靜態(tài)頂空氣相色譜法測定酒中的乙酸乙酯和己酸乙酯

◎ 何 靖，何焜鵬

（1.廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；3.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，廣東 廣州 511442）

中國酒文化源遠(yuǎn)流長，制酒歷史悠久。酒由谷物、水果等發(fā)酵釀制而成[1]，按生產(chǎn)工藝主要分為蒸餾酒、發(fā)酵酒和配制酒。酒的主要成分是乙醇和水，而溶于其中的醇、醛、酸和酯等化合物作為酒的香味物質(zhì)[2]。酯類化合物在酒中具有芳香型，是酒體芳香形成的主要原因[3]。其中乙酸乙酯在各種香型白酒中含量占比大，在白酒香氣成分扮演主要角色。不同酯類含量的高低決定了白酒的香型，如清香型白酒是以乙酸乙酯為主體香味成分的白酒，濃香型白酒的主體香味成分是己酸乙酯，而鳳香型白酒則以乙酸乙酯及己酸乙酯為主體。各白酒的特征香氣成分雖不盡相同，但都由酯類物質(zhì)作為特征香味。

目前測定乙酸乙酯和己酸乙酯主要采用氣相色譜法?，F(xiàn)國標(biāo)《白酒分析方法》（GB/T 10345—2007）中明確了乙酸乙酯和己酸乙酯的分析方法，采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測定；黃偉等[4]采用內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法對白酒中乙酸乙酯含量進(jìn)行了比較；也有文獻(xiàn)探究了紅外光譜組合區(qū)間偏最小二乘法定量白酒中乙酸乙酯的含量[5]。鑒于目標(biāo)化合物沸點低，易揮發(fā)，本文采用靜態(tài)頂空色譜法測定酒中乙酸乙酯和己酸乙酯。酒在釀制過程中除了產(chǎn)生特征香味物質(zhì)[6]還產(chǎn)生不易揮發(fā)物質(zhì)，如氨基酸、維生素、有機酸、肉豆蔻酸、硬脂酸以及棕櫚酸等[7]，頂空進(jìn)樣有利于消除基質(zhì)干擾，減少污染物進(jìn)入色譜系統(tǒng)，且操作簡單，靈敏度高，容易實現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B氣相色譜儀配置FID檢測器（安捷倫科技有限公司）、G1888頂空進(jìn)樣器（安捷倫科技有限公司）、十萬分之一天平（奧豪斯（常州）有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：乙酸乙酯（99.7%，Dr.Ehrenstorfer）、己酸乙酯（100%，CNW），乙醇（色譜純，霍尼韋爾公司），超純水（一級，Milli-Q），實驗中的酒樣均購買于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

40%乙醇溶液：移取200 mL無水乙醇于500 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度線，混勻待用。

95%乙醇溶液：移取95 mL無水乙醇于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度線，混勻待用。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制（5 mg·mL-1）：分別準(zhǔn)確稱量乙酸乙酯、己酸乙酯各0.1 g（精確到0.000 01 g），置于兩個20 mL容量瓶中，用95%乙醇溶液定容至刻度線，搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制：分別準(zhǔn)確吸取乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液和己酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.25 mL和2.50 mL于25 mL容量瓶，用40%乙醇溶液稀釋至刻度線，得到濃度分別為20 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、250 mg·L-1和500 mg·L-1的 標(biāo)準(zhǔn)混合工作曲線。準(zhǔn)確移取5.00 mL于頂空瓶中，壓蓋密封，上機測定。

1.2.2 樣品前處理

將酒樣混勻，從中準(zhǔn)確移取5.00 mL于20 mL頂空瓶，密封頂空瓶蓋，待測。

1.2.3 氣相色譜條件

色譜柱：CP-Wax 57（50 m×0.25 mm×0.2 μm）；柱溫升溫程序：初溫40 ℃保持3 min以5 ℃·min-1的速率上升至100 ℃保留1 min；進(jìn)樣口：溫度200 ℃；進(jìn)樣量1 mL，分流進(jìn)樣，分流比5∶1，分流流量為7.5 mL·min-1；氫火焰離子化檢測器（FID）：溫度300 ℃，氫氣40 mL·min-1，空氣400 mL·min-1，尾吹30 mL·min-1；載氣：高純氮氣，尾吹25 mL·min-1；色譜柱流量1.5 mL·min-1。頂空條件：平衡條件，平衡溫度60 ℃，定量環(huán)溫度70 ℃，傳輸線區(qū)溫度80 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制溶液的選擇

樣品直接上頂空測定，為準(zhǔn)確定量，理論上標(biāo)液所處頂空瓶的基質(zhì)環(huán)境應(yīng)與樣品的基質(zhì)環(huán)境保持相似，因此優(yōu)先選用與樣品酒精度相仿的乙醇溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制。

不同類型的酒酒精度各不相同，葡萄酒酒精度在8%Vol～15%Vol，啤酒酒精度在3%Vol～5%Vol，果味米酒酒精度約10%Vol，大部分白酒酒精度在30%Vol～40%Vol。樣品酒精度范圍廣，配制一條曲線無法覆蓋酒中所有基質(zhì)情況。用乙醇含量低的溶液配制曲線容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，造成乙酸乙酯和己酸乙酯溶解不充分，用乙醇含量過高的溶液配制曲線，與酒樣環(huán)境有差異，造成目標(biāo)化合物在標(biāo)曲和酒樣的溶解和揮發(fā)程度不一致，難以準(zhǔn)確定量。最終選用40%乙醇溶液作為曲線的配制溶液。40%乙醇溶液能充分溶解乙酸乙酯和己酸乙酯，且與大部分酒的基質(zhì)環(huán)境相似，配制出的曲線線性關(guān)系較好，線性系數(shù)均在0.999以上。

2.2 色譜柱的選擇

本方法采用非極性、中極性和強極性色譜柱對乙酸乙酯和己酸乙酯的出峰情況進(jìn)行比對，混標(biāo)配制濃度為100 mg·L-1，分別使用DB-1（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-17（30 m×0.25 mm×0.25 μm）和DB-Wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）3條不同極性色譜柱，在1.2.3的色譜條件下運行100 mg·L-1混標(biāo)標(biāo)點，探究其出峰情況。因乙酸乙酯和己酸乙酯的極性較強，使用非極性色譜柱DB-1和中等極性DB-17得到的目標(biāo)峰峰型較差，不能很好地保留化合物。而DB-Wax極性較強，與乙酸乙酯、己酸乙酯極性相似，能使乙酸乙酯和己酸乙酯得到較強保留和實現(xiàn)分離，因此選用極性色譜柱。

在實際試驗測定白酒的乙酸乙酯、己酸乙酯時，發(fā)現(xiàn)白酒中乙酸乙酯和乙縮醛保留時間幾乎完全重合，采用調(diào)低初溫、減緩升溫速率等方法讓其實現(xiàn)分離，效果不甚理想。選用有更好分離優(yōu)勢的極性色譜柱，發(fā)現(xiàn)使用CP-Wax 57能將乙酸乙酯和乙縮醛分離開，且分離效果較好，目標(biāo)峰峰型對稱尖銳，響應(yīng)值大，使用該柱子得到的目標(biāo)化合物色譜圖見圖1。

圖1 CP-Wax 57測定白酒的氣相色譜圖

2.3 頂空平衡溫度與平衡時間的探究

頂空平衡溫度越高，有機物揮發(fā)程度越高，目標(biāo)化合物含量的增加可以提高響應(yīng)值和儀器靈敏度。由于樣品主要成分是水和乙醇，如果設(shè)置平衡溫度過高，頂空瓶瓶壓升高或樣品沸騰，容易造成頂空瓶內(nèi)氣體泄漏或頂空瓶破裂等情況，故本試驗選取50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃作為平衡溫度，配制100 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)濃度點，控制頂空平衡時間為30 min，檢測被測物質(zhì)的響應(yīng)值，以探究本實驗合適的頂空平衡溫度。測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，被測物響應(yīng)值增大，在60 ℃以后響應(yīng)值增速減緩并趨于穩(wěn)定。由于酯類物質(zhì)沸點較低，為防止爆沸，最終選擇60 ℃作為最優(yōu)平衡溫度。

控制頂空平衡溫度為60 ℃，考察標(biāo)準(zhǔn)濃度點在平衡時間為20 min、30 min、40 min和50 min時被測物響應(yīng)值的大小，用于探究合適的頂空平衡溫度。結(jié)果顯示，隨著平衡時間延長，被測物響應(yīng)增大，當(dāng)平衡時間超過30 min，被測物響應(yīng)值幾乎不再增大，且平衡時間過長可能造成酯類物質(zhì)的熱分解，因此選擇30 min作為平衡時間。

綜上，本方法以平衡溫度60 ℃，頂空平衡30 min作為最優(yōu)頂空條件。

2.4 線性范圍及檢出限

以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，化合物峰面積為縱坐標(biāo)，繪制校正曲線。乙酸乙酯線性回歸方程為Y=0.770 7X+1.074 4，線 性 擬 合R=0.999 96；己酸乙酯線性回歸方程為Y=0.727 9X+3.621 9，線性擬合R=0.999 57。結(jié)果表明乙酸乙酯和己酸乙酯在20～500 mg·L-1線性關(guān)系良好，線性系數(shù)均在0.999以上。逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，以信噪比S/N=3時的濃度為本方法的檢出限，得到乙酸乙酯檢出限為0.8 mg·L-1，己酸乙酯檢出限為1.0 mg·L-1。

2.5 樣品加標(biāo)回收實驗和重復(fù)性實驗

從商場購得多種酒樣，按照1.2方法，在3個不同添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收實驗和精密度實驗，以考察乙酸乙酯和己酸乙酯的加標(biāo)回收率和精密度情況，結(jié)果見表1。平均回收率在93.9%～104.0%，精密度在4.0%以下（n=6）。

表1 不同酒樣不同添加濃度下乙酸乙酯、己酸乙酯的回收率和精密度表（n=6）

2.6 實際樣品測定

從商場購得多種酒樣，能覆蓋到酒的類別盡可能多，按照1.2的方法對樣品進(jìn)行測定。具體結(jié)果見表2。由表2可知，酒中檢出乙酸乙酯含量基本在200 mg·L-1以上。己酸乙酯檢出率較低，只有以己酸乙酯和乙酸乙酯為主體的鳳香型白酒檢出己酸乙酯含量較高，該酒符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14867—2007一級低度鳳香型白酒的限值要求。

表2 不同基質(zhì)的酒乙酸乙酯、己酸乙酯的測定值表

3 結(jié)論

本文采用靜態(tài)頂空進(jìn)樣方式測定各種酒中乙酸乙酯和己酸乙酯含量，對色譜柱的選擇、頂空條件的確定、樣品回收率及穩(wěn)定性等方面進(jìn)行探究。本方法采用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，較《白酒分析方法》（GB/T 10345—2007）中的單點校正的定量更加準(zhǔn)確，且適用范圍廣，不僅限于白酒，還適用于成分復(fù)雜的配制酒、果酒、中藥保健酒等。靜態(tài)頂空進(jìn)樣可以減少各種基質(zhì)中脂類、糖分、蛋白質(zhì)等非揮發(fā)性物質(zhì)對色譜系統(tǒng)的污染，且得到的目標(biāo)化合物在峰寬、峰型、基線平穩(wěn)度等方面更具有優(yōu)勢。本方法目標(biāo)化合物的相關(guān)性良好、檢出限低、樣品的加標(biāo)回收好、精密度好，實驗過程簡單，適用于各種酒中乙酸乙酯、己酸乙酯含量的測定。