王丹妮，宋美卿，楊 鈐，馮瑪莉

（山西省中醫(yī)藥研究院中心實(shí)驗(yàn)室，太原 030012）

松果體是機(jī)體調(diào)控生物鐘節(jié)律的重要組成部分，是維持內(nèi)源性生物鐘運(yùn)作的核心元件[1-2]。松果體合成分泌的褪黑素（melatonin，MT）具有促進(jìn)睡眠、調(diào)節(jié)時(shí)差、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫和抗腫瘤等多種作用，因其可促進(jìn)睡眠，被稱(chēng)為“生理性催眠劑”[3-5]。隨著年齡增長(zhǎng)，松果體細(xì)胞會(huì)變大，有空泡改變，合成分泌褪黑素的能力下降，其調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律作用減退[6]。目前，松果體損傷動(dòng)物模型有：通過(guò)分離左頸總動(dòng)脈且永久性結(jié)扎，使新生大鼠出現(xiàn)缺氧缺血性腦病，研究松果體對(duì)機(jī)體晝夜節(jié)律的影響[7]，該手術(shù)操作復(fù)雜，成功率低；D-半乳糖致衰老大鼠松果體過(guò)氧化損傷模型，造模時(shí)間長(zhǎng)[8]；對(duì)氯苯丙氨酸（para-chlorophenylalanine，PCPA）腹腔注射是目前公認(rèn)的經(jīng)典失眠動(dòng)物模型，PCPA通過(guò)抑制色氨酸氨化酶合成，減少5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的生成，使睡眠-覺(jué)醒周期紊亂，該操作較簡(jiǎn)單，具有良好的可重復(fù)性[9]；電刺激應(yīng)激模型可使晝夜節(jié)律紊亂，且操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性強(qiáng)[10]。本課題組在制備PCPA致失眠大鼠模型和電刺激致睡眠-覺(jué)醒周期紊亂時(shí)發(fā)現(xiàn)兩者均對(duì)松果體有影響，為尋找方法簡(jiǎn)便、造模時(shí)間短的松果體損傷模型，開(kāi)展了以下實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠40 只，體質(zhì)量160～180g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]。動(dòng)物飼養(yǎng)于山西省中醫(yī)藥研究院中心實(shí)驗(yàn)室（符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通用要求，可開(kāi)展SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)），溫度：20～23℃，濕度：40%～50%。實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（SZYLY2020KY-0401），實(shí)驗(yàn)中涉及處理動(dòng)物的操作均符合國(guó)家相關(guān)法規(guī)要求。

1.2 主要儀器與試劑

穿梭視屏分析系統(tǒng)（DB079）購(gòu)自北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司；大鼠小鼠曠場(chǎng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（OFT-100）購(gòu)自成都泰盟科技有限公司；全自動(dòng)全封閉脫水機(jī)（Excelsior）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；石蠟包埋機(jī)（TKY-BMB）購(gòu)自湖北康泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；萬(wàn)能顯微鏡熒光成像系統(tǒng)（BX51+DPT2+IPE）購(gòu)自日本Olympus 公司；多功能微孔讀板機(jī)（H1）購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；PCPA（批號(hào)：1002600696）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；戊巴比妥鈉（批號(hào)：57-33-0）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；無(wú)水碳酸鈉（批號(hào)：931103）和碳酸氫鈉（批號(hào)：20070713）均為北京化工廠產(chǎn)品。MT檢測(cè)用ELISA試劑盒（批號(hào)：EME174）購(gòu)自德國(guó)IBL公司。

1.3 模型制備

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、PCPA組、電刺激組和PCPA聯(lián)合電刺激組，每組10只。空白對(duì)照組不予任何操作，其余各組采用以下不同造模方法。PCPA組：在實(shí)驗(yàn)第4天開(kāi)始腹腔注射PCPA混懸液（分別稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉及碳酸氫鈉3.392 g、1.512 g，分別加蒸餾水320 mL、180 mL，攪拌均勻，混合，檢測(cè)pH為10.1，將PCPA溶于碳酸鹽緩沖液，配制為45 g/L的混懸液，80 ℃加熱30 min，超聲5 min，現(xiàn)用現(xiàn)配），腹腔注射10 mL/kg，連續(xù)2 d。電刺激組：實(shí)驗(yàn)第1天將大鼠置于穿梭箱并給予電刺激，電刺激方法為電壓30 V、電流0.8A、刺激時(shí)間30 s、間隔時(shí)間30 s、循環(huán)60次，同一時(shí)間連續(xù)電刺激5 d。PCPA聯(lián)合電刺激組：電刺激方法同電刺激組，電刺激第4天加用PCPA，方法同PCPA組。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 曠場(chǎng)活動(dòng)測(cè)試

曠場(chǎng)為100 cm×100 cm×50 cm的開(kāi)口箱，將大鼠置于曠場(chǎng)中適應(yīng)3 min，接著記錄5 min活動(dòng)軌跡，以檢測(cè)其曠場(chǎng)活動(dòng)。使用視頻軟件分析系統(tǒng)，將其底部劃分為3×3格子并記錄其活動(dòng)軌跡。檢測(cè)大鼠活動(dòng)總路程、平均速度及中央?yún)^(qū)停留時(shí)間。每次更換動(dòng)物之前，用75%乙醇溶液擦拭曠場(chǎng)及檢測(cè)儀器，以免上次動(dòng)物殘留信息影響下次測(cè)試結(jié)果。

1.4.2 高架十字迷宮測(cè)試

分別將大鼠置于高架十字迷宮同一處（作為起始位置），視頻分析觀察其3min內(nèi)活動(dòng)軌跡。每次測(cè)試結(jié)束后，噴灑75%乙醇溶液，清潔大鼠活動(dòng)區(qū)域以祛除殘留氣味，避免干擾下一只動(dòng)物的測(cè)試結(jié)果。

進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)（open arm entry，OE）：大鼠四足均在開(kāi)放臂內(nèi)至任一足從該臂中完全退出的次數(shù)總和。進(jìn)入封閉臂次數(shù)：大鼠四足均在封閉臂內(nèi)至任一足從該臂中完全退出的次數(shù)總和。進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)百分比（OE%）：OE%=進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)/（進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)+進(jìn)入封閉臂次數(shù)）×100%。進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間（open arm time，OT）：大鼠四足均在開(kāi)放臂中至任一足從該臂中完全退出的時(shí)間。進(jìn)入封閉臂時(shí)間：大鼠四足均在封閉臂中至任一足從該臂中完全退出的時(shí)間。進(jìn)入開(kāi)放臂時(shí)間百分比（OT%）：OT%=開(kāi)放臂停留時(shí)間/（開(kāi)放臂停留時(shí)間+封閉臂停留時(shí)間）×100%。

1.4.3 戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)

腹腔注射戊巴比妥鈉38 mg/kg，睡眠以翻正反射消失為指標(biāo)，以大鼠背向下姿勢(shì)保持30 s以上者，判斷為翻正反射消失。記錄注射戊巴比妥鈉后至大鼠翻正反射消失時(shí)間，作為入睡潛伏期；并觀察記錄翻正反射消失至覺(jué)醒的時(shí)間，作為睡眠持續(xù)時(shí)間。

1.4.4 血清MT檢測(cè)

各組大鼠于第6天上午10∶00腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心3 000 r/min，20 min，取上層血清。采用ELISA雙抗夾心法檢測(cè)血清MT，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.5 松果體病理組織學(xué)觀察

取血后，大鼠沿枕骨大孔開(kāi)顱，將大腦人字縫上部充分暴露，見(jiàn)米粒大小松果體。完整取出松果體后，脫頸椎處死大鼠。將剖取的松果體置于體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液中固定，然后行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，最后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

空白對(duì)照組大鼠晝夜節(jié)律及行為活動(dòng)正常，被毛柔順；PCPA組大鼠白天夜晚活動(dòng)不停，易驚嚇，互相打斗，被毛戰(zhàn)栗；電刺激組大鼠白天夜晚活動(dòng)不停，被毛戰(zhàn)栗，頭部震顫，放置穿梭箱時(shí)有對(duì)抗行為，對(duì)穿梭箱有抵抗；PCPA聯(lián)合電刺激大鼠白天夜晚活動(dòng)不停，被毛戰(zhàn)栗，易驚嚇，互相打斗，頭部震顫，對(duì)穿梭箱有抵抗。

2.2 曠場(chǎng)活動(dòng)

PCPA組、電刺激組和PCPA聯(lián)合電刺激組大鼠曠場(chǎng)活動(dòng)總距離和平均速度均顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01）；PCPA組、PCPA聯(lián)合電刺激組曠場(chǎng)活動(dòng)中央?yún)^(qū)時(shí)間均顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）（表1）。

表 1 各組大鼠曠場(chǎng)活動(dòng)比較Table 1 Comparison of open field activities in each group of rats( ± s, n=10)

表 1 各組大鼠曠場(chǎng)活動(dòng)比較Table 1 Comparison of open field activities in each group of rats( ± s, n=10)

注：PCPA為對(duì)氯苯丙氨酸。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組 別 總距離/cm 平均速度/(cm·s-1) 中央?yún)^(qū)時(shí)間/s空白對(duì)照PCPA電刺激PCPA聯(lián)合電刺激1 711±271 1 007±207** 772±294** 983±159**11.82±1.35 8.71±1.08** 7.57±1.86** 8.52±0.99**1.98±1.30 6.97±5.76*1.62±2.02 7.25±5.49*

2.3 高架十字迷宮

PCPA聯(lián)合電刺激組大鼠的OE%顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）；PCPA組、PCPA聯(lián)合電刺激組的OT%均顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）（表2）。

表 2 各組大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)比較Table 2 Comparison of elevated cross-maze experiments in each group of rats( ± s, n=10)

表 2 各組大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)比較Table 2 Comparison of elevated cross-maze experiments in each group of rats( ± s, n=10)

注：PCPA為對(duì)氯苯丙氨酸，OE%為進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)百分比，OT%為進(jìn)入封閉臂次數(shù)百分比。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05。

組 別 OE% OT%空白對(duì)照PCPA電刺激PCPA聯(lián)合電刺激34.2±23.6 52.1±18.0 48.8±30.6 65.6±31.6*25.4±7.7 48.9±24.1*41.5±39.2 63.9±30.3*

2.4 戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠

PCPA組大鼠入睡潛伏期顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），而電刺激組及PCPA聯(lián)合電刺激組與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）；睡眠持續(xù)時(shí)間在各組間無(wú)明顯差異（P＞0.05，表3）。

2.5 血清MT

PCPA組、電刺激組、PCPA聯(lián)合電刺激組大鼠血清MT水平均顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01）（表4）。

表 3 各組大鼠戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠結(jié)果Table 3 Synergistic sleep results of pentobarbital sodium administration in each group of rats( ± s, n=10)

表 3 各組大鼠戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠結(jié)果Table 3 Synergistic sleep results of pentobarbital sodium administration in each group of rats( ± s, n=10)

注：PCPA為對(duì)氯苯丙氨酸。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05。

?

表 4 各組大鼠血清MT比較Table 4 Comparison of serum MT levels in each group of rats( ± s, n=10)

表 4 各組大鼠血清MT比較Table 4 Comparison of serum MT levels in each group of rats( ± s, n=10)

注：PCPA為對(duì)氯苯丙氨酸，MT為褪黑素。與空白對(duì)照組比較，**P<0.01。

?

2.6 松果體病理組織學(xué)變化

松果體組織中有松果體細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，前者占絕大多數(shù)?？瞻讓?duì)照組松果體細(xì)胞和梭形膠質(zhì)細(xì)胞排列緊密，均勻分布，清晰可見(jiàn)（圖1A）；PCPA組松果體細(xì)胞排列紊亂，數(shù)目明顯減少，空泡變性增多，細(xì)胞核固縮且向周邊移動(dòng)，細(xì)胞界限模糊（圖1B）；電刺激組松果體排列紊亂，細(xì)胞數(shù)目稍減少，空泡變性稍增多，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞核向周?chē)苿?dòng)，細(xì)胞界限模糊（圖1C）；PCPA聯(lián)合電刺激組松果體細(xì)胞排列紊亂，數(shù)目明顯減少，空泡變性增多，細(xì)胞核固縮且向周邊移動(dòng)，細(xì)胞界限模糊（圖1D）。

圖 1 各組大鼠松果體病理組織學(xué)變化（HE染色，×100）Figure 1 Histopathological changes of the pineal gland in each group of rats (HE staining, ×100)

3 討論

由于大鼠難以用人類(lèi)所能理解的語(yǔ)言表達(dá)，其行為通常以行為實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)。行為體現(xiàn)了機(jī)體適應(yīng)新環(huán)境的一系列反應(yīng)，也體現(xiàn)了機(jī)體心理活動(dòng)過(guò)程。心理活動(dòng)在人、動(dòng)物均有體現(xiàn)，負(fù)面心理活動(dòng)主要包括抑郁、焦慮、恐懼這3類(lèi)[11]。松果體調(diào)控動(dòng)物的晝夜節(jié)律生物鐘，也可能參與調(diào)控機(jī)體情緒。建立松果體損傷模型后，可以通過(guò)曠場(chǎng)、高架十字迷宮檢測(cè)其行為改變。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)反映動(dòng)物緊張、興奮、探索再到適應(yīng)的一系列過(guò)程，興奮性的大鼠在適應(yīng)的環(huán)境中表現(xiàn)為行動(dòng)活躍，四處走動(dòng)[12]。本研究中，PCPA組、電刺激組、PCPA聯(lián)合電刺激組大鼠興奮性有下降趨勢(shì)。高架十字迷宮是大鼠由于好奇心探索新環(huán)境（開(kāi)放臂），同時(shí)有嗜暗的天性（封閉臂），兩者之間發(fā)生“探究-回避”相沖突的行為，產(chǎn)生焦慮心理[13]。本研究中，PCPA組、電刺激組、PCPA聯(lián)合電刺激組大鼠均未表現(xiàn)出焦慮。

松果體作為調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的器官，其結(jié)構(gòu)功能的完整性具有重要意義。松果體組織病理學(xué)結(jié)果表明，3種造模方法均造成大鼠松果體細(xì)胞不同程度濃縮、空泡變性、核固縮、向周邊移動(dòng)，表明細(xì)胞出現(xiàn)變性、凋亡和不同程度的壞死損傷，其中PCPA聯(lián)合電刺激最嚴(yán)重，PCPA次之，電刺激細(xì)胞損傷程度較輕。松果體細(xì)胞合成分泌MT，合成后并不儲(chǔ)存于松果體細(xì)胞中，而是被迅速地分泌到周?chē)褐?。因此，血液中的MT水平可以準(zhǔn)確反映松果體合成分泌MT的能力[14]。松果體細(xì)胞受損，血清中MT含量減少，入睡潛伏期增加。

綜上所述，大鼠腹腔注射PCPA、電刺激及PCPA聯(lián)合電刺激，這3種方法均可造成大鼠不同程度的松果體損傷，可作為松果體損傷相關(guān)疾病研究時(shí)動(dòng)物模型的建立方法，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。