楊瀟曼，王克華，王曉丹，馬芊芊，石家秀，張明月

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250011;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合生殖與遺傳中心,濟(jì)南 250011;3.萊陽市人民醫(yī)院,萊陽 265200)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種以雄激素過高、稀發(fā)排卵或無排卵、卵巢多囊樣改變?yōu)樘卣鞯呐詢?nèi)分泌代謝性疾病，患者常由于持續(xù)的無排卵狀態(tài)導(dǎo)致不孕，并可出現(xiàn)胰島素抵抗、糖脂代謝異常等。PCOS病因復(fù)雜，治療困難[1]。近來研究顯示，PCOS患者血清、卵泡液、顆粒細(xì)胞等多種體液和組織細(xì)胞中均存在miRNA的異常表達(dá)[2-4]，這些miRNA與PCOS患者的卵母細(xì)胞發(fā)育異常和受精失敗有關(guān)[5]。miRNA在循環(huán)系統(tǒng)中數(shù)量眾多，穩(wěn)定存在，不受月經(jīng)周期影響，且取樣方便。循環(huán)miRNA如能在一定程度上反映卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量，將有助于早期胚胎種植潛能的評估。本實(shí)驗(yàn)擬分析顆粒細(xì)胞中miR-2861、miR-483-3p表達(dá)水平與卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量的相關(guān)性，并進(jìn)一步發(fā)掘其與血清中miRNA表達(dá)的相關(guān)性，為血清miRNA在臨床上預(yù)測早期胚胎發(fā)育潛能提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年4月至2018年1月于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心行ICSI的PCOS患者58例(PCOS組)和單純因男方因素不孕的患者23例(對照組)。PCOS組納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)的PCOS患者[6]；3個月內(nèi)未口服類固醇、口服避孕藥、二甲雙胍或噻嗪類利尿劑等藥物；未合并高血壓、高血脂癥、糖尿病、先天性腎上腺皮質(zhì)增生、庫欣綜合征或分泌雄激素的腫瘤。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基本信息及病史采集 采集患者的個人信息，如姓名、年齡、身高、體重等,以及患者病史，如不孕年限。

1.2.2 臨床指標(biāo)采集 患者月經(jīng)期2～4天于本院門診檢驗(yàn)室抽取空腹靜脈血，測定基礎(chǔ)內(nèi)分泌及血液生化。收集患者睪酮、空腹胰島素、空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等臨床數(shù)據(jù)，同時于取卵日留取血清樣本于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)采集及評估 陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵，4～6h后去除卵外周顆粒細(xì)胞，高倍倒置顯微鏡下行卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射受精，受精后16～18h觀察胚胎情況，對胚胎進(jìn)行評估并選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移植。記錄HCG日>14mm卵子數(shù)、獲卵數(shù)、MII卵數(shù)、2PN數(shù)、2PN卵裂數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)等，計(jì)算獲卵率、MII卵率、正常受精率、2PN卵裂率及優(yōu)質(zhì)胚胎率(獲卵率=獲卵數(shù)/HCG日>14mm卵子數(shù)；MII卵率=MII卵數(shù)/獲卵數(shù)；正常受精率=2PN卵數(shù)/獲卵數(shù)；2PN卵裂率=2PN卵裂數(shù)/2PN數(shù)；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN卵裂數(shù))。取卵結(jié)束后于卵泡液中提取顆粒細(xì)胞，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 miRNA檢測方法 將收集的血清和顆粒細(xì)胞標(biāo)本分別按miRNAeasy試劑盒(QIAGEN，德國)說明書步驟提取總RNA，使用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA，日本)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA樣品配置Real-time PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。內(nèi)參及目的miRNA引物序列由大連寶生物工程提供。miR-2861引物序列：5'-AAATGGCGGTGGGCGGAAA-3'；miR-483-3p引物序列：5'-TCACTCCTCTCCTCCCGTCTT-3'；U6-F引物序列：5'-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3'；U6-R引物序列：5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3'。

2 結(jié) 果

2.1 PCOS組與對照組的臨床指標(biāo) PCOS組的BMI、睪酮、空腹胰島素、甘油三酯、低密度脂蛋白顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，PCOS組的獲卵率、MII卵率、正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率降低，獲卵數(shù)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 PCOS組與對照組的臨床指標(biāo)比較

表2 PCOS組與對照組的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

2.2 PCOS組與對照組血清和顆粒細(xì)胞中miR-2861、miR-483-3p表達(dá)水平比較 PCOS組血清和顆粒細(xì)胞中miR-2861表達(dá)水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PCOS組血清和顆粒細(xì)胞中miR-483-3p表達(dá)水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。miR-2861在PCOS組血清和顆粒細(xì)胞中的表達(dá)水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.418，P<0.05)；miR-483-3p在PCOS組血清和顆粒細(xì)胞中的表達(dá)水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.447，P<0.05)。

圖1 血清與顆粒細(xì)胞中miR-2861、miR-483-3p相對表達(dá)量(prism8軟件)*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3 PCOS組血清中miR-2861、miR-483-3p表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 PCOS組血清中miR-2861表達(dá)水平與空腹胰島素、總膽固醇水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，miR-483-3p表達(dá)水平與睪酮、空腹胰島素、低密度脂蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 PCOS組血清中miR-2861、miR-483-3p表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 PCOS組血清與顆粒細(xì)胞miR-2861、miR-483-3p表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性 PCOS組血清和顆粒細(xì)胞中miR-2861表達(dá)水平與MII卵率、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均呈正相關(guān)，血清miR-2861表達(dá)與正常受精率呈正相關(guān)(P<0.05)，顆粒細(xì)胞miR-2861與獲卵率呈正相關(guān)(P<0.05)。

PCOS組血清和顆粒細(xì)胞中miR-483-3p表達(dá)水平均與獲卵率、MII卵率、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率呈正相關(guān)，且顆粒細(xì)胞中miR-483-3p表達(dá)與正常受精率呈正相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 PCOS組血清與顆粒細(xì)胞中miR-2861、miR-483-3p表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

MicroRNA是一種具有組織特異性和發(fā)育階段特異性的內(nèi)源性調(diào)控非編碼RNA[7]，主要通過轉(zhuǎn)錄抑制或?qū)RNA的切割或降解實(shí)現(xiàn)對人體生理病理狀態(tài)的調(diào)節(jié)。目前大部分PCOS相關(guān)miRNA的研究集中在單一部位的miRNA差異表達(dá)及其意義[8],包括血清miRNA與雄激素釋放、胰島素抵抗、脂代謝異常之間的相關(guān)性，以及顆粒細(xì)胞miRNA與卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞質(zhì)量之間的相關(guān)性[9-11]。本研究將二者結(jié)合，并聯(lián)合輔助生殖技術(shù)，探討血清miRNA對PCOS患者胚胎質(zhì)量及生殖預(yù)后相關(guān)性的研究[12]。

有證據(jù)表明，PCOS合并代謝綜合征的患者，其糖脂代謝紊亂同樣表現(xiàn)在卵泡液中。較高濃度的膽固醇和胰島素可使卵泡液中炎性因子平衡失調(diào)，從而形成慢性炎性反應(yīng)的微環(huán)境，是造成PCOS患者卵母細(xì)胞質(zhì)量下降的重要機(jī)制之一[13]。此外，高雄激素血癥可降低子宮內(nèi)膜的容受性，干擾卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，繼而影響PCOS患者優(yōu)質(zhì)胚胎的形成。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，PCOS患者血清miR-2861表達(dá)下調(diào)，且血清miR-2861表達(dá)水平與空腹胰島素、總膽固醇水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。提示miR-2861不僅參與PCOS發(fā)病，還是PCOS患者出現(xiàn)糖脂代謝紊亂的重要病理機(jī)制。有文獻(xiàn)提示，miR-2861可靶向TSP-1和HDAC5[14-15]，兩者均與糖脂代謝密切相關(guān)[16-17]。miR-2861可能通過多個信號通路參與PCOS糖脂代謝紊亂過程，進(jìn)而抑制卵母細(xì)胞發(fā)育。

本研究結(jié)果顯示，PCOS患者血清和顆粒細(xì)胞中miR-483-3p表達(dá)下調(diào)。這與miR-483-3p在PCOS患者卵丘細(xì)胞中低表達(dá)的研究結(jié)果一致[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，血清中miR-483-3p表達(dá)水平與睪酮、空腹胰島素、低密度脂蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。miR-483-3p可直接靶向胰島素生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)[19]。IGF1能促進(jìn)糖原和脂肪的合成，具有調(diào)節(jié)糖脂平衡的作用[20]。當(dāng)IGF1表達(dá)升高時，體內(nèi)血糖、血脂均可能發(fā)生代謝異常。IGF1還可協(xié)同LH作用于卵泡膜細(xì)胞受體增加雄激素的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，miR-483-3p可能通過IGF1信號通路參與PCOS高雄激素血癥及糖脂代謝紊亂的病理過程，從而抑制卵泡發(fā)育。

胚胎源自精卵的結(jié)合，來自卵母細(xì)胞的母源性基因?qū)υ缙谂咛グl(fā)育具有重要作用[21]。研究顯示，這些母體物質(zhì)大部分是以mRNA和蛋白質(zhì)的形式存在，miRNA則可通過靶向降解mRNA間接調(diào)控早期胚胎的發(fā)育[22]。動物實(shí)驗(yàn)顯示，miRNA不僅廣泛參與卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟的過程，而且miRNA在卵泡的募集、選擇以及閉鎖過程中具有表達(dá)階段特異性[23-24]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PCOS患者顆粒細(xì)胞中miR-2861低表達(dá)與獲卵率、MII卵率、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率呈顯著正相關(guān)，表明miR-2861低表達(dá)可在一定程度上對PCOS患者卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎質(zhì)量產(chǎn)生不利影響，證實(shí)了miR-2861對胚胎質(zhì)量的正性調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，PCOS組血清和顆粒細(xì)胞中miR-483-3p表達(dá)水平與獲卵率、MII卵率、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著正相關(guān)，這與Fischer等[25]動物實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致。miR-483-3p可能通過靶向IGF1抑制人卵巢顆粒細(xì)胞增殖，調(diào)控與細(xì)胞周期阻滯相關(guān)的重要調(diào)控因子，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[19]，進(jìn)而對卵母細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生不利影響。生殖細(xì)胞局部miRNA能調(diào)控配子質(zhì)量及胚胎質(zhì)量，PCOS患者顆粒細(xì)胞中異常表達(dá)miR-2861、miR-483-3p可能使卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，可能對胚胎的繼續(xù)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。

顆粒細(xì)胞中miR-2861、miR-483-3p表達(dá)與卵母細(xì)胞質(zhì)量密切相關(guān)，但標(biāo)本較難獲得，外周血miRNA具有數(shù)量眾多、存在穩(wěn)定、具備抗核酸酶活性及易檢測等生理特性，可成為無創(chuàng)性生物診斷標(biāo)記物。本研究對血清與顆粒細(xì)胞中miR-2861、miR-483-3p表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)miR-2861、miR-483-3p在上述兩部位中的表達(dá)水平具有顯著相關(guān)性，且均與卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎質(zhì)量密切相關(guān)。提示血清中miR-2861、miR-483-3p可在一定程度上反映卵巢基礎(chǔ)狀態(tài)，提示通過檢測血清中miR-2861及miR-483-3p表達(dá)水平可間接預(yù)測PCOS患者卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛能。

目前，miRNA對生殖細(xì)胞及胚胎發(fā)育潛能作用的具體調(diào)控機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)認(rèn)識仍不清楚，有待對miR-2861、miR-483-3p介導(dǎo)糖脂代謝紊亂以及高雄激素血癥的相關(guān)信號傳導(dǎo)通路做深入系統(tǒng)的研究，以有助于我們更全面且深入地了解PCOS卵巢功能障礙的機(jī)制，進(jìn)而有效、精準(zhǔn)地預(yù)測患者的生殖預(yù)后。