除脂固相萃取小柱結(jié)合LC-MS/MS測定豬肉中四環(huán)素類殘留量

◎ 張志輝，孫章敏

（昭通市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 昭通 657000）

長期食用含四環(huán)素類抗生素食物易引發(fā)過敏反應或中毒現(xiàn)象，因此定性定量測定食品中四環(huán)素類殘留對維護食品安全具有重要意義。本實驗采用除脂固相萃取小柱Captiva EMR-Lipid結(jié)合LC-MS/MS在國家標準的方法基礎上進行優(yōu)化改進，探究方法的可行性[1-4]。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-質(zhì)譜儀（AB科技有限公司，AB4500）、超聲波清洗器（江蘇省昆山市淀山湖鎮(zhèn)，KQ5200DB）、氮吹儀(上海安普實驗科技股份有限公司，EFAA-DC24)、冷凍離心機（美國貝克曼公司、ALLEGRAX-30R）、分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，AL204）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI科技有限公司，ROTAVAPORR210）、渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，VOJEX-5）、6 mL Captiva EMR-Lipid和HLB小柱（安捷倫科技有限公司）、0.22 μm有機濾膜、注射器及色譜瓶。

0.2 mg鹽酸四環(huán)素（中國食品藥品檢定研究院）、0.25 g鹽酸多西環(huán)素（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所）、0.2 g鹽酸金霉素（Dr.Ehrenstorfer）和100 μg·mL-1鹽酸土霉素（中國食品藥品檢定研究院）標準物質(zhì)。乙腈（賽默飛世爾科技有限公司）、甲酸（阿拉丁試劑上海有限公司）、甲醇和乙酸乙酯（默克股份有限公司），為色譜純；檸檬酸和磷酸氫二鈉（國藥集團化學試劑有限公司）、乙二胺四乙酸二鈉（四川西陵化工有限公司），為分析純。

1.2 實驗條件

色譜柱-ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）。離子化模式：電噴霧電正離子模式（ESI+）；質(zhì)譜掃描方式：多反映監(jiān)測（MRM）；氣簾氣（CUR）：241.32 kPa；離子化電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；GS1：50 ℃；GS2：50 ℃；進樣量：3 μL；色譜柱流速：0.300 0 mL·min-1。洗脫梯度見表1，質(zhì)譜條件見表2。

表1 洗脫梯度和質(zhì)譜條件表（單位：%）

表2 質(zhì)譜參數(shù)表

1.3 標準溶液配制

稱取標準物質(zhì)：四環(huán)素0.011 00 g、多西環(huán)素0.011 69 g、金霉素0.010 76 g分別于100 mL容量瓶定容得100 μg·mL-1后，各取1 mL定容至10 mL得10 μg·mL-1；取0.5 mL標 液 土 霉 素 定 容 至5 mL得10 μg·mL-1。

上述標液各取2.5 mL于50 mL容量瓶定容得500 ng·mL-1混合標準液。分別取10 μL、20 μL、40 μL、80 μL、120 μL和160 μL，定容到1 mL得5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、40 ng·mL-1、60 ng·mL-1和80 ng·mL-1的梯度標液。

1.4 樣品制備

豬肉攪碎后取2.00 g于50 mL離心管，加20 mL 0.1 moL·L-1EDTA緩沖溶液，振蕩2 min，超聲5 min。取上清液2 mL于離心管中，加入8 mL1%甲酸乙腈混勻，上述溶液經(jīng)Captiva EMR-Lipid小柱過濾至雞心瓶。用2 mL80%乙腈+1%甲酸水沖洗，40 ℃氮吹儀吹至近干。用1 mL乙腈+0.1%甲酸水（1+19）定容，過有機濾膜裝色譜瓶，經(jīng)過LC-MS/MS測定。

空白樣品按照優(yōu)化方法提取后配制基質(zhì)溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗條件選擇

經(jīng)大量實驗，選擇1.4色譜條件。土霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、金霉素分別在2.52 min、2.95 min、2.96 min、3.45 min時出峰。測定空白樣品中無四環(huán)素類抗生素，因此采用外標法進行實驗。

2.2 回收率測定結(jié)果

稱豬肉2.00 g，分別加入500 ng·mL-1的混合標準儲備液20 μL、80 μL、400 μL，按1.4提取方法，在1.4條件下經(jīng)LC-MS/MS檢測。樣品中不含四環(huán)素、多西環(huán)素、金霉素和土霉素殘留，且回收率均在83.8%～97.2%，回收率滿意，詳見表3。

表3 4種四環(huán)素類抗生素回收率表

2.3 檢出限與定量限

選取濃度標樣1 ng·mL-1、5 ng·mL-1連續(xù)測10次，確定基線噪音值（S/N），求平均值，根據(jù)3倍信噪比計算檢出限，10倍信噪比計算定量限。4種四環(huán)素類抗生素檢出限與定量限見表4。

表4 檢出限與定量限表

2.4 精密度

3個測定濃度下重復測定6次，相對標準偏差RSD值為1.274%～4.641%，根據(jù)GB/T 27404—2008可知，精密度良好[5]。4種四環(huán)素類抗生素加標濃度和RSD值見表5。

表5 4種四環(huán)素類抗生素加標濃度和RSD值表

3 結(jié)論

本文采用除脂固相萃取小柱Captiva EMR-Lipid結(jié)合LC-MS/MS在國標方法的基礎上進行優(yōu)化改進，4類抗生素的檢出限均小于國標檢出限，此方法前處理時間短，配合高靈敏度檢測器，可在較短時間實現(xiàn)對樣品的處理及測定，對測定新鮮動物源性食品中獸藥殘留量有一定實際應用意義。