王興國(guó)，賈 嬌，馬 林

(1.榆林市第二醫(yī)院普通外科,陜西 榆林 719000;2.榆林市第二醫(yī)院消化內(nèi)科,陜西 榆林 719000;3.寶雞市中醫(yī)醫(yī)院普通外科,陜西 寶雞 721000)

據(jù)國(guó)家癌癥中心2015年相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，胃癌發(fā)病率僅次于肺癌，在我國(guó)惡性腫瘤中發(fā)病率居第二位[1-3]。80%的新病例在診斷開始時(shí)已發(fā)展到中晚期。與日韓早期胃癌診斷率較高、歐美胃癌發(fā)病率較低相比，我國(guó)在胃癌防治方面仍面臨非常嚴(yán)峻的形勢(shì)[4-6]。我國(guó)胃癌診治水平參差不齊，進(jìn)一步加大了胃癌的治療難度。胃癌發(fā)病機(jī)制與多因素、多階段、多基因參與有關(guān)，是一個(gè)比較復(fù)雜的發(fā)展過程，而且會(huì)常伴隨凋亡蛋白、抑癌基因失活以及癌基因激活等多方面因素。有研究[7-8]顯示，在對(duì)晚期HER-2陽性乳腺癌患者Ⅱ期治療中，應(yīng)用吡咯替尼輔助化療能夠提升患者的遠(yuǎn)期生存率。為了了解吡咯替尼對(duì)胃癌的治療效果，本研究通過細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法，探討吡咯替尼對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖能力及不同類型胃癌組織中鈣黏蛋白S100A10表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取購自上海拜力生物科技有限公司的人胃癌SNU-1細(xì)胞株、北京索來寶生物科技有限公司的RPMI 1640培養(yǎng)基，北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司的Hy Clone胎牛血清，磷酸鹽緩沖液PBS，實(shí)驗(yàn)室留存的正常胃黏膜、非典型增生組織、高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織，每種組織樣本數(shù)量20個(gè)，以及購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司的吡咯替尼。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：陰性對(duì)照組，加培養(yǎng)基和細(xì)胞，不加藥物干預(yù)；空白組，加等量培養(yǎng)基，不加細(xì)胞；吡咯替尼藥物濃度分別為25、50、100 μmol/ml組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：將SNU-1胃癌細(xì)胞株復(fù)蘇之后，加入含有10%的新生小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液在5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，使用0.25%胰酶消化傳代，每5 d進(jìn)行1次傳代，長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.3 MTT法測(cè)定胃癌細(xì)胞增殖情況：用移液管吸取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌SNU-1細(xì)胞，加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，約高于培養(yǎng)皿底面3～4 mm，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為2×105個(gè)/ml。使用加樣器以每孔100 μl將細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)(空白孔不加)，以保證每孔有2×104個(gè)細(xì)胞，將接種好的細(xì)胞置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后取出，藥物組分別加入不同濃度的吡咯替尼，每個(gè)孔20 μl，陰性孔和空白孔加入等量的培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)，記錄培養(yǎng)后24、36、72 h的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率[9-10]。

1.2.4 癌組織培養(yǎng)與吡咯替尼干預(yù)：分別取正常胃黏膜、非典型增生組織、高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織，每種組織樣本數(shù)量20個(gè)，將樣本進(jìn)行標(biāo)簽標(biāo)記之后，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)清洗液將樣本清洗3次后，放置在無菌培養(yǎng)皿之中，應(yīng)用無菌眼科剪將組織剪成(1～2)mm×(1～2)mm×(1～2)mm的小塊，再應(yīng)用培養(yǎng)液清洗3次，各組織小塊之間相距0.5 cm為宜。蓋好培養(yǎng)板蓋，將培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)，倒置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中，3 h后，待組織塊邊緣微干涸，然后將培養(yǎng)板取出，緩緩向培養(yǎng)板中加入培養(yǎng)液，平放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每24 h更換一次培養(yǎng)液，觀察不同組織的生長(zhǎng)情況，待有細(xì)胞從組織之中爬出，呈現(xiàn)半透明狀態(tài)，則培養(yǎng)存活，如果組織變黑，沒有細(xì)胞爬出則可認(rèn)定組織培養(yǎng)死亡，并將死亡的組織挑出。

1.2.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)不同類型組織中鈣黏蛋白S100A10表達(dá)情況：應(yīng)用免疫組織化學(xué)法，測(cè)定正常胃黏膜、非典型增生組織、高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中鈣黏蛋白S100A10表達(dá)情況，具體步驟依照鈣黏蛋白S100A10試劑盒進(jìn)行。并選取高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌每種20個(gè)存活組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用100 μmol/ml濃度吡咯替尼分別加入到不同的胃癌組織中，在干預(yù)48 h之后，繼續(xù)應(yīng)用免疫組織化學(xué)法測(cè)定組織中鈣黏蛋白S100A10表達(dá)情況。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 組織中的蛋白表達(dá)結(jié)果依照陽性細(xì)胞數(shù)比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合計(jì)分。陽性細(xì)胞數(shù)：≤10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分；染色強(qiáng)度：棕褐色計(jì)3分，黃色計(jì)2分，無色計(jì)1分；隨后將陽性細(xì)胞數(shù)分值乘以染色強(qiáng)度分值，1分為陰性(-)，2～4分為陽性(+)，≥5分為強(qiáng)陽性()。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度吡咯替尼對(duì)SNU-1胃癌細(xì)胞抑制率的影響 不同濃度吡咯替尼對(duì)SNU-1胃癌細(xì)胞在24、36、48 h的生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)，組間對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 不同濃度吡咯替尼對(duì)SNU-1胃癌細(xì)胞抑制率的影響(%)

2.2 不同類型胃癌組織中鈣黏蛋白S100A10免疫組化染色表達(dá) 應(yīng)用免疫組化染色檢驗(yàn)正常胃黏膜、非典型增生、胃癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中S100A10蛋白表達(dá)情況，S100A10蛋白主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，而且表達(dá)情況也有所不同，見圖1。

A：正常胃黏膜組；B：非典型增生組；C：高分化腺癌組；

2.3 不同類型胃癌組織S100A10蛋白陽性表達(dá)率比較 正常胃黏膜中S100A10蛋白表陽性表達(dá)率為5.00%，非典型增生組織為20.00%，高分化腺癌為40.00%，中分化腺癌為55.00%，低分化腺癌為65.00%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為65.00%，組間對(duì)比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表2 不同類型胃癌組織中S100A10蛋白陽性表達(dá)率比較[個(gè)(%)]

2.4 不同類型胃癌組織吡咯替尼干預(yù)后鈣黏蛋白S100A10陽性表達(dá)的變化 由于正常胃黏膜和非典型增生組織中S100A10陽性率比較低，因此選取高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織應(yīng)用100 μmol/ml劑量吡咯替尼進(jìn)行干預(yù)，吡咯替尼干預(yù)前后中分化腺癌和低分化腺癌組織中S100A10陽性表達(dá)對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 不同類型胃癌組織吡咯替尼干預(yù)后鈣黏蛋白S100A10陽性表達(dá)的變化 (個(gè))

3 討 論

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均居世界前列。胃癌大多是通過胃炎-萎縮-腸化-不典型增生的過程演變而來，其中萎縮、腸化和不典型增生是胃癌的癌前病變[11-13]。本病早期無明顯癥狀，導(dǎo)致大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)本病已發(fā)展到晚期，無法通過手術(shù)治愈。因此尋找能夠判定患者早期胃癌的相關(guān)指標(biāo)，探討不同藥物對(duì)胃癌細(xì)胞的影響效果，對(duì)胃癌的臨床治療具有重要意義。吡咯替尼是馬來酸鹽類藥物，上市劑型主要是片劑，規(guī)格為160 mg/片，當(dāng)前被應(yīng)用到許多癌癥的輔助治療中。相關(guān)研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，吡咯替尼是新型的 EGFR 家族不可逆酪氨酸激酶抑制劑,同時(shí)具有抗 EGFR/HER-1、HER-2 以及 HER-4 的活性。S100A10蛋白，即p11蛋白，是鈣結(jié)合蛋白家族S100成員，S100A10蛋白由兩個(gè)同分異構(gòu)單位α和β共同構(gòu)成異型二聚體或同型二聚體，大多情況下是以同型二聚體存在的，參與細(xì)胞的內(nèi)外物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)、胞吐和胞吞。有研究[16]顯示，S100家族成員在腫瘤的發(fā)展發(fā)生中具有重要作用，而且家族多個(gè)成員在腫瘤組織的異常表達(dá)和腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)具有明顯關(guān)系。因此本文主要探討吡咯替尼對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖能力及不同類型胃癌組織中鈣黏蛋白S100A10表達(dá)的影響，希望能夠?yàn)榕R床胃癌的治療與疾病控制提供參考。

本研究結(jié)果表明，不同濃度吡咯替尼對(duì)SNU-1胃癌細(xì)胞在24、36、48 h的生長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng)，組間對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此證明，吡咯替尼能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖，而且濃度越高效果越好，但是應(yīng)用到臨床治療中還需要將不良反應(yīng)等多種參照加入找出適合的藥物劑量。相關(guān)研究[17]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用吡咯替尼對(duì)晚期乳腺癌患者的治療中，能夠提升患者10%的5年生存率，具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值，與本研究將吡咯替尼應(yīng)用到胃癌的治療中；應(yīng)用免疫組化染色檢驗(yàn)正常胃黏膜、非典型增生、胃癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中S100A10蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，S100A10蛋白主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，而且表達(dá)情況也有所不同；正常胃黏膜中S100A10蛋白表陽性表達(dá)率為5.00%，非典型增生組織為20.00%，高分化腺癌為40.00%，中分化腺癌為55.00%，低分化腺癌為65.00%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為65.00%，組間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)研究[18]發(fā)現(xiàn)，Annexin A2和S100A10能夠產(chǎn)生相互作用，加速組織型纖溶酶原激活物介導(dǎo)纖溶酶產(chǎn)生，能夠進(jìn)一步激活蛋白酶，從而活化基質(zhì)金屬蛋白酶，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。還有研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，S100A10蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織和胃癌組織的陽性表達(dá)率明顯高于正常胃黏膜組織。因此本研究應(yīng)用S100A10蛋白陽性表達(dá)來作為藥物干預(yù)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)；由于正常胃黏膜和非典型增生組織中S100A10陽性率比較低，因此選取高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織應(yīng)用100 μmol/ml劑量吡咯替尼進(jìn)行干預(yù)，吡咯替尼干預(yù)前后中分化腺癌和低分化腺癌組織中S100A10陽性率影響對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此證明，吡咯替尼對(duì)不同類型胃癌組織中S100A10蛋白表達(dá)具有一定抑制作用，特別是對(duì)于低分化和中分化胃癌組織，因此吡咯替尼可能對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移有抑制作用。但是本研究樣本量過少，而且胃癌存在遺傳學(xué)個(gè)體差異，所以臨床應(yīng)用之前仍然需要擴(kuò)大樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，從而確保臨床治療的確切性。

綜上所述，吡咯替尼對(duì)于人胃癌細(xì)胞增殖能力具有抑制作用，不同類型胃癌組織中鈣黏蛋白S100A10表達(dá)有所不同，隨著胃癌細(xì)胞的增殖，鈣黏蛋白S100A10表達(dá)的陽性表達(dá)增高，吡咯替尼對(duì)于不同胃組織鈣黏蛋白S100A10表達(dá)具有一定影響，因此吡咯替尼對(duì)胃癌可能具有一定治療作用，可為胃癌的臨床治療提供參考。