吳海波 張 麒 邱 碩 黎冬梅 張茵茵 江 龍

(1.北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院， 欽州 535011； 2.北部灣大學(xué)欽州市特色果蔬發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 欽州 535011；3.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院， 南寧 530004； 4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

豆乳是大豆經(jīng)浸泡、磨漿、過(guò)濾、煮漿、均質(zhì)等工藝制備而成的植物蛋白基液體飲料，其保留了大豆中的主要營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、異黃酮、多酚、皀苷、低聚糖等[1-2]，使其具有抗氧化、降血壓、降低膽固醇、預(yù)防心臟病等功能作用[3-4]，且豆乳中不含膽固醇和乳糖[5]，因此一直以來(lái)深受消費(fèi)者喜歡。

作為乳液體系，豆乳易出現(xiàn)脂肪上浮、蛋白沉淀等物理不穩(wěn)定現(xiàn)象，從而導(dǎo)致品質(zhì)下降。大豆蛋白不僅是豆乳的主要營(yíng)養(yǎng)成分之一，而且對(duì)豆乳的乳化性和物理穩(wěn)定性有重要作用[6]。按沉降速率不同，大豆蛋白分為2S、7S、11S和15S共4個(gè)組分。其中11S(大豆球蛋白)和7S(β-伴大豆球蛋白)是大豆蛋白中主要的兩種組分，占總蛋白的70%左右，決定大豆蛋白的主要功能性質(zhì)[7]。11S球蛋白是一個(gè)六聚體，它由6個(gè)酸性亞基和5個(gè)堿性亞基組成，各酸性和堿性亞基間通過(guò)二硫鍵連接[6,8]。7S球蛋白是一個(gè)三聚體的糖蛋白，由α′、α和β共3個(gè)亞基組成，各亞基間通過(guò)疏水作用結(jié)合[9-11]。由于11S和7S球蛋白結(jié)構(gòu)、氨基酸組成的不同，二者在功能性質(zhì)和加工特性方面存在許多差異，導(dǎo)致不同7S/11S比例組成的大豆蛋白功能性質(zhì)的不同[7,10-14]。11S球蛋白含有較多疏水性氨基酸，熱變性溫度高，受熱后發(fā)生強(qiáng)烈聚集，形成可溶性或不溶性聚集體；7S球蛋白中疏水性氨基酸含量和熱變性溫度均低于11S球蛋白，受熱后盡管發(fā)生聚集，但聚集程度低，形成可溶性聚集體[7,10-12]。豆乳是由大豆中的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽等與水共同乳化形成的膠體體系，其中起乳化作用的主要物質(zhì)是蛋白質(zhì)，因此原料中7S、11S含量會(huì)影響豆乳的理化性質(zhì)。另外，廣泛存在于普通大豆品種中的脂氧酶不僅會(huì)使豆乳產(chǎn)生豆腥味[15-16]，而且還會(huì)促使大豆蛋白發(fā)生聚集[17-18]，因此可以推測(cè)原料中脂氧酶的存在或缺失可能會(huì)引起豆乳理化性質(zhì)的差異。但目前更多的豆乳研究主要集中于加工工藝對(duì)豆乳品質(zhì)的影響，如煮漿溫度和煮漿方式[19-21]、均質(zhì)條件等[19-20,22]，而對(duì)于原料大豆中蛋白組分不同，特別是蛋白組分缺失對(duì)豆乳理化性質(zhì)影響的研究較少。盡管目前有部分關(guān)于7S、11S大豆蛋白功能性質(zhì)的研究[7,10,23-24]，但不同于簡(jiǎn)單的純品蛋白溶液，豆乳成分復(fù)雜，除蛋白外，還含有脂肪、無(wú)機(jī)鹽、碳水化合物等，這些成分在均質(zhì)、加熱等豆乳加工過(guò)程中彼此相互作用，共同影響豆乳品質(zhì)，因此不能單純地用蛋白性能推測(cè)豆乳性質(zhì)。近些年一些特殊大豆品種，如7S球蛋白缺失型、脂氧酶缺失型大豆品種的培育和種植，為豆乳生產(chǎn)提供了更豐富的原料來(lái)源，但目前針對(duì)這些組分缺失型原料豆乳的研究常局限于風(fēng)味的測(cè)試而非理化性能研究[15-16]，從而限制了這些大豆品種作為食品專(zhuān)用原料的應(yīng)用與推廣。

本文分別采用7S球蛋白缺失型大豆品種東富2、脂氧酶缺失型大豆品種東富3為原料制備豆乳，同時(shí)以普通大豆品種黑農(nóng)64為對(duì)照，分別考察均質(zhì)、加熱處理對(duì)3種豆乳理化性質(zhì)的影響，從而明晰東富2、東富3豆乳在加工過(guò)程中的性質(zhì)變化，為選擇適宜商業(yè)豆乳加工的大豆品種和針對(duì)特殊蛋白組成原料大豆制定適宜的豆乳加工條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)原料

東富2(7S球蛋白缺失型)大豆、東富3(脂氧酶完全缺失型)大豆由黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院提供，黑農(nóng)64大豆由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

十二烷基硫酸鈉(SDS)，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、甘氨酸、β-巰基乙醇、丙烯酰胺、N，N′-甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、過(guò)硫酸銨(AP)、考馬斯亮藍(lán)R-250、5，5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)、蛋白Marker，北京索萊寶科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)，Sigma公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器

九陽(yáng)Y917型破壁料理機(jī)，中國(guó)九陽(yáng)股份有限公司；DYCZ-24EN型雙垂直電泳儀，北京六一公司；TU-1901型雙光束紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Kjeltec 8400型全自動(dòng)定氮儀，丹麥福斯分析儀器公司；哈克MARSⅢ型流變儀，德國(guó)哈克公司；Zetasizer Nano-ZS型納米粒度電位儀，英國(guó)馬爾文公司；F-4500型熒光分光光度計(jì)，日本HITACHI公司；V10i型激光共聚焦顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大豆原料中基本成分測(cè)定

蛋白含量測(cè)定參照GB 5009.5—2016；脂肪含量測(cè)定參照GB 5009.6—2016；含水率測(cè)定參照GB 5009.3—2016；灰分含量測(cè)定參照GB 5009.4—2016。

1.2.2大豆分離蛋白提取

參照文獻(xiàn)[25]方法并稍作修改。將大豆粉碎、過(guò)篩，并經(jīng)正己烷脫脂，得到的脫脂豆粉按液料比10 mL/g溶于水中，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至8.5，攪拌1 h，10 000 r/min離心20 min，取上清液，然后用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5，靜止放置30 min后10 000 r/min離心10 min，收集到的沉淀水洗3次后，溶于少量水中用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0。預(yù)凍后進(jìn)行冷凍干燥得到大豆分離蛋白(SPI)，用于蛋白組成成分分析。

1.2.3大豆蛋白組成成分測(cè)定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)實(shí)驗(yàn)分析大豆原料中蛋白組成。參照文獻(xiàn)[26]并稍作修改，濃縮膠和分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%和12%，將1.2.2節(jié)提取的大豆蛋白溶解于緩沖溶液中(1% SDS，2%的β-巰基乙醇，5%甘油，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液，0.02%溴酚藍(lán))制成1 mg/mL蛋白樣品溶液，煮沸5 min后上樣，上樣量為5 μL，當(dāng)?shù)鞍讟悠肺挥跐饪s膠時(shí)電壓為80 V，樣品運(yùn)動(dòng)至分離膠時(shí)電壓調(diào)至120 V。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250充分染色，徹底脫色后，用Image Lab軟件進(jìn)行掃描，分析蛋白中各亞基組分的相對(duì)含量。

1.2.4生豆乳制備

參照文獻(xiàn)[6]稍作修改，將各品種大豆用10倍水浸泡12 h后，過(guò)濾多余水分，計(jì)算大豆所吸水量，按液料比23 mL/g添加額外所需的豆乳制備用水量，然后用破壁機(jī)粉碎4 min，經(jīng)紗布過(guò)濾3次制得生豆乳。

1.2.5豆乳均質(zhì)處理

將1.2.4節(jié)制備的生豆乳在80 MPa壓力條件下均質(zhì)1次[19]。

1.2.6豆乳加熱處理

參照文獻(xiàn)[27]稍作修改，將1.2.4節(jié)制備的生豆乳95℃水浴加熱25 min后，立即置于冰水中冷卻至室溫(20℃)。

1.2.7豆乳蛋白溶解度測(cè)定

參照文獻(xiàn)[20]稍作修改。將豆乳在25℃、10 000 r/min離心10 min。采用凱氏定氮法測(cè)定上清液中蛋白含量和豆乳中總蛋白含量，豆乳蛋白溶解度計(jì)算公式為

S=P1/P×100%

(1)

式中S——蛋白溶解度，%

P1——上清液中溶解的蛋白質(zhì)量，g

P——豆乳樣品中總蛋白質(zhì)量，g

1.2.8豆乳粒徑測(cè)定

參照文獻(xiàn)[28]方法并稍作修改，將豆乳用去離子水稀釋300倍，利用納米粒度電位儀測(cè)定豆乳粒徑分布與平均粒徑，其中蛋白折射率為1.451，水折射率為1.330。

1.2.9豆乳濁度測(cè)定

參照文獻(xiàn)[29]方法并稍作修改，將豆乳用去離子水稀釋40倍，采用紫外分光光度計(jì)于600 nm處測(cè)吸光度。濁度計(jì)算公式為

T=1.302VA600/I

(2)

式中T——濁度，cm-1

V——稀釋倍數(shù)

A600——豆乳樣品稀釋液在600 nm處的吸光度

I——光程差，取1 cm

1.2.10游離巰基含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[30]的Ellman試劑法。將豆乳稀釋至蛋白質(zhì)量濃度1 mg/mL，取1 mL豆乳稀釋液，加4 mL的Tris-甘氨酸緩沖液(0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、4 mmol/L EDTA，pH值8.0)和0.05 mL的DTNB試劑(4 mg/mL)，25℃條件下反應(yīng)15 min，采用紫外分光光度計(jì)在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以不加DTNB的豆乳樣品為空白，豆乳中游離巰基含量計(jì)算公式為

F=73.53DA412/C

(3)

式中F——游離巰基質(zhì)量摩爾濃度，μmol/g

D——豆乳樣品稀釋系數(shù)

A412——加DTNB豆乳樣品與不加DTNB豆乳樣品在412 nm處吸光度差值

C——豆乳樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL

1.2.11豆乳流變性質(zhì)測(cè)定

參照文獻(xiàn)[27]方法并稍作修改，采用旋轉(zhuǎn)流變儀測(cè)定豆乳流變性質(zhì)。將適量豆乳置于流變儀測(cè)試臺(tái)上，測(cè)試溫度為25℃，測(cè)量平盤(pán)直徑35 mm，夾縫間隙1 mm，考察豆乳樣品在剪切速率10～250 s-1條件下的流變特性。

1.2.12豆乳物理穩(wěn)定性測(cè)定

豆乳的物理穩(wěn)定性用離心沉淀率表達(dá)。具體測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[22]，取50 mL豆乳置于離心管中，3 000 r/min離心45 min，倒出上清液，稱(chēng)取沉淀物質(zhì)量，離心沉淀率計(jì)算公式為

W=M1/M×100%

(4)

式中W——離心沉淀率，%

M1——離心后獲得沉淀的質(zhì)量，g

M——離心前豆乳樣品總質(zhì)量，g

1.2.13豆乳微觀(guān)結(jié)構(gòu)

參照文獻(xiàn)[29]方法，25℃條件下，采用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察豆乳微觀(guān)結(jié)構(gòu)，各取20 μL尼羅紅異丙醇染色液(1 mg/mL)和尼羅藍(lán)異丙醇染色液(10 mg/mL)加入0.5 mL豆乳樣品中，漩渦振蕩混合5 s后，染色30 min，取20 μL染色豆乳樣品置于載玻片上，表面覆上蓋玻片，并用甘油密封，在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)633 nm條件下，采用油鏡放大60倍觀(guān)察豆乳微觀(guān)結(jié)構(gòu)。

1.2.14數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果表示為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(p<0.05)，采用Origin Pro 2019軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料大豆基本組成成分

表1顯示3種大豆中的蛋白質(zhì)、脂肪、水分、灰分含量均存在差異，3種大豆中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在36%～41%之間，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)在21%～26%之間，其中缺失脂氧酶的東富3大豆蛋白質(zhì)含量最高，而缺失7S球蛋白的東富2大豆脂肪含量最低。

表1 原料大豆的基本成分

2.2 原料大豆中蛋白成分組成

3個(gè)品種的大豆分離蛋白SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，圖中M代表蛋白Marker，DF2代表東富2大豆蛋白，DF3代表東富3大豆蛋白，64代表黑農(nóng)64大豆蛋白，LOX代表脂肪氧化酶。東富2為缺失7S球蛋白型大豆，可能是電泳上樣時(shí)受到其他樣品輕度污染的緣故，導(dǎo)致7S的α′、α亞基條帶輕微出現(xiàn)，但11S的A、B亞基條帶顏色很深；東富3為脂氧酶缺失型大豆，因此其蛋白電泳圖中無(wú)脂肪氧化酶條帶；正常大豆品種黑農(nóng)64分離蛋白中脂氧酶、7S和11S各亞基條帶都完整存在于電泳圖中。通過(guò)Image Lab軟件掃描分析蛋白各亞基組分含量，并計(jì)算各品種大豆蛋白中7S和11S球蛋白的含量。結(jié)果顯示東富2大豆11S球蛋白含量在3個(gè)品種中最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為87.69%，東富3大豆中7S、11S球蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為40.05%、59.95%，正常品種黑農(nóng)64大豆中7S、11S球蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為27.60%、72.40%，可以看出東富3大豆中7S球蛋白含量和7S/11S比明顯高于黑農(nóng)64。

2.3 均質(zhì)、加熱對(duì)豆乳理化特性的影響

2.3.1蛋白溶解度

豆乳中蛋白溶解度是蛋白質(zhì)水合能力的重要體現(xiàn)，蛋白質(zhì)水合作用越強(qiáng)其溶解度越大。同時(shí)豆乳中蛋白溶解度還受豆乳加工過(guò)程中壓力、溫度、pH值等因素影響[20,31]。

圖2(圖中不同大寫(xiě)字母表示相同處理?xiàng)l件下不同品種豆乳數(shù)值間差異顯著(p<0.05)，不同小寫(xiě)字母表示不同處理?xiàng)l件下同一品種豆乳數(shù)值間差異顯著(p<0.05)，下同)顯示盡管磨漿時(shí)3種大豆原料中液料比一致，但生豆乳中蛋白溶解度在品種間仍存在顯著差異(p<0.05)，說(shuō)明原料蛋白組成差異會(huì)影響生豆乳中蛋白溶解程度。本實(shí)驗(yàn)中脂氧酶缺失型東富3生豆乳蛋白溶解度在3種豆乳中最高，缺失7S的東富2 生豆乳蛋白溶解度低于正常大豆品種黑農(nóng)64生豆乳，為45.6%。7S球蛋白為具有柔性結(jié)構(gòu)的三聚體糖蛋白，蛋白分子中含有5%的碳水化合物基團(tuán)，這使7S易與水分子結(jié)合，具有更好的溶解性[32]。研究顯示脂氧酶可促進(jìn)蛋白分子間形成二硫鍵或非共價(jià)鍵，導(dǎo)致蛋白聚集生成較大尺寸的蛋白粒子[17-18]，東富3由于脂氧酶缺失和7S蛋白含量較高，其生豆乳中蛋白不易聚集，粒子尺寸小，溶解度測(cè)定時(shí)高速離心條件下蛋白不易沉降，因此蛋白溶解度高于黑農(nóng)64生豆乳。11S大豆球蛋白為具有致密空間結(jié)構(gòu)、不含糖基的六聚體蛋白，分子結(jié)構(gòu)柔性差，且含較多疏水性氨基酸，親水性弱，分子間易自聚形成大的聚集體，溶解度低于7S球蛋白[6,33-34]，因此東富2生豆乳蛋白溶解度最低。文獻(xiàn)[34]發(fā)現(xiàn)從7S含量高的豆粕中提取的可溶性蛋白含量高于7S含量低的豆粕，文獻(xiàn)[35]發(fā)現(xiàn)脂氧酶缺失型大豆中可溶性蛋白含量明顯高于正常大豆品種(p<0.05)，與本研究結(jié)論一致。

與生豆乳相比，均質(zhì)后3種豆乳的蛋白質(zhì)溶解度均顯著增加(p<0.05)，東富2、東富3、黑農(nóng)64豆乳蛋白溶解度分別提高了8.8%、35.4%、35.5%。由于均質(zhì)產(chǎn)生的高速剪切、空穴、渦旋作用破壞了蛋白分子結(jié)構(gòu)和分子間/內(nèi)作用力，使蛋白分子內(nèi)部極性基團(tuán)暴露于表面，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子與水分子的作用，蛋白質(zhì)水合能力增強(qiáng)[20,36]；同時(shí)均質(zhì)將大尺寸蛋白粒子破壞成小尺寸粒子，蛋白分散性、均一性得到改善，因此均質(zhì)后豆乳蛋白溶解度提升，這與前人研究結(jié)果一致[32,37]。均質(zhì)后東富2豆乳蛋白溶解度增加幅度最低，僅增加了8.8%。較與7S球蛋白，11S球蛋白具有更為致密的剛性分子結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)/間含有更多二硫鍵，均質(zhì)作用力盡管對(duì)導(dǎo)致蛋白聚集的疏水作用具有較強(qiáng)破壞力，但對(duì)11S球蛋白的剛性結(jié)構(gòu)和二硫鍵的破壞程度低[20,37]，導(dǎo)致均質(zhì)后11S球蛋白水合能力提升有限，因此東富2豆乳蛋白溶解度增加幅度較小。

加熱處理后，3種豆乳蛋白質(zhì)溶解度均顯著增加(p<0.05)，增加了54.0%～80.5%，高于各均質(zhì)處理后豆乳，其中東富3豆乳蛋白溶解度最高，東富2豆乳蛋白溶解度最低。加熱使生豆乳中天然大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，形成可溶性蛋白聚集體，提升了豆乳中可溶性蛋白含量[6,38]，另外加熱導(dǎo)致天然大豆蛋白分子去折疊，肽鏈伸展，原本包埋在分子內(nèi)部的大量極性和疏水性基團(tuán)暴露于分子表面，增強(qiáng)了蛋白分子與水分子、油脂間的相互作用，因此受熱后豆乳蛋白溶解度提高[39-41]。文獻(xiàn)[6]發(fā)現(xiàn)，生豆乳95～100℃受熱7 min后8 000 r/min離心30 min，上清液中蛋白含量顯著高于未加熱前生豆乳上清液中蛋白含量，這與本研究結(jié)論一致。盡管受熱后東富2豆乳蛋白溶解度仍然最低，但較與加熱前蛋白溶解度增加幅度在3種豆乳中最大，增加了80.5%。11S球蛋白比7S球蛋白分子含有更多的疏水性氨基酸，受熱后11S蛋白原本致密的剛性分子結(jié)構(gòu)被破壞，更多的疏水基團(tuán)和極性基團(tuán)暴露于分子表面，親水/親油平衡能力提升[7,10]，并且受熱后11S球蛋白更易形成二硫鍵發(fā)生分子交聯(lián)生成比7S球蛋白更致密的網(wǎng)狀水凝膠結(jié)構(gòu)[14,23,42-43]，提高了蛋白粒子抗重力能力，因此加熱后東富2豆乳蛋白溶解度上升幅度更大。以上結(jié)果顯示原料蛋白組成不僅影響生豆乳中蛋白溶解度也同樣影響熟豆乳蛋白溶解度。

2.3.2豆乳粒徑

豆乳屬于不穩(wěn)定的膠體體系，乳液粒徑分布和平均粒徑是評(píng)價(jià)豆乳蛋白聚集程度和乳液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。

由圖3a和圖4可知東富2、東富3生豆乳粒徑分布和平均粒徑與普通大豆黑農(nóng)64生豆乳存在較大差異。3種生豆乳粒徑分布曲線(xiàn)均呈單峰，其中東富3生豆乳粒徑分布曲線(xiàn)位于圖3a最左側(cè)，平均粒徑最小(248 nm)，東富2生豆乳粒徑分布曲線(xiàn)位于圖3a最右側(cè)，平均粒徑最大(449 nm)。文獻(xiàn)[13]將天然11S與7S球蛋白按不同比例混合制備乳液，結(jié)果顯示隨11S比例的增加乳液粒徑分布曲線(xiàn)不斷右移，平均粒徑增大，乳液絮凝及聚結(jié)行為加劇，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。11S球蛋白分子中疏水基團(tuán)多，親水基團(tuán)少，在中性水溶液中分子間易通過(guò)疏水作用自聚形成較大尺寸的聚集體，由于大尺寸聚集體的空間位阻作用以及11S蛋白的剛性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其不能很好地吸附于油水界面處覆蓋油滴[37]，油滴間易聚結(jié)，因此東富2生豆乳粒徑較大；而7S球蛋白含有較多親水基團(tuán)，在中性水溶液中具有良好的溶解性和分散性，同時(shí)由于其靈活的柔性結(jié)構(gòu)，易于吸附在油水界面處，降低界面張力[37]，抑制油滴間聚結(jié)，因此含有7S的黑農(nóng)64和東富3生豆乳粒徑小于東富2；東富3生豆乳平均粒徑顯著小于黑農(nóng)64生豆乳(p<0.05)，這與東富3原料中較高的7S含量以及脂氧酶的缺失有關(guān)。相關(guān)研究證實(shí)脂氧酶能夠促進(jìn)蛋白分子間通過(guò)二硫鍵、非共價(jià)鍵生成較大尺寸的蛋白聚集體[17,44]。文獻(xiàn)[18]認(rèn)為脂氧酶能促進(jìn)蛋白與亞油酸反應(yīng)，蛋白分子伸展暴露出更多疏水基團(tuán)，使蛋白分子間通過(guò)疏水作用、靜電作用或氫鍵等非共價(jià)鍵生成更大的聚集體，導(dǎo)致乳液濁度和平均粒徑的增加，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

均質(zhì)后3種豆乳粒徑分布曲線(xiàn)均左移(圖3b)，說(shuō)明均質(zhì)使豆乳粒徑尺寸降低，這與前人研究結(jié)果一致[20,36]。均質(zhì)產(chǎn)生的空穴、碰撞、剪切作用力破壞了蛋白分子間的疏水作用，使豆乳中大的蛋白聚集體、油滴以及其他聚集體細(xì)?；Ｗ拥姆稚⑿?、均一性得到改善[45]。均質(zhì)后各品種豆乳平均粒徑大小排序與生豆乳一致，均質(zhì)后盡管東富2豆乳平均粒徑仍然最大，但較與均質(zhì)前平均粒徑下降幅度在所有豆乳中最高，與東富3和黑農(nóng)64豆乳平均粒徑差距縮小(圖4)。如前述東富2生豆乳中僅含11S大豆球蛋白，蛋白分子間更易通過(guò)疏水作用自聚形成大尺寸聚集體，因此在均質(zhì)作用下東富2豆乳粒徑下降幅度更大。上述結(jié)果顯示均質(zhì)縮小了由原料蛋白組成不同導(dǎo)致的豆乳粒徑差距。

加熱對(duì)3種豆乳粒徑均具有較大影響，受熱后，3種豆乳粒徑體積分布峰均向右移動(dòng)(圖3c)，平均粒徑顯著增大(p<0.05)(圖4)，說(shuō)明加熱后豆乳中蛋白質(zhì)與油脂發(fā)生聚集，形成較大尺寸的熱聚集體，這與多人研究結(jié)論一致[42,46]。加熱后，東富2豆乳平均粒徑增加幅度最大，增加了67.6%，而東富3豆乳平均粒徑增加幅度最小，僅為13.2%，顯著低于普通品種黑農(nóng)64豆乳(p<0.05)。豆乳高溫加熱時(shí)蛋白分子間/內(nèi)二硫鍵發(fā)生斷裂，生成巰基，隨著加熱的持續(xù)，蛋白分子間再次通過(guò)氧化巰基基團(tuán)形成二硫鍵而發(fā)生聚集；同時(shí)由于加熱破壞了蛋白分子結(jié)構(gòu)，原本包埋于蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于分子表面，蛋白表面疏水性增強(qiáng)，通過(guò)二硫鍵、疏水作用，蛋白-蛋白、蛋白-油體、油體-油體間發(fā)生聚合，形成蛋白聚集體、脂質(zhì)體、蛋白-脂質(zhì)體聚合物，導(dǎo)致豆乳粒徑增大[42,47]。由于11S球蛋白比7S球蛋白含有更多的疏水氨基酸和二硫鍵，因此受熱時(shí)比7S蛋白更快速地發(fā)生聚集，生成熱聚集體，且由于11S球蛋白分子中親水基團(tuán)的缺乏，導(dǎo)致蛋白聚集體間靜電斥力小，彼此間不斷再聚集生成更大的聚集體[48-49]，因此受熱后東富2豆乳平均粒徑增加幅度高于其他品種。7S球蛋白分子中含有較多親水基團(tuán)，11S與7S共同受熱時(shí)彼此發(fā)生聚集，7S蛋白的親水基團(tuán)覆蓋于11S蛋白分子表面，為聚集體提供強(qiáng)大的靜電斥力屏障，抑制了聚集體間的再聚集[10]，即7S具有抑制11S熱聚集的能力，且隨7S含量的增加抑制能力增強(qiáng)，因此東富3和黑農(nóng)64豆乳受熱后平均粒徑增長(zhǎng)幅度均小于東富2。盡管在本實(shí)驗(yàn)加熱條件下脂氧酶基本全部失活(脂氧酶熱變性溫度69～74℃)[50]，但受熱后東富3豆乳平均粒徑遠(yuǎn)小于黑農(nóng)64豆乳，這與東富3豆乳中較高的7S/11S比使其具有更強(qiáng)的抑制蛋白熱聚集能力有關(guān)。

文獻(xiàn)[51-52]顯示豆乳受熱后粒徑明顯下降，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，主要原因是豆乳加熱條件(95～100℃，加熱5 min)與本實(shí)驗(yàn)(95℃，加熱25 min)不同，文獻(xiàn)[51-52]實(shí)驗(yàn)由于受熱時(shí)間短，豆乳中形成的小分子蛋白聚集體還未再次發(fā)生聚集，加熱即停止，因此受熱后豆乳粒徑降低。對(duì)比分析可以看出受熱時(shí)間對(duì)豆乳粒徑具有較大影響，但豆乳中含有較多抗?fàn)I養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制劑、植物紅細(xì)胞凝集素、脲酶等熱敏性抗?fàn)I養(yǎng)因子，需要保證一定時(shí)間的高溫加熱才能使其充分失活；另外，為消滅豆乳中致病菌和腐敗菌以及提高蛋白質(zhì)消化吸收利用率也需要高溫長(zhǎng)時(shí)加熱[6]。

2.3.3濁度

濁度是表征蛋白聚集程度和乳液穩(wěn)定性的另一重要指標(biāo)，蛋白聚集程度、平均粒徑與濁度呈正比例關(guān)系，蛋白聚集程度越深，平均粒徑越大，體系濁度越高[29]。

圖5顯示生豆乳中東富2生豆乳濁度最大，東富3生豆乳濁度最小。東富3生豆乳粒徑均一細(xì)小，蛋白溶解度、分散性好，因此具有較低的乳液濁度，而東富2生豆乳由于較大的粒徑，乳液吸光度上升，乳液濁度最大。與生豆乳相比，均質(zhì)后各品種豆乳濁度均顯著降低(p<0.05)。均質(zhì)將豆乳中的可溶性物質(zhì)均勻細(xì)化，大顆粒物質(zhì)破碎成小顆粒物質(zhì)，豆乳粒徑降低，因此乳液透光度更好。盡管均質(zhì)后東富2豆乳濁度仍然最高，但較與均質(zhì)前，其濁度下降幅度大于其他品種，這與均質(zhì)更大程度降低了東富2豆乳粒徑有關(guān)(見(jiàn)2.3.2節(jié)結(jié)果)。加熱后東富2和黑農(nóng)64豆乳濁度明顯上升(p<0.05)，而東富3豆乳濁度變化不顯著(p>0.05)。7S與11S 蛋白受熱期間不同的熱聚集行為導(dǎo)致各品種豆乳受熱后濁度的變化差異。11S球蛋白受熱時(shí)更高的聚集程度導(dǎo)致生成更大粒徑的聚集體，因此東富2豆乳受熱后吸光度增強(qiáng)，濁度顯著上升(p<0.05)。東富3豆乳中較高的7S/11S比使其蛋白熱聚集程度低，豆乳受熱后粒徑增加幅度小，因此加熱前后豆乳濁度變化不顯著(p>0.05)。

盡管豆乳濁度還受豆乳中碳水化合物以及其他可溶性物質(zhì)影響，但在本實(shí)驗(yàn)中豆乳濁度仍體現(xiàn)出與蛋白聚集程度較強(qiáng)的規(guī)律性，說(shuō)明原料大豆蛋白組成對(duì)豆乳濁度有決定性影響，特別是一些蛋白組分缺失型品種。

2.3.4游離巰基含量

游離巰基對(duì)蛋白質(zhì)界面行為和乳化性質(zhì)具有重要影響，能夠改善蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)柔性，提升乳液穩(wěn)定性[37]。由巰基基團(tuán)(—SH)形成的二硫鍵(S—S)是維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的重要化學(xué)鍵，而且?guī)€基與二硫鍵在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)換[44]。

由圖6可知，生豆乳中東富3生豆乳的游離巰基含量最高，質(zhì)量摩爾濃度為3.41 μmol/g；東富2生豆乳中游離巰基含量低于黑農(nóng)64生豆乳，質(zhì)量摩爾濃度為1.34 μmol/g。研究顯示大豆蛋白中巰基基團(tuán)降解與脂氧酶活性密切相關(guān)，大豆磨漿制備豆乳過(guò)程中脂氧酶會(huì)促進(jìn)巰基降解，導(dǎo)致游離巰基含量下降[18,44]，因此缺失脂氧酶的東富3生豆乳中含有更多的游離巰基。

3種豆乳均質(zhì)后游離巰基含量均顯著增加(p<0.05)，增加了17.9%～23.9%(圖6)。一方面，均質(zhì)的高速剪切和渦旋作用破壞了蛋白分子高級(jí)結(jié)構(gòu)，肽鏈?zhǔn)嬲?，原本埋藏在蛋白分子?nèi)部的巰基基團(tuán)暴露出來(lái)；另一方面，均質(zhì)作用下維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的部分二硫鍵被切斷，S—S轉(zhuǎn)化為—SH，導(dǎo)致均質(zhì)后豆乳中游離巰基含量增加。

熱處理后所有豆乳游離巰基含量均不同程度降低，這與文獻(xiàn)[53-54]研究結(jié)果一致。高溫受熱時(shí)豆乳中的游離巰基受熱氧化生成二硫鍵，導(dǎo)致游離巰基含量下降。加熱后盡管東富3豆乳中游離巰基含量仍最高，但降低幅度卻最大，這與東富3生豆乳中含有更多的游離巰基有關(guān)，使其加熱后更易發(fā)生—SH/S—S轉(zhuǎn)化。

2.3.5流變性質(zhì)

豆乳的流變性質(zhì)與蛋白質(zhì)水合作用密切相關(guān)，同時(shí)還受蛋白分子間作用力、蛋白聚集程度、粒徑、粒子含量、豆乳微觀(guān)結(jié)構(gòu)等因素影響[21]。

圖7a顯示，在本實(shí)驗(yàn)任何剪切速率下東富3生豆乳的表觀(guān)粘度均低于東富2和黑農(nóng)64生豆乳，而東富2生豆乳的表觀(guān)粘度均高于黑農(nóng)64生豆乳。11S球蛋白含有較多疏水氨基酸，室溫條件下也存在較強(qiáng)的自聚行為，形成大尺寸聚集體，占用更多空間，導(dǎo)致分子運(yùn)動(dòng)阻力增強(qiáng)[6,37,41]，因此東富2生豆乳粘度最高；東富3原料大豆中脂氧酶的缺失和較高的7S含量，使其生豆乳粒徑小，粒子分散性好，因此粘度低于黑農(nóng)64生豆乳。

均質(zhì)后3種豆乳各剪切速率下的表觀(guān)粘度均降低(圖7b)。均質(zhì)破壞了蛋白分子間疏水作用及部分二硫鍵，降低了豆乳中蛋白、脂質(zhì)體的聚集程度，豆乳粒徑減小，因此粘度下降。受熱后所有豆乳各剪切速率下的表觀(guān)粘度均高于未加熱前(圖7c)。豆乳受熱時(shí)蛋白分子結(jié)構(gòu)改變，蛋白水合能力和表面疏水性提高，蛋白與水分子、蛋白與蛋白以及蛋白與油脂間的相互作用增強(qiáng)，形成大的聚集體，導(dǎo)致豆乳粘度上升[39,40-41,55]；另外，豆乳受熱時(shí)蛋白分子間形成二硫鍵或通過(guò)疏水作用發(fā)生交聯(lián)和聚集，形成弱的網(wǎng)狀水凝膠結(jié)構(gòu)，束縛了水分子及其他粒子的運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)了流體阻力[23,42-43,55]，這是豆乳粘度增加的另一重要原因。較與7S球蛋白，11S球蛋白受熱時(shí)聚集程度更高，且更易形成二硫鍵發(fā)生分子交聯(lián)生成更加致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[14,23]，因此加熱后東富2豆乳表觀(guān)粘度仍高于東富3和黑農(nóng)64豆乳。東富3豆乳受熱后蛋白聚集程度最低，粒徑最小，因此粘度仍最低。文獻(xiàn)[40]證實(shí)加熱增強(qiáng)了豆乳中蛋白與油脂的交互作用，促進(jìn)了油脂與蛋白粒子的聚集，導(dǎo)致豆乳粘度增大。文獻(xiàn)[41]發(fā)現(xiàn)卵白蛋白加熱后粘度上升，認(rèn)為蛋白粘度變化與受熱后形成的蛋白聚集體尺寸具有密切關(guān)系，更大聚集體的形成會(huì)導(dǎo)致更高的粘度，這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

均質(zhì)、加熱前后的東富2、黑農(nóng)64豆乳在本實(shí)驗(yàn)剪切速率范圍內(nèi)均呈剪切稀化，為非牛頓流體；而均質(zhì)、加熱前后的東富3豆乳在剪切速率150～250 s-1時(shí)乳液粘度基本保持恒定，接近牛頓流體，這與東富3豆乳均質(zhì)、加熱前后均具有較低的聚集程度和較小的粒徑密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中雖然豆乳加熱后粒徑增大，但乳液粘度增加，抑制了粒子間的聚集，使豆乳保持一定的穩(wěn)定性。

2.3.6物理穩(wěn)定性

豆乳的物理不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)為生產(chǎn)和貯存過(guò)程中易發(fā)生脂肪上浮、蛋白沉淀現(xiàn)象，從而影響豆乳品質(zhì)。本研究通過(guò)離心加速沉淀發(fā)生，以離心沉淀率表示豆乳的物理穩(wěn)定性，沉淀率越低意味豆乳的物理穩(wěn)定性越高。

圖8顯示3種生豆乳的離心沉淀率存在顯著差異(p<0.05)，東富2生豆乳的離心沉淀率遠(yuǎn)高于其他2個(gè)品種，達(dá)11.93%，是正常品種黑農(nóng)64生豆乳的2倍多，東富3生豆乳的離心沉淀率最低，僅為1.85%，即生豆乳中東富2生豆乳物理穩(wěn)定性最低，東富3生豆乳穩(wěn)定性最高。Stockes原理證明粒子自然沉降或上浮的速度與粒子直徑有關(guān)，更大直徑的粒子沉降速度更快，更易沉降。蛋白是豆乳固形物中含量最高的成分，其聚集程度是影響豆乳物理穩(wěn)定性的重要因素。由上文實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知由于11S球蛋白的剛性結(jié)構(gòu)和較低的水合能力，東富2生豆乳粒子尺寸大于其他品種，這些粒子在離心時(shí)會(huì)作為核心形成更大的聚集體，導(dǎo)致東富2生豆乳離心沉淀率高于其他品種，而東富3原料大豆中脂氧酶的缺失以及較高的7S球蛋白含量，使其生豆乳中的粒子具有較小的尺寸，因此離心沉淀率顯著低于正常品種黑農(nóng)64生豆乳(p<0.05)。

均質(zhì)后東富2和黑農(nóng)64豆乳離心沉淀率均顯著降低(p<0.05)，分別降低了48.0%和48.4%。由于均質(zhì)破壞了蛋白分子間/內(nèi)作用力(包括疏水作用與二硫鍵)，大的聚集體解離為小分子聚集體，導(dǎo)致豆乳粒徑下降，因此均質(zhì)后東富2和黑農(nóng)64豆乳離心沉淀率降低，物理穩(wěn)定性提升，這與文獻(xiàn)[22]結(jié)果一致。東富3豆乳均質(zhì)前后離心沉淀率無(wú)顯著性差異(p>0.05)，這與東富3豆乳均質(zhì)前后均具有較低的粒子聚集程度和較小的粒徑密切相關(guān)，說(shuō)明東富3豆乳即使不進(jìn)行均質(zhì)也具有較強(qiáng)的物理穩(wěn)定性，對(duì)均質(zhì)工藝的依賴(lài)性減弱。

所有豆乳加熱后離心沉淀率均顯著降低(p<0.05)，降低了34.6%～84.7%。豆乳加熱后粒徑增大，但離心沉淀率卻下降，這與Stockes定律相反。豆乳物理穩(wěn)定性除受粒子聚集程度影響，還受各組分間相互作用以及乳液粘度、乳液微觀(guān)結(jié)構(gòu)等因素影響[42-43]。盡管加熱導(dǎo)致豆乳粒子聚集，粒徑增大，不利于豆乳物理穩(wěn)定性的提升，但加熱提高了蛋白水合能力和表面疏水性，增強(qiáng)了蛋白與水分子、蛋白與油脂、蛋白與蛋白分子間的相互作用；同時(shí)受熱時(shí)蛋白分子通過(guò)疏水作用和二硫鍵彼此聚集形成弱的三維網(wǎng)狀水凝膠結(jié)構(gòu)，乳液粘度上升，豆乳粒子處于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，增加了粒子運(yùn)動(dòng)和沉降所受的粘滯阻力[14,42-43]，因此加熱后豆乳離心沉淀率顯著降低(p<0.05)，物理穩(wěn)定性提升。

盡管加熱后東富3豆乳離心沉淀率仍然最低，但東富2豆乳離心沉淀率較加熱前下降幅度最大，下降了84.7%，小于加熱后的黑農(nóng)64豆乳，這與東富2豆乳中11S球蛋白形成更致密的網(wǎng)狀微凝膠結(jié)構(gòu)和更高的粘度有關(guān)(見(jiàn)2.3.5節(jié)粘度結(jié)果)。較與7S球蛋白，11S球蛋白含有更多的疏水性氨基酸和二硫鍵，熱敏感性更強(qiáng)，受熱時(shí)易在分子間形成更多二硫鍵，導(dǎo)致東富2 豆乳受熱后11S球蛋白分子快速通過(guò)疏水作用和二硫鍵發(fā)生聚集和交聯(lián)，形成更加致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[14,23,42-43]，乳液粘度更高，因此東富2豆乳加熱后離心沉淀率下降幅度更大。加熱后盡管各豆乳離心沉淀率仍存在顯著差異(p<0.05)，但較與加熱前差距縮小，即加熱使原料蛋白組成不同導(dǎo)致的豆乳物理穩(wěn)定性差異縮小。

加熱后各豆乳的離心沉淀率顯著低于均質(zhì)處理豆乳(p<0.05)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中加熱對(duì)豆乳物理穩(wěn)定性的提升效果優(yōu)于均質(zhì)。

2.4 豆乳的微觀(guān)結(jié)構(gòu)

采用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察3種豆乳均質(zhì)、加熱前后的油滴分布情況。圖9中紅色部分為油滴。生豆乳中東富3生豆乳油滴粒徑最小，而東富2生豆乳油滴粒徑明顯大于黑農(nóng)64生豆乳(圖9a～9c)。均質(zhì)后所有豆乳油滴粒徑均減小且粒徑大小均一(圖9d～9f)，各品種豆乳間的油滴粒徑差距縮小。加熱后所有豆乳的油滴粒徑均增大，特別是東富2豆乳中油滴發(fā)生強(qiáng)烈聚集，油滴粒徑明顯大于東富3和黑農(nóng)64豆乳(圖9g～9i)。各品種豆乳均質(zhì)、加熱前后的油滴分布情況與2.3.2節(jié)粒徑結(jié)果一致。

3 結(jié)束語(yǔ)

本文分別考察均質(zhì)和加熱處理對(duì)脂氧酶缺失型大豆品種東富3、7S球蛋白缺失型大豆品種東富2豆乳理化特性的影響，同時(shí)以正常大豆品種黑農(nóng)64為對(duì)照。結(jié)果顯示均質(zhì)和加熱對(duì)3個(gè)品種豆乳理化特性均具有一定提升作用，縮小了由原料蛋白組分不同導(dǎo)致的豆乳理化特性差異，但較與均質(zhì)，加熱對(duì)豆乳物理穩(wěn)定性提升效果更顯著(p<0.05)。東富3豆乳在均質(zhì)、加熱前后都具有比黑農(nóng)64、東富2豆乳更小的粒徑、濁度、離心沉淀率和更高的蛋白溶解度，具有最優(yōu)的物理穩(wěn)定性。盡管均質(zhì)和加熱也會(huì)引起東富3豆乳粒子聚集程度、平均粒徑的減小和增加，但增減程度顯著小于黑農(nóng)64和東富2豆乳，即使在無(wú)均質(zhì)條件下，東富3生豆乳依然具有較小的平均粒徑和較高的物理穩(wěn)定性，表現(xiàn)出對(duì)均質(zhì)工藝較小的依賴(lài)性，這主要?dú)w因于東富3原料中脂氧酶的缺失以及較高的7S/11S比；東富2 豆乳盡管在未均質(zhì)加熱前具有最低的蛋白溶解度，最大的平均粒徑和離心沉淀率，但均質(zhì)后平均粒徑、離心沉淀率均顯著降低(p<0.05)，加熱雖然導(dǎo)致東富2豆乳粒徑顯著增加(p<0.05)，但極大提高了蛋白溶解度和表觀(guān)粘度，使東富2豆乳離心沉淀率降低幅度在3種豆乳中最大，物理穩(wěn)定性?xún)?yōu)于加熱后的黑農(nóng)64豆乳。較與東富3和黑農(nóng)64，東富2豆乳理化性質(zhì)受均質(zhì)、加熱影響更顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示東富3和東富2大豆都適宜作為高品質(zhì)商業(yè)豆乳生產(chǎn)的原料。