混合菌種發(fā)酵大豆黃漿水的工藝優(yōu)化

于 冰，高芫超，張 妍，呂佳璐，張莉力，許云賀?

（錦州醫(yī)科大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121000）

我國是大豆的發(fā)源地，從古至今，豆制品的種類多種多樣，而豆腐是最受歡迎的一種豆制品。在豆腐擠壓成型過程中所產(chǎn)生的、組織狀態(tài)為棕黃色膠體混合物的廢水，即為大豆黃漿水。隨著我國豆腐產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，大豆黃漿水產(chǎn)量也逐漸增加。研究表明，大豆中的生理活性物質(zhì)會在豆腐生產(chǎn)過程中隨著黃漿水而流失，大豆黃漿水中蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類、色素以及鹽類物質(zhì)含量豐富[1-4]，但其化學(xué)需氧量和生物需氧量均較高，直接排放到環(huán)境中不僅浪費(fèi)資源，而且會造成環(huán)境的污染[5]。大豆黃漿水中含有大量的微生物生長所需的營養(yǎng)基質(zhì)[6]，黃莉等[7]利用木醋桿菌對黃漿水進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)細(xì)菌纖維素。劉平[8]利用大豆黃漿水發(fā)酵生產(chǎn)維生素 B12。伊靜等[9]以黃漿水和山楂為主要原料，經(jīng)調(diào)配和乳酸菌發(fā)酵技術(shù)制備功能性飲品。因而將黃漿水作為微生物發(fā)酵基質(zhì)，以甘蔗糖蜜作為碳源，既降低發(fā)酵成本，又有效解決大豆黃漿水污染問題，實(shí)現(xiàn)資源的再利用。

本實(shí)驗(yàn)利用乳酸菌和酵母菌對黃漿水進(jìn)行發(fā)酵，以甘蔗糖蜜為碳源，考察糖蜜添加量和初始pH以及不同培養(yǎng)條件對發(fā)酵后大豆黃漿水中乳酸菌及酵母菌活菌數(shù)的影響，并為后續(xù)開發(fā)動物微生態(tài)制劑打下基礎(chǔ)，為制備動物微生態(tài)制劑提供廉價的原料以及生產(chǎn)工藝，為大豆黃漿水的綜合利用提供新的途徑和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆黃漿水：錦州市氣象臺豆腐廠生產(chǎn)；干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、釀酒酵母：由實(shí)驗(yàn)室保存；乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）、孟加拉紅培養(yǎng)基：天津市科密歐化學(xué)試劑；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱：金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器廠；SW-CJ-1C超凈工作臺：蘇州凈化；M4-AL204電子分析天平：蘭州中西儀器；YXQ-LS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DHG-9245A型高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種種子液制備

黃漿水中加入5%的糖蜜微熱混合均勻，121 ℃滅菌15 min，冷卻至室溫后，從斜面接一環(huán)乳酸菌到黃漿水培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；將酵母菌接入上述黃漿水培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72 h，進(jìn)行活化培養(yǎng)。

1.3.2 發(fā)酵液的制備方法

在添加5%糖蜜、初始pH菌種為6.0的黃漿水培養(yǎng)基中，按接種量為 5%，接種菌種比例為V（發(fā)酵乳桿菌）：V（干酪乳桿菌）∶V（釀酒酵母）= 1∶1∶1，轉(zhuǎn)速為120 r/min[10]，37 ℃振搖培養(yǎng) 72 h。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 糖蜜添加量對活菌數(shù)的影響 在黃漿水培養(yǎng)基中調(diào)整添加1%、3%、5%、7%、9%糖蜜，培養(yǎng)條件同 1.3.2，考察糖蜜添加量對活菌數(shù)的影響。

1.3.3.2 初始 pH對活菌數(shù)的影響 依據(jù) 1.3.3.1的研究結(jié)果，確定糖蜜的最佳添加量后，調(diào)整初始pH為5.2、5.6、6.0、6.4、6.8，其它培養(yǎng)條件同1.3.2，考察初始pH對活菌數(shù)的影響。

1.3.3.3 接種量對活菌數(shù)的影響 依據(jù)1.3.3.2的研究結(jié)果，調(diào)整接種量為1%、3%、5%、7%、9%，其它培養(yǎng)條件同 1.3.2，考察接種量對活菌數(shù)的影響。

1.3.3.4 接種比例對活菌數(shù)的影響 依據(jù) 1.3.3.3的研究結(jié)果，調(diào)整接種比例為1∶1∶2、1∶2∶1、1∶1∶1、2∶1∶1、2∶2∶1，轉(zhuǎn)速為 120 r/min，37 ℃振搖培養(yǎng)72 h，考察接種比例對活菌數(shù)的影響。

1.3.3.5 轉(zhuǎn)速對活菌數(shù)的影響 依據(jù)1.3.3.4的研究結(jié)果，調(diào)整轉(zhuǎn)速為 80、100、120、140、160 r/min，37 ℃振搖培養(yǎng)72 h，考察培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對活菌數(shù)的影響。

1.3.3.6 培養(yǎng)溫度對活菌數(shù)的影響 依據(jù) 1.3.3.5的研究結(jié)果，調(diào)整培養(yǎng)溫度為31、33、35、37、39 ℃，振搖培養(yǎng)72 h，考察培養(yǎng)溫度對活菌數(shù)的影響。

1.3.3.7 培養(yǎng)時間對活菌數(shù)的影響 依據(jù) 1.3.3.6的研究結(jié)果，調(diào)整培養(yǎng)時間為24、48、72、96、120 h，考察培養(yǎng)時間對活菌數(shù)的影響。

1.3.4 乳酸菌總數(shù)的測定

采用 GB4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)的方法》測定乳酸菌總數(shù)。

1.3.5 酵母菌總數(shù)的測定

采用 GB4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌酵母計(jì)數(shù)檢驗(yàn)的方法》測定酵母菌總數(shù)。

1.3.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乳酸菌活菌數(shù)（Y）為指標(biāo)，以糖蜜添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始pH（C）為自變量，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用軟件Design-Expert V8.0.6.1設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表1所示。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface optimization test

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010進(jìn)行初步整理，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示；采用SPSS 22.0軟件對單因素?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并采用LSD法進(jìn)行多重比較，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 糖蜜添加量對活菌數(shù)影響

甘蔗糖蜜呈深棕色、黏稠狀和半流動的液態(tài)，含多種活性物質(zhì)，可作為微生物的碳源或基料[11]。由圖1可知酵母菌菌數(shù)隨著糖蜜添加量的增加呈先降低后升高的趨勢，在糖蜜添加量為3%時，菌數(shù)達(dá)到最低值。隨著糖蜜添加量的增加乳酸菌菌數(shù)先升高后降低，在糖蜜添加量為 5%時菌數(shù)最高，達(dá)到 1.72×109CFU/mL，顯著高于其他糖蜜添加量（P<0.05），所以綜合考慮本實(shí)驗(yàn)以糖蜜添加量5%為宜。

圖1 糖蜜添加量對活菌數(shù)的影響Fig.1 The effect of molasses addition on the number of viable bacteria

2.1.2 初始pH對活菌數(shù)影響

由圖2可知，酵母菌菌數(shù)在初始pH為5.6時最高為3.61×107CFU/mL，初始pH為6.4時菌數(shù)次之。隨著初始 pH的逐漸升高，乳酸菌菌數(shù)先降低后升高，在初始pH為6.8時最高，活菌數(shù)為2.03×109CFU/mL，顯著高于其他pH（P<0.05）,該因素影響到細(xì)菌的分裂程度，可能與細(xì)胞分裂誘導(dǎo)機(jī)制有關(guān)[12]，綜合分析確定本實(shí)驗(yàn)初始 pH為6.8。

圖2 初始pH對活菌數(shù)的影響Fig.2 The effect of initial pH on the number of viable bacteria

2.1.3 接種量對活菌數(shù)的影響

由圖3可知，在接種量為6%時，乳酸菌菌數(shù)最高為 2.16×109CFU/mL，顯著高于其他接種量（P<0.05），接種量為 7%時菌數(shù)下降。這可能因?yàn)殡S著接種量增多，乳酸菌因群體感應(yīng)可以更快的適應(yīng)環(huán)境，并快速生長，但當(dāng)接種量超過一定限度，乳酸菌間會因?yàn)楦偁帬I養(yǎng)和生存空間導(dǎo)致乳酸菌的活菌數(shù)反而下降[13]。酵母菌菌數(shù)在接種量為7%時最高為5.5×107CFU/mL，但是接種量為6%與7%差異不顯著（P>0.05），因此確定最佳接種量為6%。

圖3 接種量對活菌數(shù)的影響Fig.3 The influence of inoculation amount on the number of viable bacteria

2.1.4 接種比例對活菌數(shù)的影響

由圖4可知，當(dāng)接種比例為1∶1∶1時，乳酸菌和酵母菌的活菌數(shù)都達(dá)到最高，乳酸菌菌數(shù)2.34×109CFU/mL，酵母菌菌數(shù)為5.7×107CFU/mL，二者菌數(shù)均顯著高于其他接種比例（P<0.05）。這可能是因?yàn)樵诮臃N比例為1∶1∶1時，共生促進(jìn)生長作用大于起始菌數(shù)的影響[14]，所以確定此接種比例對于混合發(fā)酵較為合適。

圖4 接種比例對活菌數(shù)的影響Fig.4 The effect of inoculation ratio on the number of viable bacteria

2.1.5 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對活菌數(shù)的影響

由圖5可知，隨著轉(zhuǎn)速的增大，乳酸菌和酵母菌活菌數(shù)均呈先增高后降低的趨勢。當(dāng)轉(zhuǎn)速為120 r/min時，乳酸菌活菌數(shù)為2.35×109CFU/mL，顯著高于其他培養(yǎng)轉(zhuǎn)速（P<0.05），酵母菌活菌數(shù)為6.1×107CFU/mL。這可能因?yàn)檗D(zhuǎn)速適當(dāng)時，將新增的菌體均勻的分散，與培養(yǎng)基充分接觸，更加有利于菌體的生長。然而當(dāng)轉(zhuǎn)速超過一定限度時，菌體數(shù)量反而降低，這可能是因?yàn)楫?dāng)轉(zhuǎn)速過高時，剪切力過大，使菌體受到損傷，影響其正常生長[15]，所以確定培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為120 r/min。

圖5 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對活菌數(shù)的影響Fig.5 The influence of culture speed on the number of viable bacteria

2.1.6 培養(yǎng)溫度對活菌數(shù)的影響

由圖 6可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為 31 ℃，乳酸菌和酵母菌活菌數(shù)均顯著高于其他溫度（P<0.05），酵母菌菌數(shù)為3.5×108CFU/mL，隨著溫度升高，超過適合酵母菌生存的溫度，活菌數(shù)逐漸下降，當(dāng)溫度為 39 ℃時，沒有酵母菌存活。而乳酸菌在31 ℃時菌數(shù)最高達(dá)到3.0×109CFU/mL，這可能因?yàn)槿樗峋鸀閰捬蹙⒔湍妇鸀榧嫘院醚蹙?，二者都具有耐酸性，且酵母菌主要在早期生長并產(chǎn)生大量的菌體及代謝產(chǎn)物，而乳酸菌在該溫度可以存活，并且能夠利用酵母菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行生長[16]，因此最佳培養(yǎng)溫度為31 ℃。

圖6 培養(yǎng)溫度對活菌數(shù)的影響Fig.6 The influence of culture temperature on the number of viable bacteria

2.1.7 培養(yǎng)時間對活菌數(shù)的影響

從圖7可知，酵母菌在培養(yǎng)時間為72 h時活菌數(shù)最高，這是因?yàn)榻湍傅纳L周期長于乳酸菌，乳酸菌在培養(yǎng)時間為 48 h時，活菌數(shù)最高為3.18×109CFU/mL，顯著高于其他培養(yǎng)時間（P<0.05），培養(yǎng)72 h菌數(shù)顯著下降，乳酸菌單獨(dú)培養(yǎng)到24 h大致進(jìn)入衰亡期，但乳酸菌48 h時菌數(shù)最高，可能是由于添加了酵母菌混合發(fā)酵，乳酸菌的衰亡期推后[17]，綜合考慮培養(yǎng)時間以 48 h為宜。

圖7 培養(yǎng)時間對活菌數(shù)的影響Fig.7 The influence of culture time on the number of viable bacteria

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定接種量為6%、接種比例為1∶1∶1、轉(zhuǎn)速為120 r/min、培養(yǎng)時間為 48 h，選擇糖蜜添加量（A）、初始 pH（B）、培養(yǎng)溫度（C）3個因素為自變量，因乳酸菌對多種腸道疾病有潛在的抑制作用，是制備微生態(tài)制劑的主要菌種，所以將大豆黃漿水發(fā)酵液中乳酸菌的活菌數(shù)（Y）作為響應(yīng)值，根據(jù) BoxBehnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)共17個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中14個為析因點(diǎn)，5個為中心點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果如表2所示。

2.2.2 模型的建立與顯著性分析

利用Design-Expert V8.0.6.1軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合分析，得到綜合評分Y對響應(yīng)面因素的二次多項(xiàng)回歸方程：

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Test design and results of response surface analysis

Y=+3.18+0.16A+8.750E–003B–0.046C+5.000E–003AB+0.040AC–0.062BC–0.66A2–0.68B2–0.73C2。在該二次多元回歸方程中，各項(xiàng)系數(shù)的絕對值大小反映了其所對應(yīng)因子對乳酸菌活菌數(shù)的影響程度[18]，對該回歸方程進(jìn)行分析可知，3個因子對乳酸菌活菌數(shù)的影響程度為：糖蜜添加量>培養(yǎng)溫度>初始pH。

由表3可知，回歸模型的P值<0.000 1，說明模型高度顯著；決定系數(shù)R2為0.997 7，校正系數(shù)Radj2為0.994 7，決定系數(shù)R2高于0.90，說明回歸模型的擬合程度高，實(shí)驗(yàn)誤差較小。失擬項(xiàng)P>0.05為不顯著，進(jìn)一步說明回歸模型與實(shí)際情況擬合程度較高[19]，可用該模型來分析和預(yù)測大豆黃漿水發(fā)酵的工藝參數(shù)。

從表 3回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)糖蜜添加量（A），二次項(xiàng)糖蜜添加量（A2）、初始pH值（B2）、培養(yǎng)溫度（C2）對乳酸菌活菌數(shù)影響極顯著（P<0.01），一次項(xiàng)培養(yǎng)溫度（C）、初始pH和培養(yǎng)溫度的交互項(xiàng)（BC）對乳酸菌活菌數(shù)影響顯著（P<0.05），其他項(xiàng)影響不顯著。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA results

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

圖 8～10是依據(jù)回歸方程所繪制出各因素交互作用的響應(yīng)面圖及等高線圖，等高線圖的形狀即反映交互作用的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示兩因素交互作用顯著[20-21]。由8至10響應(yīng)面圖可以看出，乳酸菌活菌數(shù)隨著糖蜜添加量、初始pH、培養(yǎng)溫度的變化出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。由圖8和圖9等高線圖可知，等高線圖趨近于圓形，表示糖蜜添加量和初始pH、培養(yǎng)溫度對乳酸菌活菌數(shù)的交互作用不顯著。而圖 10等高線圖呈橢圓形，表示初始pH與培養(yǎng)溫度對乳酸菌活菌數(shù)的交互作用顯著。

圖8 糖蜜添加量（A）與初始pH（B）對乳酸菌活菌數(shù)的曲面圖和等高線圖Fig.8 Curved surface and contour plots of molasses addition (A) and initial pH (B) on the number of viable lactic acid bacteria

圖9 糖蜜添加量（A）培養(yǎng)溫度（C）對乳酸菌活菌數(shù)的曲面圖和等高線圖Fig.9 Curved surface and contour plot of molasses addition amount (A) culture temperature(C) on the number of viable lactic acid bacteria

圖10 初始pH（B）與培養(yǎng)溫度（C）對乳酸菌活菌數(shù)的曲面圖和等高線圖Fig.10 Curved surface plot and contour plot of initial pH (B) and culture temperature(C) on the number of viable lactic acid bacteria

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析優(yōu)化得到最佳培養(yǎng)條件為：糖蜜添加量5.12%，初始pH6.80，培養(yǎng)溫度30.97 ℃，此時發(fā)酵液中乳酸菌的活菌數(shù)的理論值達(dá)到3.19×109CFU/mL。

2.2.4 最佳培養(yǎng)條件驗(yàn)證

按照實(shí)驗(yàn)得出的培養(yǎng)條件校正為：糖蜜添加量5%，初始pH 6.80，培養(yǎng)溫度31 ℃進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到實(shí)際的發(fā)酵液中乳酸菌的活菌數(shù)為（3.18±0.05）× 109CFU/mL，與預(yù)測值接近，酵母菌菌數(shù)為（4.1±0.10）× 108CFU/mL。由此可見響應(yīng)面分析法優(yōu)化的大豆黃漿水發(fā)酵工藝條件可行，參數(shù)較為可靠，具有一定的實(shí)用價值。

3 結(jié)論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵大豆黃漿水的工藝參數(shù)，結(jié)果表明最佳的工藝參數(shù)為：接種量6%、接種比例1∶1∶1、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速120 r/min、培養(yǎng)時間48 h、糖蜜添加量5%、初始pH 6.80，培養(yǎng)溫度31 ℃，在此條件下大豆黃漿水發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)為 3.18×109CFU/mL，酵母菌菌數(shù)為 4.1×108CFU/mL，乳酸菌和酵母菌的活菌數(shù)相比優(yōu)化前顯著提高，降低了微生態(tài)制劑的制作成本，為進(jìn)一步利用大豆黃漿水提供技術(shù)參考。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。