=5.367，P=0.0330)，Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(t=24.31，P=0.0017 )，Bcl-2和N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(t=25.64，P=0.0015)，miR-320d inhibitor+siRNA NC組細(xì)胞增殖能力上升(t=5.518，P=0.0030)，Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(t=25.25，P=0.0016 )，Bcl-2和N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(t=25.25，P=0.0013)；與miR-320d inhibitor+siRNA NC組相比，HNF1A-AS1 siRNA+miR-320d inhibitor組細(xì)胞增殖能力下降(t=7.279，P=0.0184)，Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(t=18.11，P=0.0030)，Bcl-2和N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(t=23.71，P=0.0018)。以上結(jié)果說(shuō)明HNF1A-AS1通過(guò)調(diào)控miR-320d表達(dá)促進(jìn)C33A細(xì)胞增殖和EMT，抑制細(xì)胞凋亡。

A：miRanda預(yù)測(cè)NF1A-AS1和miR-320d之間的結(jié)合位點(diǎn)；B:熒光素酶表達(dá)量的測(cè)定；C：RT-qPCR檢測(cè)HNF1A-AS1在C33A和H8細(xì)胞中的表達(dá)量；D:RT-qPCR檢測(cè)HNF1A-AS1的表達(dá)量；E：RT-qPCR檢測(cè)miR-320d的表達(dá)量；F：MTT檢測(cè) HNF1A-AS1通過(guò)miR-320d對(duì)C33A細(xì)胞增殖的影響；G：Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)量；H：Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量；I：Western blot檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達(dá)量；J：E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量(*P<0.05;**P<0.01;n=3)

2.3 SOX4是miR-320d在C33A細(xì)胞中的下游靶點(diǎn)

預(yù)測(cè)miR-320d和SOX4之間的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖3A，由圖3B結(jié)果可知，當(dāng)質(zhì)粒攜帶SOX4 3' UTR wt時(shí)，miR-320d的熒光素酶活性顯著降低(t=12.62，P=0.0062)，當(dāng)質(zhì)粒攜帶SOX4 3' UTR mut時(shí)，miR-320d的熒光素酶活性無(wú)變化(t=3.280，P=0.0817 )。以上結(jié)果表明SOX4是miR-320d在C33A細(xì)胞中的下游靶點(diǎn)。

A：TargetScan預(yù)測(cè) miR-320d和SOX4之間的結(jié)合位點(diǎn)；B:熒光素酶表達(dá)量的測(cè)定；(*P<0.05;**P<0.01;n=3)

2.4 SOX4促進(jìn)C33A細(xì)胞增殖和EMT，抑制C33A細(xì)胞的凋亡

由圖4A可知，C33A細(xì)胞中SOX4的表達(dá)量明顯高于H8細(xì)胞(t=20.87，P=0.0023)。如圖4B顯示，和siRNA NC組相比，SOX4 siRNA的表達(dá)量明顯降低(t=18.48，P=0.0029)。由圖4C～4I結(jié)果可知，SOX4 siRNA組細(xì)胞的增殖能力低于siRNA NC組(t=8.728，P=0.0129)，凋亡率明顯高于siRNA NC組(t=13.10，P=0.0058)，Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(t=48.78，P=0.0004)，Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá)量下降(t=7.778，P=0.0161)，表明SOX4能夠促進(jìn)C33A細(xì)胞的增殖和EMT，抑制C33A細(xì)胞的凋亡。

A：RT-qPCR檢測(cè)SOX4在C33A和H8細(xì)胞中的表達(dá)量；B：RT-qPCR檢測(cè)敲低SOX4后細(xì)胞中的SOX4的表達(dá)量；C：MTT檢測(cè)SOX4對(duì)C33A細(xì)胞增殖的影響；D：流式細(xì)胞儀檢測(cè)SOX4對(duì)C33A細(xì)胞凋亡的影響；E：C33A細(xì)胞凋亡率；F：Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)量；G：Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量；H：Western blot檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達(dá)量；I：E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量(*P<0.05;**P<0.01;n=3)

2.5 HNF1A-AS1通過(guò)miR-320d調(diào)控SOX4的表達(dá)

由圖5A可知，和siRNA NC組相比，HNF1A-AS1 siRNA組的SOX4表達(dá)量降低(t=4.664，P=0.0430 )；和inhibitor NC組相比，miR-320d inhibitor組的SOX4表達(dá)量明顯升高(t=13.56，P=0.0054 )；由圖5B～5C可知，和siRNA NC+inhibitor NC組相比，HNF1A-AS1 siRNA+inhibitor NC組SOX4蛋白表達(dá)量降低(t=8.728，P=0.0129 )，miR-320d inhibitor+siRNA NC組SOX4蛋白表達(dá)量明顯上升(t=15.41，P=0.0042 )；和miR-320d inhibitor+siRNA NC組相比，HNF1A-AS1 siRNA+miR-320d inhibitor組SOX4蛋白表達(dá)量降低(t=5.692，P=0.0295 )。以上結(jié)果說(shuō)明HNF1A-AS1通過(guò)miR-320d調(diào)控SOX4的表達(dá)。

A：RT-qPCR檢測(cè)SOX4的表達(dá)量；B：Western blot檢測(cè)HNF1A-AS1通過(guò)miR-320d調(diào)控SOX4的表達(dá)；C：SOX4蛋白的相對(duì)表達(dá)量(*P<0.05;**P<0.01;n=3)

3 討論

最近越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miRNA的異常表達(dá)可能作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮重要的作用。大量研究報(bào)道了在宮頸癌中異常表達(dá)的miRNA，如在宮頸癌缺氧條件下，microRNA-519d-3p通過(guò)靶向HIF-2抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。miR-152在宮頸癌中具有抑癌功能，miR-152/KLF 5軸可能為宮頸癌治療提供新的治療靶點(diǎn)[10]。此外，miRNA-489能夠作為宮頸癌診斷和治療的生物標(biāo)志物[11]。miR-320d作為miR-320家族的重要成員，已有研究報(bào)道m(xù)iR-320d在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、結(jié)直腸腺瘤和B細(xì)胞淋巴瘤中的作用[12-13]。而在本研究中，我們探討了miR-320d在宮頸癌中的臨床意義，并研究了其在宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡和EMT中的作用。結(jié)果表明，miR-320d在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于正常細(xì)胞，過(guò)表達(dá)miR-320d能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、EMT和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，miR-320d可能在宮頸癌中發(fā)揮抑癌作用。

大量研究表明，lncRNA能夠作為宮頸癌的診斷和預(yù)后標(biāo)志物參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。例如，LncRNA MALAT-1在宮頸癌中過(guò)表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[14]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1的上調(diào)促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移[15]。HNF1A-AS1作為很重要的lncRNA首次在人原發(fā)性食管腺癌中發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)[16]。另外發(fā)現(xiàn)HNF1A-AS1在肺腺癌、肝細(xì)胞癌和骨肉瘤中也表達(dá)上調(diào)，能夠作為癌基因發(fā)揮作用[17-18]。本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-320d在HNF1A-AS1 3 UTR中的靶位點(diǎn)。此外，和正常細(xì)胞相比，宮頸癌細(xì)胞中HNF1A-AS1表達(dá)上調(diào)，敲低HNF1A-AS1增加了miR-320d的表達(dá)，抑制了宮頸癌細(xì)胞增殖的EMT，促進(jìn)了癌細(xì)胞的凋亡。表明HNF1A-AS1通過(guò)下調(diào)miR-320d在宮頸癌進(jìn)展中的表達(dá)，起到致癌基因的作用。SOX4是SOX家族中的一員，在調(diào)控癌癥發(fā)展方面起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)SOX4在各種癌癥中都有上調(diào)，如miR-129-2通過(guò)下調(diào)SOX4的表達(dá)來(lái)抑制食管癌細(xì)胞的增殖和遷移；miR-132通過(guò)靶向SOX4抑制肺癌細(xì)胞遷移和侵襲[19]；SOX4能夠誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展[20]。據(jù)報(bào)道，SOX4的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后受到miR-187、miR-204和miR-363等miRNA的調(diào)控，而在本研究中，SOX4被預(yù)測(cè)為miR-320d的下游靶點(diǎn)。SOX4在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，敲低SOX4能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和EMT，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。此外，本研究結(jié)果表明，宮頸癌細(xì)胞中SOX4的水平與HNF1A-AS1呈正相關(guān)，與miR-320d呈負(fù)相關(guān)，HNF1A-AS1能夠通過(guò)miR-320d調(diào)控SOX4的表達(dá)。

綜上所述，lncRNA HNF1A-AS1在宮頸癌中起促癌作用，并通過(guò)miR-320d/SOX4軸促進(jìn)宮頸癌的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明，HNF1A-AS1/miR-320d/SOX4軸可能是宮頸癌的一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)。