miR-573通過調(diào)控LAIR2對滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響

馬曉莉 張艷 王雪飛

胎盤正常發(fā)育在妊娠與胎兒發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，而胎盤中的主要細(xì)胞是滋養(yǎng)層細(xì)胞，滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移可造成胎盤缺血缺氧等從而引發(fā)子癇前期等妊娠疾病[1,2]。研究表明微小RNA(microRNA，miRNA)可影響滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移及侵襲能力[3]。但關(guān)于其具體作用機制尚未闡明。既往研究常采用HTR8/Svneo細(xì)胞等作為探究胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移及侵襲的重要細(xì)胞模型[4]。研究表明微小RNA-573(microRNA-573，miR-573)在肺癌、宮頸癌等腫瘤中表達(dá)量降低，上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲[5,6]。但miR-573對滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)行為的影響尚未可知。通過生物學(xué)分析顯示LAIR2可能是miR-573的靶基因，研究表明LAIR2在腎細(xì)胞癌細(xì)胞表達(dá)量升高，并可能參與腎細(xì)胞癌發(fā)生及發(fā)展過程[7]。但miR-573是否可通過調(diào)控LAIR2從而影響滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移及侵襲尚未可知。因此，本研究以HTR8/Svneo、JEG-3、BeWo、JAR細(xì)胞為研究模型，觀察miR-573、LAIR2的表達(dá)量及其對細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/Svneo、JEG-3、BeWo、JAR購自美國ATCC公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、MEMα培養(yǎng)基、F12K培養(yǎng)基、杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國HyClone公司；Lipofectamine2000與Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實時熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；miR-573寡核苷酸模擬物(miR-573 mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、LAIR2小干擾RNA(si-LAIR2)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-573特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-573)及其陰性對照(anti-miR-NC)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；pcDNA3.1購自武漢淼靈生物科技有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；兔抗人LAIR2抗體購自美國Abcam公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白1(CyclinD1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組:HTR8/Svneo細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，JEG-3、BeWo、JAR細(xì)胞來源于人絨毛膜癌細(xì)胞系，JEG-3細(xì)胞培養(yǎng)于MEMα培養(yǎng)基，BeWo細(xì)胞培養(yǎng)于F12K培養(yǎng)基，JAR細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2。取對數(shù)期JEG-3細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/ml，將細(xì)胞接種于96孔板(100 μl/孔)，分別將miR-NC、miR-573 mimics、si-NC、si-LAIR2、miR-573 mimics與pcDNA-NC、miR-573 mimics與pcDNA-LAIR2轉(zhuǎn)染至JEG-3細(xì)胞，分別記作miR-NC組、miR-573組、si-NC組、si-LAIR2組、miR-573+pcDNA-NC組、miR-573+pcDNA-LAIR2組。轉(zhuǎn)染過程參照Lipofectamine2000試劑說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染48 h后收集對數(shù)期細(xì)胞。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測細(xì)胞中miR-573、LAIR2 mRNA的表達(dá)水平:采用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μl/孔，正反向引物0.8 μl/孔，cDNA 1 μl/孔，ddH2O補足體系至20 μl；反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環(huán)40次。miR-573以U6為內(nèi)參，LAIR2以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-573、LAIR2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖:收集各組轉(zhuǎn)染后的JEG-3細(xì)胞，按照每孔5×104個細(xì)胞的密度接種于96孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h時，向每孔加入20 μl MTT溶液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，室溫避光孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(A值)，計算細(xì)胞存活率[(A 轉(zhuǎn)染組-A 空白對照組)/(A 陰性對照組-A空白對照組)×100%]，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移與侵襲:①細(xì)胞遷移實驗：收集各組轉(zhuǎn)染后的JEG-3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個/ml，按照每孔200 μl的密度接種于Transwell小室的上室，取600 μl含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入Transwell小室的下室，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。②細(xì)胞侵襲實驗：預(yù)冷培養(yǎng)基按照1∶8比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠，按照每孔40 μl的密度將稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室的上室，37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 h，后續(xù)實驗步驟同細(xì)胞遷移實驗，顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-573的靶基因:TargetScan預(yù)測顯示LAIR2的3’UTR區(qū)含有miR-573的結(jié)合位點，利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點進(jìn)行突變，分別將含有結(jié)合位點與突變位點的序列插入熒光素酶報告基因載體構(gòu)建野生型載體WT-LAIR2、突變型載體MUT-LAIR2，分別將miR-NC、miR-573 mimics與WT-LAIR2、MUT-LAIR2共轉(zhuǎn)染至JEG-3細(xì)胞，檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。分別將miR-NC、miR-573 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-573轉(zhuǎn)染至JEG-3細(xì)胞，蛋白免疫印跡法(western blot)檢測各組細(xì)胞中LAIR2蛋白水平。

1.2.6 Western blot檢測LAIR2、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá):收集HTR8/Svneo、JEG-3、BeWo、JAR細(xì)胞及各組對數(shù)期JEG-3細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白。根據(jù)BCA定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白樣品加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮10 min，蛋白變性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗稀釋液(1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶5 000)，室溫孵育1 h，滴加ECL顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-573和LAIR2在人滋養(yǎng)層細(xì)胞系中的表達(dá)情況 與HTR8/Svneo細(xì)胞比較，JEG-3、BeWo、JAR細(xì)胞中miR-573的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，LAIR2 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western Blot檢測LAIR2蛋白表達(dá)

表1 miR-573和LAIR2在人滋養(yǎng)層細(xì)胞系中的表達(dá)情況

2.2 過表達(dá)miR-573對JEG-3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-573組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 過表達(dá)miR-573對JEG-3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖2 Western Blot檢測CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)

2.3 敲減LAIR2對JEG-3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較，si-LAIR2組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見表3，圖3。

圖3 Western Blot檢測LAIR2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)

表3 敲減LAIR2對JEG-3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.4 miR-573靶向LAIR2 TargetScan預(yù)測顯示miR-573和LAIR2存在結(jié)合位點。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，miR-con或miR-573與野生型載體WT-LAIR2共轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞后，與miR-NC組比較，miR-573組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；miR-con或miR-573與突變型載體MUT-LAIR2共轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞后，miR-573組熒光素酶活性與miR-NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與miR-NC組比較，miR-573組細(xì)胞中LAIR2蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-573組細(xì)胞中LAIR2蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表4、5，圖4。

表4 miR-con或miR-573與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測

表5 Western Blot檢測LAIR2的表達(dá)

圖4 miR-573靶向調(diào)控LAIR2表達(dá)；A TargetScan對miR-573和LAIR2結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖;B Western Blot檢測LAIR2表達(dá)量

2.5 高表達(dá)LAIR2可以逆轉(zhuǎn)miR-573對JEG-3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-573+pcDNA-NC組比較，miR-573+pcDNA-LAIR2組細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖5，表6。

圖5 Western Blot檢測LAIR2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)

表6 高表達(dá)LAIR2可以部分逆轉(zhuǎn)miR-573對JEG-3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

3 討論

妊娠期間胎兒正常發(fā)育與胎盤功能密切相關(guān)，滋養(yǎng)層細(xì)胞分化及遷移可促進(jìn)胎盤發(fā)育，但滋養(yǎng)層細(xì)胞過度增殖、遷移及侵襲可促使婦產(chǎn)科疾病的發(fā)生，因而探究滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移及侵襲的分子機制對維持胎盤正常發(fā)育具有重要意義，研究表明miRNA在滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移及侵襲過程中發(fā)揮重要作用[8-10]。但仍有部分miRNA在滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移及侵襲過程中的調(diào)控機制尚未闡明。

miR-573可抑制前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[11]。miR-573表達(dá)量降低可促進(jìn)黑色素瘤、胃癌等腫瘤增殖及遷移[12,13]。本研究結(jié)果顯示人滋養(yǎng)層細(xì)胞系中miR-573的表達(dá)量顯著降低，提示miR-573表達(dá)量降低可能影響胎盤發(fā)育。本研究通過上調(diào)miR-573表達(dá)，結(jié)果顯示JEG-3細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力顯著降低，提示miR-573過表達(dá)可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。為探討miR-573調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的分子機制，本研究檢測miR-573過表達(dá)后細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-573過表達(dá)處理后細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著降低，已有報道指出CyclinD1可正向調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而滋養(yǎng)層細(xì)胞可通過分泌MMP-2、MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶從而加強細(xì)胞浸潤性[14,15]。提示miR-573過表達(dá)可能通過降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)從而抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中LAIR2的表達(dá)量升高并可促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲[16]。研究表明LAIR2表達(dá)量升高與人絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞的高度侵襲性密切相關(guān)[17,18]。與上述研究結(jié)果顯示LAIR2在滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)量升高，通過敲減LAIR2可減弱滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，并可抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)。提示抑制LAIR2表達(dá)可降低滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。本研究通過雙熒光素酶報告實驗與Western blot實驗證實miR-573能夠靶向結(jié)合LAIR2，并可負(fù)向調(diào)控LAIR2的表達(dá)。為探究miR-573是否可通過調(diào)控LAIR2表達(dá)從而影響滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，本研究通過上調(diào)LAIR2表達(dá)聯(lián)合miR-573過表達(dá)處理滋養(yǎng)層細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力顯著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著升高，提示miR-573過表達(dá)可能通過靶向調(diào)控LAIR2表達(dá)從而抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移及侵襲進(jìn)而維持胎盤正常發(fā)育。

綜上所述，滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-573表達(dá)量降低，miR-573過表達(dá)可靶向抑制LAIR2表達(dá)從而抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，其作用機制可能與降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)，可為進(jìn)一步揭示滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的分子機制奠定理論基礎(chǔ)。