曲冠頤,唐潔,姜健,楊強(qiáng),劉源才,吳群*,陳申習(xí)*,徐巖

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 3(釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室,江蘇 無錫,214122) 4(勁牌有限公司,湖北 大冶,435100) 5(勁牌有限公司 勁牌研究院,湖北 大冶,435100)

高級(jí)醇是3個(gè)及3個(gè)C以上一元醇的總稱,是小曲清香型白酒重要的風(fēng)味物質(zhì)之一,對(duì)酒的品質(zhì)有很大的影響,但高級(jí)醇含量過高會(huì)引起白酒沖辣以及消費(fèi)者頭痛,對(duì)白酒品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[1-2]。針對(duì)小曲清香型白酒中高級(jí)醇含量過高的問題,目前主要采用基因工程的手段,改造Saccharomycescerevisiae獲得低產(chǎn)高級(jí)醇的酵母[3],或高產(chǎn)酯類酵母將體系中的高級(jí)醇轉(zhuǎn)化為酯類物質(zhì)[4]。但這種單菌改造的方法對(duì)于自然發(fā)酵、互作復(fù)雜的白酒而言作用極為有限,并且工程菌在食品中應(yīng)用的安全性仍存爭(zhēng)議。因此,對(duì)于自然接種發(fā)酵的白酒釀造體系,有必要揭示微生物菌群發(fā)酵及高級(jí)醇的代謝特征,為生產(chǎn)控制高級(jí)醇提供理論基礎(chǔ)。

本研究以春秋兩季小曲清香型白酒發(fā)酵過程為研究對(duì)象,重點(diǎn)分析了2種含量較高的高級(jí)醇(異丁醇、異戊醇)的差異及變化規(guī)律。通過高通量擴(kuò)增子測(cè)序揭示發(fā)酵過程中微生物的群落結(jié)構(gòu)及變化規(guī)律。由隨機(jī)森林算法判定春秋季發(fā)酵的差異微生物,相關(guān)性分析算法判定發(fā)酵過程中與高級(jí)醇產(chǎn)生相關(guān)的微生物。通過固態(tài)模擬發(fā)酵驗(yàn)證了微生物菌群互作對(duì)高級(jí)醇合成代謝的調(diào)控作用,這對(duì)白酒以及其他食品發(fā)酵的定向調(diào)控具有一定的理論意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

本研究所用酒醅樣本均來源于小曲清香型白酒廠勁牌公司的手工生產(chǎn)車間,于2018年春季(5月)、秋季(10月)取樣。發(fā)酵周期為7 d,酒醅分別取入池發(fā)酵0、1、2、3、5、7 d的樣本。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本取3個(gè)平行窖池,用于高通量測(cè)序的樣品于-80 ℃保存,用于微生物篩選的樣品于4 ℃保存。

1.1.2 菌株及活化

本研究使用菌株：短乳桿菌(LactobacillusbrevisJN-JB-2)、釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeJN-JY-1)、庫德里阿茲威氏畢赤酵母(PichiakudriavzeviiJN-JY-2),均來源于酒醅。乳酸菌使用MRS培養(yǎng)基活化,37 ℃靜置培養(yǎng)3 d；酵母使用YPD培養(yǎng)基活化,30 ℃,200 r/min搖床培養(yǎng)2 d。

1.1.3 主要試劑及儀器

2×SG Fast qPCR Master Mix,生工生物工程股份有限公司；L-薄荷醇,北京百靈威科技有限公司；異丁醇、異戊醇,西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

高速離心機(jī)(Eppendorf centrifuge 5804R),艾本德國際貿(mào)易有限公司；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems StepOnePlus),愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易有限公司；氣相色譜-氫離子火焰檢測(cè)器(Agilent 7890 GC-FID),安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取方法

樣本前處理及基因組DNA提取方法參照文獻(xiàn)[5]：利用無菌0.1 mol/L PBS緩沖液與無菌玻璃珠洗滌樣本并收集細(xì)胞。用酚-氯仿法抽提宏基因組,真空干燥處理后,加入40 μL無菌ddH2O溶解DNA,作為高通量測(cè)序及qPCR定量的模板。

1.2.2 高通量擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果的處理

高通量擴(kuò)增子測(cè)序：通過擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)分析發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)。對(duì)于真菌,選用ITS3/ITS4引物對(duì)ITS2區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增[6];對(duì)于細(xì)菌,選用338 F/806 R對(duì)16S rRNA的V3-V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增[7]。用PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物并測(cè)定濃度。使用MiSeq臺(tái)式測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序[8],用于2×300 bp配對(duì)末端測(cè)序。

序列處理：通過QIIME處理所有從MiSeq生成的原始序列。經(jīng)質(zhì)量控制,去除不合要求的序列[9],通過UCLUST將修整后的序列以97%的相似性聚類為OUT(operational taxonomic unit)[10]。

1.2.3 生物量的測(cè)定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技術(shù)定量樣品中總細(xì)菌和總真菌的生物量。反應(yīng)體系：10 μL 2×SG Fast qPCR Master Mix(High Rox),上、下游引物各0.4 μL(20 μmol/L),1 μL DNA模板(10～50 ng/μL),用ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。引物、擴(kuò)增條件和標(biāo)曲構(gòu)建條件如文獻(xiàn)報(bào)道[11]。

1.2.4 高級(jí)醇檢測(cè)方法

浸提液制備：稱取10.0 g酒醅并加入25 mL超純水,混勻后于4 ℃過夜浸提。浸提后的樣本冰浴超聲30 min,在8 000×g條件下離心5 min,吸取上清液,即為樣本浸提液。

液液微萃取[12]：取1 mL浸提液,加入1 mL乙酸乙酯、10 μL 10.10 g/LL-薄荷醇內(nèi)標(biāo)化合物、0.4 g NaCl,充分混勻,收集上清液,用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾備用。

色譜分析：氣相色譜火焰離子化檢測(cè)器(GC-FID)測(cè)定高級(jí)醇含量,色譜柱為CP-Wax(30 m×0.25 mm,0.25 μm),進(jìn)樣口、檢測(cè)器溫度均為250 ℃,分流比為5∶1。升溫程序參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行設(shè)置。

1.2.5 固態(tài)模擬發(fā)酵

參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行糖化,至糖含量為50 g/kg[14]。依照小曲清香型白酒的釀造工藝,如表1所示的接種量接入微生物,拌2倍質(zhì)量的酒糟,裝入燒杯,嚴(yán)格密封,20 ℃靜置發(fā)酵。

表1 固態(tài)模擬發(fā)酵初始接種量Table 1 The inoculation conditions of simulated solid state fermentation

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

主成分分析：為揭示不同季節(jié)小曲清香型白酒發(fā)酵過程中微生物群落的演替軌跡,通過SPSS 22.0對(duì)微生物屬的相對(duì)豐度進(jìn)行主成分分析。

隨機(jī)森林算法：利用R程序的Random forest包進(jìn)行計(jì)算,以平均下降精度(Mean decrease accuracy)表示變量的差異程度[15]。

相關(guān)性分析：為解析調(diào)控高級(jí)醇產(chǎn)生的關(guān)鍵微生物,計(jì)算小曲清香型白酒發(fā)酵過程微生物屬水平的相對(duì)豐度與異丁醇、異戊醇含量的Pearson相關(guān)系數(shù)(ρ),選取|ρ|>0.6且P<0.05的數(shù)據(jù)作為有效網(wǎng)絡(luò)連接[16],通過Gephi進(jìn)行可視化。微生物屬要求至少在一個(gè)平行樣品中相對(duì)豐度≥1.0%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)小曲清香型白酒高級(jí)醇的變化規(guī)律

對(duì)不同季節(jié)發(fā)酵過程中高級(jí)醇含量進(jìn)行比較分析,春、秋兩季發(fā)酵過程中異丁醇和異戊醇的變化規(guī)律如圖1所示。發(fā)酵終點(diǎn)春季樣本的異丁醇、異戊醇含量分別為(54.78±13.54)和(124.66±21.04) mg/kg,高級(jí)醇總量(179.43±9.57) mg/kg；而秋季分別可達(dá)(88.86±15.43)和(188.00±17.40) mg/kg,總量達(dá)(276.86±26.80) mg/kg。秋季樣本的高級(jí)醇含量顯著高于春季。

a-異丁醇；b-異戊醇圖1 春秋季樣本中高級(jí)醇代謝規(guī)律Fig.1 Mechanisms of higher alcohols synthesized in fermented grains of spring and autumn 注：實(shí)線表示高級(jí)醇含量,虛線表示代謝速率

春季樣本異丁醇、異戊醇的最大產(chǎn)生速率分別為19.76和43.92 mg/(kg·d),秋季樣本分別為31.27和62.78 mg/(kg·d)；秋季異丁醇、異戊醇的最大產(chǎn)生速率分別為春季的1.58和1.43倍。不同季節(jié)發(fā)酵過程中2種高級(jí)醇代謝均可分為2個(gè)階段：(1)發(fā)酵前期(0～3 d),高級(jí)醇快速累積,說明該階段微生物代謝合成高級(jí)醇最為迅速；(2)發(fā)酵中后期(3～7 d),2種高級(jí)醇含量變化緩慢甚至趨于穩(wěn)定。高級(jí)醇的產(chǎn)量與最大產(chǎn)生速率在不同季節(jié)均有較大的差異。

2.2 不同季節(jié)小曲清香型白酒高級(jí)醇的變化規(guī)律

2.2.1 菌群差異是高級(jí)醇差異的潛在影響因素

通過Illumina Miseq測(cè)序揭示發(fā)酵過程中的微生物群落的組成。對(duì)于細(xì)菌,質(zhì)控后共得到1 293 003條高質(zhì)量的序列,平均每個(gè)樣本具有(35 917±11 946)條；共得到5 428個(gè)OTU,平均每個(gè)樣品得到(150±36)個(gè)OTU。對(duì)于真菌,質(zhì)控后共得到1 944 028條高質(zhì)量的序列,平均每個(gè)樣本具有(54 001±21 014)條；并得到2 150個(gè)OTU,平均每個(gè)樣品得到(60±14)個(gè)OTU。每個(gè)樣品的覆蓋率均在99%以上,表明測(cè)序深度足夠和數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

發(fā)酵過程中的高級(jí)醇由微生物代謝產(chǎn)生,因此進(jìn)一步分析了不同季節(jié)發(fā)酵過程中微生物的演替情況。如圖2所示,由主成分分析比較2個(gè)季節(jié)釀造微生物的差異,發(fā)現(xiàn)春秋季發(fā)酵微生物的組成從發(fā)酵起始點(diǎn)開始已具有差異；同時(shí),兩季樣本中釀造微生物的演替方向差異顯著,真菌和細(xì)菌在秋季發(fā)酵過程都比春季演替更劇烈。

a-真菌；b-細(xì)菌圖2 春秋季發(fā)酵過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)主成分分析Fig.2 Principal components analysis of the microbiota structure注：綠色與橙色實(shí)心點(diǎn)分別表示不同取樣時(shí)間點(diǎn)春秋季的樣本

2.2.2 微生物群落演替規(guī)律分析

將平均相對(duì)豐度>1%的屬定義為優(yōu)勢(shì)微生物,平均相對(duì)豐度>10%的屬定義為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)微生物[17]。微生物群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律如圖3所示。由測(cè)序結(jié)果分析得到優(yōu)勢(shì)微生物中真菌屬有11個(gè),細(xì)菌屬有14個(gè),并通過絕對(duì)定量方法測(cè)定了細(xì)菌、真菌的總量。發(fā)酵過程中,兩季真菌的絕對(duì)豐度均呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì),其中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌屬為Saccharomyces、Pichia和Rhizopus。在高級(jí)醇快速增加的發(fā)酵前期(0～3 d),春季樣本優(yōu)勢(shì)屬的豐度變化平緩。秋季發(fā)酵前期Rhizopus迅速降低；Saccharomyces豐度迅速升至峰值；Pichia的豐度變化幅度也較大。因?yàn)镾accharomyces是產(chǎn)高級(jí)醇的主要微生物[13],Saccharomyces隨時(shí)間的變化規(guī)律如圖3-c所示,秋季樣本發(fā)酵前期Saccharomyces的快速增殖和較高豐度可能是秋季樣本中高級(jí)醇含量較高的原因之一。

a-春秋季真菌；b-春秋季細(xì)菌；c-春秋季Saccharomyces生物量的動(dòng)態(tài)變化圖3 春秋季發(fā)酵過程群落結(jié)構(gòu)(屬水平)分析Fig.3 The microbial community structure(genera) during fermentation in spring and autumn注：平均相對(duì)豐度<1%的屬被合并劃分為“other”

發(fā)酵過程中,細(xì)菌絕對(duì)豐度整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Weissella和Lactobacillus。春季樣本中,發(fā)酵前期Lactobacillus相對(duì)豐度較高,5 d達(dá)到峰值；而秋季樣品發(fā)酵前期Weissella相對(duì)豐度較高,Gluconobacter、Leuconostoc等其他細(xì)菌的豐度同樣較高,Lactobacillus在發(fā)酵前期豐度較低,變化緩慢,直到發(fā)酵7 d才達(dá)到峰值。Lactobacillus是釀造系統(tǒng)中重要的功能微生物,與春季樣本相比,秋季樣品中Lactobacillus的相對(duì)豐度偏低,且到達(dá)峰值的時(shí)間較晚,這可能是秋季樣本高級(jí)醇含量高的原因之一,Lactobacillus可能對(duì)于抑制高級(jí)醇的產(chǎn)生有一定的作用。

2.2.3 關(guān)鍵差異微生物引起高級(jí)醇的差異

采用隨機(jī)森林的算法,對(duì)發(fā)酵過程群落中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)屬進(jìn)行差異分析。如圖4-a所示,微生物對(duì)群落差異的貢獻(xiàn)程度由平均下降精度表示,Lactobacillus、Weissella、Rhizopus、Saccharomyces、Pichia屬是春秋季樣本中的顯著差異微生物。

a-隨機(jī)森林計(jì)算絕對(duì)優(yōu)勢(shì)微生物在兩季樣本中的平均下降精度；b-相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析與高級(jí)醇合成顯著相關(guān)的微生物圖4 關(guān)鍵差異微生物的判定Fig.4 Identification of key differential microorganisms注：圖4-b中綠色、橙色和藍(lán)色的節(jié)點(diǎn)分別表示真菌、細(xì)菌和高級(jí)醇,數(shù)字(ρ值)及連線粗細(xì)表示相關(guān)性大小,橙色的連線表示正相關(guān)關(guān)系,灰色的連線表示負(fù)相關(guān)關(guān)系;*,P<0.05;**,P<0.01

春秋樣本差異微生物中,由相關(guān)性分析解析調(diào)控高級(jí)醇產(chǎn)生的潛在關(guān)鍵微生物。有效網(wǎng)絡(luò)連接(|ρ|>0.6,P<0.05)如圖4-b所示,在小曲清香型白酒發(fā)酵過程中,與異丁醇、異戊醇顯著相關(guān)的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)屬共有3個(gè),其中Saccharomyces與2種高級(jí)醇產(chǎn)量成正相關(guān)關(guān)系,Pichia和Lactobacillus均與2種高級(jí)醇產(chǎn)量成負(fù)相關(guān)關(guān)系,說明Pichia和Lactobacillus可能對(duì)于高級(jí)醇的降低有所貢獻(xiàn)。

2.3 微生物相互作用對(duì)高級(jí)醇產(chǎn)生的影響

利用模擬小曲清香型白酒釀造工藝的固態(tài)發(fā)酵分析Saccharomyces、Pichia與Lactobacillus相互作用對(duì)高級(jí)醇的調(diào)控作用。選擇3個(gè)屬中相對(duì)豐度最高的種,分別對(duì)S.cerevisiaeJN-JY-1、P.kudriavzeviiJN-JY-2、L.brevisJN-JB-2進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,并檢測(cè)高級(jí)醇含量,如圖5-a所示,P.kudriavzevii與L.brevis單培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)高級(jí)醇的能力均較低(<3 mg/kg)。如圖5-b所示,異丁醇、異戊醇在只接種S.cerevisiae的對(duì)照組產(chǎn)量均為最高,總高級(jí)醇產(chǎn)量可達(dá)(43.52±2.43) mg/kg；成對(duì)共培養(yǎng)的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組高級(jí)醇產(chǎn)量有一定程度下降；而接種S.cerevisiae、P.kudriavzevii、L.brevis的實(shí)驗(yàn)組總高級(jí)醇產(chǎn)量最低,只有(35.0±1.64) mg/kg,比S.cerevisiae單菌發(fā)酵組降低了8.49 mg/kg(P=0.02)說明3株菌在高級(jí)醇的調(diào)控上存在著密切的相互作用關(guān)系,P.kudriavzevii與L.brevis的添加對(duì)于高級(jí)醇的調(diào)控有一定的貢獻(xiàn)。

a-P.kudriavzevii與L.brevis單培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)高級(jí)醇的產(chǎn)量；b-高級(jí)醇相關(guān)微生物屬固態(tài)模擬共培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)高級(jí)醇的產(chǎn)量圖5 固態(tài)模擬發(fā)酵高級(jí)醇的產(chǎn)量Fig.5 The yield of higher alcohols in simulated solid fermentation注：不同字母表示差異顯著性

3 結(jié)論與討論

近年來,對(duì)于發(fā)酵食品風(fēng)味或功能性代謝產(chǎn)物調(diào)控的研究越來越多,同時(shí)測(cè)序技術(shù)及分析手段的不斷進(jìn)步,為解析釀造微生物群落的結(jié)構(gòu)和演替規(guī)律提供了更好的平臺(tái)[18],但通過菌群來調(diào)控高級(jí)醇的有效策略仍為空缺。本研究創(chuàng)新性地通過分析高級(jí)醇的代謝規(guī)律、菌群的變化差異,成功確定了影響高級(jí)醇產(chǎn)生的微生物。通過這種分析思路及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來進(jìn)一步確定風(fēng)味調(diào)控微生物對(duì)于大多數(shù)自然接種的傳統(tǒng)發(fā)酵食品都是適用的。此外,微生物之間具有密切的相互作用,多種風(fēng)味調(diào)控微生物的添加會(huì)改變微生物群落中原有的部分代謝特征,可能達(dá)到更好的風(fēng)味調(diào)控效果。

發(fā)酵食品微生物群落組成與相互作用復(fù)雜,本研究發(fā)現(xiàn)了微生物菌群自然發(fā)酵過程中對(duì)高級(jí)醇合成代謝具有顯著影響的微生物,表明通過風(fēng)味調(diào)控微生物對(duì)菌群進(jìn)行物質(zhì)代謝調(diào)控與其他研究中單菌改造的方式相比具有一定的優(yōu)勢(shì)。多數(shù)情況下,風(fēng)味調(diào)控微生物包含多個(gè)種或?qū)?明確風(fēng)味調(diào)控微生物后,可以進(jìn)一步理性設(shè)計(jì),利用不同的菌株組合對(duì)目標(biāo)物質(zhì)達(dá)到更好的調(diào)控效果[19],為食品發(fā)酵過程中的風(fēng)味代謝調(diào)控提供了一種有效的策略。然而,目前仍存在一些問題有待揭示,白酒等諸多傳統(tǒng)發(fā)酵食品釀造微生物群落復(fù)雜、功能多樣、相互作用密切[20],在發(fā)酵過程中微生物群落的動(dòng)態(tài)規(guī)律揭示尚不完善,代謝物在酶、基因等分子水平如何受到影響及調(diào)控,其深層機(jī)制仍有待研究。

綜上所述,本研究通過深入分析不同季節(jié)樣本高級(jí)醇的變化規(guī)律和微生物群落的結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律的差異,明確了春秋兩季高級(jí)醇產(chǎn)量有差異的原因以及與高級(jí)醇合成相關(guān)的微生物,驗(yàn)證了相關(guān)微生物對(duì)于發(fā)酵產(chǎn)生高級(jí)醇的調(diào)控作用,進(jìn)一步說明了風(fēng)味調(diào)控微生物對(duì)于食品發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物具有重要的影響,可以基于此來進(jìn)行代謝產(chǎn)物的調(diào)控,并用于構(gòu)建食品發(fā)酵合成微生物組,為不同季節(jié)穩(wěn)定生產(chǎn)白酒提供理論指導(dǎo)。