王玉帛，楊潔瑩

(蘭州大學(xué)口腔醫(yī)院,甘肅 蘭州 730030)

齲病是一種口腔慢性感染性疾病,主要表現(xiàn)為牙齒硬組織的慢性進(jìn)行性病損,具有發(fā)病率高、分布廣的特點(diǎn)。據(jù)國家衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會發(fā)布的第4 次全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,我國5歲和12 歲兒童患齲率分別為70.9%和34.5%,比10年前分別上升了5.8%和7.8%。齲病與多種因素相關(guān),比如飲食、宿主和時(shí)間等,但其最主要病因是口腔特定微生物的感染,其中,變形鏈球菌(Streptococcus mutans,MS)被公認(rèn)為最主要的致齲微生物,其黏附、聚集于由唾液蛋白所形成的生物膜上,產(chǎn)酸并耐酸,形成酸性微環(huán)境從而侵蝕牙釉質(zhì)造成脫礦進(jìn)而侵襲牙本質(zhì)導(dǎo)致齲病的發(fā)生[1]。因此,降低致齲細(xì)菌數(shù)量、減少酸的合成以及阻止菌斑生物膜形成也就成了防治齲病的最為有效的策略。

天然中草藥,如厚樸[2]、金銀花[3]、甘草[4]等因具有較好的抗菌防齲作用而被廣泛報(bào)道,但對于多種中草藥聯(lián)用防齲的研究和報(bào)道很少。本文以變形鏈球菌作為致齲菌的代表,對厚樸酚(Magnolol)、木犀草素(Luteolin)、甘草甜素(Glycyrrhizin)及其混合物的防齲能力進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

厚樸酚(梯系愛酶化成工業(yè)發(fā)展有限公司,CAS號為528-43-8)；甘草甜素(梯系愛酶化成工業(yè)發(fā)展有限公司,CAS 號為1405-86-3)；木犀草素(上海源葉生物科技有限公司,CAS 號為491-70-3)；BHI 培養(yǎng)基 (北京索萊寶生物科技有限公司,LA0360-250g)；全波長酶標(biāo)儀(Infinite M Nano)；變形鏈球菌(取樣于實(shí)驗(yàn)室自存菌種)；二甲基亞砜(DMSO)；一次性無菌接種環(huán)(上海玉博生物科技有限公司)；ZD-85恒溫振蕩器(力辰科技)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅)；生化培養(yǎng)箱(上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司)；氯己定漱口水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

BHI 培養(yǎng)基(腦心浸液肉湯)制備:將38.5g 腦心浸出液肉湯粉用三蒸水配置成1L 溶液,放入高壓蒸汽滅菌鍋,在121℃滅菌30min。

1.2.2 菌懸液的制備

在生長著變形鏈球菌的BHI 固體培養(yǎng)基上用一次性無菌接種環(huán)挑取一個(gè)單菌落,接種于3mL BHI 液體培養(yǎng)基中,放在ZD-85 37℃恒溫振蕩器中,復(fù)蘇48h,分光光度計(jì)調(diào)定菌懸液濃度為106CFU/mL (A600=0.2)

1.2.3 實(shí)驗(yàn)藥液的制備

厚樸酚藥液制備:將3.2mg 厚樸酚粉加入到20mL 的DMSO 中,配置成160μg/mL 的厚樸酚儲備液。用BHI 培養(yǎng)基將厚樸酚儲備液濃度等比稀釋,最終配置成（μg/mL）：160、80、40、20、10、5、2.5 的溶液,室溫儲存。

木犀草素藥液制備:將20mg 木犀草素粉加入到20mL 的DMSO 中,配置成1mg/mL 的木犀草素儲備液。用BHI 培養(yǎng)基將木犀草素儲備液濃度等比稀釋,最終配置成（μg/mL）：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 的溶液,室溫儲存。

甘草酸藥液制備:將12mg 甘草酸粉加入到20mLDMSO 中,配置成600μg/mL 的甘草酸儲備液。用BHI 培養(yǎng)基將甘草酸儲備液濃度等比稀釋,最終配 置 成（μg/mL）：600、300、150、75、37.5、18.75、9.375 的溶液,室溫儲存。

以上藥液以體積比1:1 混合時(shí),實(shí)際濃度為制備藥液濃度的一半。

1.3 混合液對變形鏈球菌生長的影響

1.3.1 微量肉湯稀釋法

在96 孔板中,以A 液橫向濃度梯度稀釋,加滿八排,B 液縱向濃度梯度稀釋,加滿八列,第九列加入陽性對照(氯己定漱口液加菌液),第十列加入陰性對照(培養(yǎng)基加菌液),第十一列加入空白對照(液體培養(yǎng)基),前十列均加入變形鏈球菌,第十一列僅加入液體培養(yǎng)基的方法,將三種藥液兩兩混合物制板,其中每種藥液體積均為90μl,菌液為20μl。放入ZD-85 恒溫振蕩器,待變形鏈球菌達(dá)到對數(shù)增長期(11h),先肉眼觀察,再用全波長酶標(biāo)儀測定其OD 值三次取平均值,使用Graphpad Prism 8 軟件進(jìn)行Heatmap數(shù)據(jù)分析,以8 列和H 排的數(shù)據(jù),找出三種藥液單獨(dú)使用時(shí)的MIC 值。實(shí)驗(yàn)做3 次取平均值。

1.3.2 聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)

在96 孔板中,以A 液橫向濃度梯度稀釋,加滿八排,B 液縱向濃度梯度稀釋,加滿八列,第九列加入陽性對照(氯己定漱口液加菌液),第十列加入陰性對照(培養(yǎng)基加菌液),第十一列加入空白對照(液體培養(yǎng)基),前十列均加入變形鏈球菌,第十一列僅加入液體培養(yǎng)基的方法,將三種藥液兩兩混合物制板,其中每種藥液體積均為90μl,菌液為20μl。放入ZD-85 恒溫振蕩器,待變形鏈球菌達(dá)到對數(shù)增長期(11h),先肉眼觀察,再用全波長酶標(biāo)儀測定其OD 值三次取平均值,使用Graphpad Prism 8 軟件進(jìn)行Heatmap數(shù)據(jù)分析,以顏色明顯變化的數(shù)據(jù)作為所需數(shù)值。實(shí)驗(yàn)做3 次取平均值。

1.3.3 聯(lián)合用藥效果評價(jià)

根據(jù)單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥的抑菌效果,計(jì)算分級抑制濃度(FIC)指數(shù),從而檢測兩兩之間的抗菌作用關(guān)系。FIC 指數(shù)=MIC(A 組聯(lián)合)/MIC(A 組單用)+MIC(B 組聯(lián)合)/MIC(B 組單用)。

當(dāng)FIC 指數(shù)小于0.5 時(shí),兩種藥為協(xié)同作用；當(dāng)FIC 指數(shù)為0.5～1 時(shí),兩種藥為相加作用；當(dāng)FIC 指數(shù)大于1 且小于2 時(shí),兩種藥為無關(guān)作用；當(dāng)FIC 指數(shù)大于2 時(shí),兩種藥為拮抗作用。

2 結(jié)果

經(jīng)肉眼觀察和Graphpad Prism 8 分析,每個(gè)實(shí)驗(yàn)的三次平行對照結(jié)果均一致,結(jié)果如圖1～3 所示和見表1～3。

表1 甘草甜素與木犀草素聯(lián)合的抗菌試驗(yàn)

表2 甘草甜素與厚樸酚聯(lián)合的抗菌試驗(yàn)

表3 木犀草素與厚樸酚聯(lián)合的抗菌試驗(yàn)

2.1 Heatmap 分析結(jié)果

2.1.1 MIC 的測定

木犀草素、甘草甜素、厚樸酚對變形鏈球菌的MIC 分別為（μg/mL）：125、75、20。如圖1～3 所示。

圖1 甘草甜素與木犀草素不同濃度混合液對變形鏈球菌的生長抑制作用

圖2 甘草甜素與厚樸酚不同濃度混合液對變形鏈球菌的生長抑制作用

圖3 木犀草素與厚樸酚不同濃度混合液對變形鏈球菌的生長抑制作用

2.1.2 FIC 指數(shù)計(jì)算

由表1～3 可知，通過計(jì)算厚樸酚、木犀草素、甘草甜素聯(lián)合應(yīng)用的FIC，F(xiàn)IC1=(62.5/125+37.5/75)=1，F(xiàn)IC2=(10/20+37.5/75)=1，F(xiàn)IC3=(62.5/125+10/20)=1，即當(dāng)各組分的濃度為1/2MIC 時(shí)，各組分的濃度縮小2 倍，比單用厚樸酚、木犀草素、甘草甜素時(shí)對變形鏈球菌抑制濃度提高了2 倍。該結(jié)果表明厚樸酚、木犀草素、甘草甜素分別聯(lián)合應(yīng)用具有良好的相加抗菌作用。

3 討論

3.1 國內(nèi)外研究進(jìn)展

厚樸酚能作用于變形鏈球菌的生物膜,抑制變形鏈球菌生物膜中的主要毒力因子ffh、gtf D、pdp的表達(dá)水平,通過凝固細(xì)菌蛋白、破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),有效抑制變形鏈球菌生長。其次,厚樸酚能抑制葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性減少胞外葡聚糖的合成,減緩細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)酸,降低對牙面的酸蝕破壞程度,從而大量減少變形鏈球菌的黏附聚集[5]。木犀草素可以破壞細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),引起膜電位發(fā)生變化、胞內(nèi)成分的釋放,從而引起營養(yǎng)物質(zhì)吸收、ATP活性降低等功能性障礙,最終導(dǎo)致菌體死亡[6]。實(shí)驗(yàn)證實(shí),在甘草酸作用下,即使培養(yǎng)基的酸度接近中性,變形鏈球菌的增殖仍受到明顯抑制,說明甘草甜素可能同時(shí)抑制了變鏈菌產(chǎn)酸和分裂增殖,提示甘草酸可能對變鏈菌糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程和/或糖代謝途徑有抑制作用[7,8]。同時(shí)其對于變形鏈球菌生物膜的形成也有一定抑制作用[9]。

3.2 不足與展望

本研究表明,厚樸酚、甘草甜素、木犀草素聯(lián)合用藥時(shí)對口腔內(nèi)主要致齲菌變形鏈球菌具有良好抗菌性能,且有相加效果。但本實(shí)驗(yàn)只研究了對口腔主要致齲細(xì)菌的抑制作用。后期需在動物模型下進(jìn)行進(jìn)一步研究,探究其對口腔主要致齲細(xì)菌的抑制機(jī)制等,為進(jìn)一步臨床試驗(yàn)提供基礎(chǔ)。綜上,可將此混合液應(yīng)用于牙膏、漱口水等口腔清潔產(chǎn)品,發(fā)揮其優(yōu)良性能,在防齲與口腔清潔領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。